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Methodenartikel

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

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DOI:

10.3791/60267

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12. Februar 2020

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1Department of Development and Rehabilitation of Motor Function, Human Health Sciences, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 2Department of Motor Function Analysis, Human Health Sciences, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 3Department of Otolaryngology, The Ohio State University Wexner Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir führen eine kinematische Analysemethode ein, die ein dreidimensionales Bewegungserfassungsgerät mit vier Kameras und Datenverarbeitungssoftware für die Durchführung funktionaler Auswertungen während der Grundlagenforschung mit Nagetiermodellen verwendet.

Zusammenfassung

Im Vergleich zum Sciatic Functional Index (SFI) ist die kinematische Analyse eine zuverlässigere und empfindlichere Methode zur Durchführung funktioneller Auswertungen von Ischiasnervenverletzungs-Nagetiermodellen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine neuartige kinematische Analysemethode, die ein dreidimensionales (3D) Bewegungserfassungsgerät für funktionelle Auswertungen mit einem Ratten-Ischias-Nervenzerkleinerungs-Verletzungsmodell verwendet. Zunächst wird die Ratte mit dem Laufbandlaufen vertraut gemacht. Markierungen werden dann an den ausgewiesenen Knochenlandmarken befestigt und die Ratte wird gemacht, um auf dem Laufband mit der gewünschten Geschwindigkeit zu gehen. Inzwischen werden die hinteren Gliedmaßenbewegungen der Ratte mit vier Kameras aufgezeichnet. Je nach verwendeter Software werden Markerverfolgungen sowohl im automatischen als auch im manuellen Modus erstellt und die gewünschten Daten nach subtilen Anpassungen erstellt. Diese Methode der kinematischen Analyse, bei der ein 3D-Bewegungserfassungsgerät verwendet wird, bietet zahlreiche Vorteile, darunter überlegene Präzision und Genauigkeit. Viele weitere Parameter können im Rahmen der umfassenden Funktionsauswertungen untersucht werden. Diese Methode weist mehrere Mängel auf, die berücksichtigt werden müssen: Das System ist teuer, kann kompliziert zu bedienen sein und kann zu Datenabweichungen aufgrund von Hautverschiebungen führen. Dennoch ist die kinematische Analyse mit einem 3D-Bewegungsaufnahmegerät nützlich für die Durchführung funktioneller vorderer und hinterer Gliedmaßenauswertungen. In Zukunft könnte diese Methode immer nützlicher werden, um genaue Bewertungen verschiedener Traumata und Krankheiten zu erstellen.

Einleitung

Der Sciatic Functional Index (SFI) ist die Benchmark-Methode zur Durchführung funktioneller Ischiasnervbewertungen1. Das SFI ist weit verbreitet und wird häufig in verschiedenen funktionellen Evaluierungsstudien über Rattenischias-Nervenverletzungen2,3,4,5,6verwendet. Trotz seiner Popularität, gibt es mehrere Probleme mit SFI, einschließlich Automutilation7, gemeinsames Kontraktierungsrisiko, und Schmierung der Fußabdrücke8. Diese Probleme beeinträchtigen ernsthaft seinen prognostischen Wert9. Daher ist eine alternative, weniger fehleranfällige Methode als Ersatz für das SFI erforderlich.

Eine solche alternative Methode ist die kinematische Analyse. Dazu gehört eine umfassende Ganganalyse mit Tracking-Markern, die an knöchernen Landmarken oder Gelenken befestigt sind. Kinematische Analysen werden zunehmend für funktionelle Auswertungeneingesetzt 9. Diese Methode wird nach und nach als zuverlässiges und sensibles Instrument für die funktionelle Bewertung10 anerkannt, ohne dass die dem SFI11,12zugeschriebenen Mängel nicht berücksichtigt werden.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Reihe von kinematischen Analysen, die ein 3D-Bewegungsaufnahmegerät verwenden, das aus einem Laufband, vier 120 Hz geladenen gekoppelten Geräte (CCD) Kameras und Datenverarbeitungssoftware besteht (siehe Tabelle der Materialien). Diese kinematische Analysemethode unterscheidet sich von der allgemeinen Video-Walking- oder Ganganalyse13,14. Zwei Kameras sind in verschiedene Richtungen positioniert, um hintere Gliedmaßenbewegungen von einer Seite aufzuzeichnen. Anschließend wird ein digitales 3D-Modell der hinteren Gliedmaße mit Computergrafik9erstellt. Wir können bestimmte Gelenkwinkel wie Hüfte, Knie, Knöchel und Zehengelenk berechnen, indem wir die tatsächlichen Gliedmaßenmaße genau rekapitulieren. Zusätzlich können wir verschiedene Parameter wie Schritt-/Schrittlänge und das Verhältnis der Haltungsphase zur Schwingphase bestimmen. Diese Rekonstruktionen basieren auf einem vollständig rekonstruierten 3D-Digitalmodell der hinteren Gliedmaßen, das aus Daten generiert wird, die von zwei Kamerasätzen übertragen werden. Auch die imaginäre Schwerpunktbahn (CoG) kann automatisch berechnet werden.

Wir haben dieses 3D-Bewegungserfassungsgerät verwendet, um mehrere kinematische Parameter einzuführen und zu bewerten, die funktionelle Veränderungen im Laufe der Zeit im Kontext des Ratten-Ischias-Nervenzerkleinerungsmodells offenbaren.

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Protokoll

Das Protokoll wurde vom Tierversuchsausschuss der Universität Kyoto genehmigt, und alle Protokollschritte wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Tierversuchskomitees der Universität Kyoto (Zulassungsnummer: MedKyo17029) durchgeführt.

1. Kennenlernen von Ratten mit Laufbandgehen

  1. Richten Sie zwei transparente Kunststoffplatten auf beiden Seiten des Laufbandes ein, damit eine 12 Wochen alte männliche Lewis-Ratte in gerader, nach vorne gerichteter Richtung laufen kann und dann das Elektrische Stoßgitter einschaltet.
  2. Lassen Sie jede Ratte auf dem Laufband laufen. Beschleunigen Sie das Laufband nach und nach auf die gewünschte Geschwindigkeit (20 cm/s oder 12 m/min) und lassen Sie die Ratte mit dieser Geschwindigkeit 5 min normal laufen. Nach jeder Gehzeit, bieten eine 1-2 min Pause. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3x pro Tag, 5 Tage pro Woche, für 1 Woche.
    HINWEIS: Starten Sie das Laufband 1 Woche vor Schritt 2.
  3. Hausratten in Dreiergruppen pro Käfig mit einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus und füttern sie kommerzielle Rattenfutter und Leitungswasser ad libitum.

2. Durchführung der Ischias-Nervenzerkleinerungsverletzung

  1. Die Ratte in eine Anästhesie-Induktionskammer geben und 5% Isofluran-Inhalationslösung einführen.
  2. Bereitstellung einer intraperitonealen Injektion eines Kombinationsanästhetikums, das mit 0,15 mg/kg Medetomidinhydrochlorid, 2 mg/kg Midazolam und 2,5 mg/kg Butorphanoltartrat an die Ratte hergestellt wird. Prüfen Sie, ob keine Pedalreflexe mehr zur Zeit sind. Dann rasieren Sie einen Bereich von der linken größeren Trochanter bis zum Mittelschenkl mit einem elektrischen Rasierer.
  3. Verteilen Sie ein Stück aseptisches Tuch, legen Sie die Ratte darauf und lassen Sie es in der linken seitlichen Position liegen. Legen Sie auch sterile chirurgische Instrumente auf das Tuch.
  4. Erstellen Sie einen geraden Schnitt vom größeren Trochanter bis zum Mittelschenkl mit einer chirurgischen Nr. 10 Klinge. Dann führen Sie eine stumpfe Sezierung zwischen Quadriceps femoris und Bizeps femoris mit einem chirurgischen Hämostat, um den Ischiasnerv zu belichten.
  5. Lösen Sie den Ischiasnerv mit zwei Paaren Mikrozangen aus dem umgebenden Gewebe und zerquetschen Sie den Ischiasnerv 10 s mit einem Standard-Chirurgischen Hämostat, um eine 2 mm lange Zerkleinerungsverletzung an der Stelle direkt unterhalb der Gesäßrohrrosität zu verursachen.
  6. Führen Sie einen 9-0 Nylon-Epineuralstich am proximalen Ende der Verletzung mit einem Paar Mikrozangen durch und schließen Sie dann den Muskel und die Haut mit 4-0 Nylonnähten.
  7. Geben Sie der Ratte eine intraperitoneale Injektion eines anästhetischen Antagonisten an, der mit 0,3 mg/kg Atipamezolhydrochlorid hergestellt wird, um ihn innerhalb von 10 min aufzuwecken. Nachdem sich die Ratte von der Anästhesie erholt hat, beobachten Sie die bewegungen der linken Zehen, während die Ratte von der Basis ihres Schwanzes aufgehängt wird. Wenn sich der Zehen überhaupt nicht ausbreitet, war die Operation erfolgreich.
  8. Die Ratten nach der Operation einzeln mit einem 12 h hell-dunklen Zyklus zu beherbergen und sie kommerziell Rattenfutter und Leitungswasser ad libitum zu füttern.

3. Anbringen der Marker

  1. Legen Sie die ausgebildete Ratte in eine Anästhesie-Induktionskammer und führen Sie eine 5% Isofluran-Inhalationslösung ein. Überprüfen Sie das Fehlen des Pedalreflexes, indem Sie den Zehen kneifen.
  2. Lassen Sie die Ratte kontinuierlich mit einer Anästhesiemaske anästhesieren (2% Isofluran-Inhalationslösung). Während die Ratte eine stabile Anästhesie erhält, rasieren Sie einen Bereich vom unteren Rücken zu den bilateralen Malleoli mit einem elektrischen Rasierer.
    VORSICHT: Um zu verhindern, dass Forscher dem undichten Isofluran ausgesetzt werden, stellen Sie sicher, dass die Maske den Kopf und das Gesicht der Ratte fest bedeckt.
    HINWEIS: Um Verletzungen der Ratte zu vermeiden, rasieren Sie das Haar so sanft wie möglich ab.
  3. Platzieren Sie die Ratte in der anfälligen Position. Verwenden Sie einen schwarzen Marker-Stift, um die folgenden Knochen-Landmarken auf der rasierten Haut zu markieren: Eine Linie durch die spinnförmigen Prozesse von der Lendenwirbelsäule bis zu den sakralen Wirbeln, die vorderen überlegenen Iliasdorne, die größeren Trochanter, die Kniegelenke, die seitlichen Malleoli, die fünfte metatarsophalangealen Gelenken und der Spitze des vierten Zehens.
    HINWEIS: Die Linie durch die spinösen Prozesse wird verwendet, um zu bestimmen, ob die bilateralen Marker axial symmetrisch sind.
  4. Verwenden Sie einen flüssigen Klebstoff, um hemisphärische Marker an diesen Knochen-Landmarken zu befestigen, mit Ausnahme der Linie durch die spinösen Prozesse von der Lendenwirbelsäule bis zum Sakralwirbel und der Spitze des vierten Zehe. Verwenden Sie unterschiedliche Farben für jedes andere Wahrzeichen, um Verwechslungen zu vermeiden. Die Spitze des vierten Zehens ist mit rosa Tinte markiert.
    VORSICHT: Achten Sie darauf, klebern nicht auf die exponierte Haut des Bedieners zu tropfen.
  5. Nachdem Sie alle Markierungen platziert haben, legen Sie die Ratte wieder in den Käfig. Legen Sie die Ratte nicht auf das Laufband, bis sie sich vollständig von der Anästhesie erholt.
    HINWEIS: Ein eingeschränktes Bewusstsein kann das normale Gehen ernsthaft beeinflussen, wenn sich die Ratte nicht vollständig von der Anästhesie erholt.

4. Kalibrierung und Software-Setup

  1. Richten Sie zwei transparente Kunststoffplatten auf beiden Seiten des Laufbandes ein und legen Sie die Kalibrierbox in die Mitte des Laufbandes. Öffnen Sie die Aufnahmesoftware und klicken Sie dann auf das Symbol Kalibrierbild auf dem Display (Zusatzdatei 1).
  2. Klicken Sie auf das Aufnahmesymbol, um 1 bis 2 s Video aus vier Richtungen mit 120 Hz CCD-Kameras aufzuzeichnen. Klicken Sie erneut auf das Aufnahmesymbol, um die Aufnahme zu beenden.
    HINWEIS: Das Video wird automatisch gespeichert, sobald die Aufnahme beendet wird.
  3. Öffnen Sie die Videodatei in der Berechnungssoftware. Klicken und ziehen Sie die charakteristischen Punkte der Kalibrierbox 3D-Modelle in der unteren rechten Ecke des Bildschirms auf die entsprechenden Marker auf den vier Bildern, die automatisch aus dem Video im Kalibriermuster transformiert werden (Ergänzende Datei 2). Klicken Sie dann auf das Symbol Speichern.
    HINWEIS: Ändern Sie die Positionen der Kameras nach Abschluss der Kalibrierung nicht.

5. Aufzeichnung des Gehens

  1. Nehmen Sie die Kalibrierbox aus dem Laufband, schalten Sie das Stromschlaggitter ein und legen Sie die vollwache Ratte auf das Laufband. Öffnen Sie die Aufnahmesoftware, und geben Sie die grundlegenden Informationen über die Ratte ein, einschließlich der Seriennummer, der Gehgeschwindigkeit und des Namens des Hauptoperators.
  2. Schalten Sie das Laufband ein und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 20 cm/s ein. Nachdem sich die Ratte an die Geschwindigkeit anpasst und normal laufen kann, klicken Sie auf das Aufnahmesymbol auf dem Display, um die Wanderratte mit den vier Kameras aufzunehmen. Sobald genügend Schritte aufgezeichnet sind (>10), klicken Sie erneut auf das Symbol, um die Aufnahme zu beenden, und schalten Sie das Laufband aus.
    HINWEIS: Das Video wird automatisch gespeichert, sobald die Aufnahme beendet wird.
  3. Die Ratte zur Anästhesisierung wieder in die Anästhesie-Induktionskammer geben. Während die Ratte unter kontinuierlicher Anästhesie (verabreicht über die Anästhesiemaske) ist, entfernen Sie die hemisphärischen Marker.
    HINWEIS: Entfernen Sie die Marker so sanft wie möglich, um Schmerzen bei der Ratte zu vermeiden.
  4. Zum angegebenen Zeitpunkt (z. B. 1 Woche, 3 Wochen oder 6 Wochen nach der Operation) führen Sie die kinematische Messung an der Ratte durch Wiederholung der Schritte 3.1–5.3 durch. Machen Sie die kinematische Messung nur einmal, zu Beginn des Experiments, für die Ratten, die nicht operiert wurden (d. h. die Kontrollgruppe).

6. Marker-Ablaufverfolgung

  1. Öffnen Sie die Berechnungssoftware, und öffnen Sie die Videodatei auf der Schnittstelle.
  2. Klicken und ziehen Sie die bilaterale Steuerleiste auf der Fortschrittsleiste des Videos, um sicherzustellen, dass nur ein 10-stufiger Laufband-Wanderdatensatz angezeigt wird (Zusatzdatei 3). Klicken und ziehen Sie jeden Merkmalspunkt vom 3D-Modell in der unteren rechten Ecke des Bildschirms auf die entsprechende Markierung auf jedem der vier anfangs Bilder der Videos, die von den Kameras aufgenommen wurden (Zusatzdatei 4).
  3. Klicken Sie auf das Symbol Automatische Ablaufverfolgung, um den automatischen Markerverfolgungsprozess zu starten (Ergänzende Datei 5, Ergänzende Datei 6). Wenn das System einen Marker nicht genau verfolgt, klicken Sie auf das Symbol Manuell digitalisieren, um zum manuellen Ablaufverfolgungsmodus (Zusatzdatei 7) zu wechseln, klicken Sie auf den Tracing-Merkmalspunkt im 3D-Modell und dann auf die antwortende Markierung im Bild.
  4. Sobald auf die Markierung geklickt wurde, stellen Sie sicher, dass das Bild zum nächsten Bild des Videos wechselt. Klicken Sie nun kontinuierlich auf den Marker, bis die Markierungsverfolgung abgeschlossen ist. Sobald Sie fertig sind, klicken Sie auf das Symbol Speichern.

7. Kinematische Analyse

  1. Öffnen Sie die Analysesoftware, und öffnen Sie dann die verarbeitete Videodatei auf der Schnittstelle.
  2. Klicken Sie auf das Einstellungssymbol und wählen Sie bestimmte Parameter wie Knöchelwinkel, Zehenwinkel und Beckenverschiebung (X- und Z-Achse) zur Anzeigeliste im Pop-up-Fenster auf der rechten Seite(Zusatzdatei 8) aus und fügen Sie sie hinzu. Klicken Sie auf OK, damit Kurven, die die Wertänderungen in den Parametern darstellen, auf der Schnittstelle angezeigt werden.
  3. Klicken Sie auf das Symbol Messung und wählen Sie Im Pulldown-Menü die Option Glatte Verarbeitung aus. Geben Sie 20 Hz in das Pop-up-Fenster ein, um Frequenzen größer als 20 Hz innerhalb der Kurven zu entfernen (Zusatzdatei 9).
  4. Stellen Sie sicher, dass es fünf Panels auf der Schnittstelle gibt: das Walking-Video der Ratte, das dynamische 3D-Modell, Kurven, die Wertänderungen in den Parametern aus dem 10-Stufen-Zyklus darstellen, Kurven, die Mittelwertänderungen in Parametern darstellen, und Histogramme und Schemadiagramme, die das Verhältnis von Haltungs- und Schwingphase darstellen (Zusatzdatei 10).
  5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bedienfeld für Kurven, die Mittelwertänderungen in Parametern darstellen, und wählen Sie Datenausgabe im Pulldown-Menü (Ergänzende Datei 11). Dadurch ergeben sich die Durchschnittswerte der hinteren Gliedmaßengelenkwinkel, einschließlich der Knöchel- und Zehenwinkel, der Beckenverschiebung und aller anderen gewünschten Parameter in 10-stufigen Zyklusperioden.

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Ergebnisse

Wir wählten vier Parameter aus, um funktionelle Veränderungen im Laufe der Zeit in einem Ratten-Ischias-Nervenzerkleinerungs-Verletzungsmodell zu untersuchen. Dies waren das Verhältnis der Haltung-zu-Schwenk-Phase, des Schwerpunkts (CoG), der Knöchelwinkel und der Zehenwinkel in der "Zehen-aus"-Phase9. 24 Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip einer von vier Gruppen zugeordnet: der Kontrollgruppe (C), Ratten an der ersten (1w), dritten (3w) und sechsten (6w) Woche nach einer Verletzung des ischitis...

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Diskussion

In diesem Protokoll ist eine stabile und kontinuierlich gehende Ratte der wichtigste Bestandteil der kinematischen Analyse. Die Laufbandgeschwindigkeit wurde auf 20 cm/s eingestellt. Diese Gehgeschwindigkeit gilt keineswegs als "hoch", wenn sich Ratten ohne Platzbeschränkungen bewegen16. Dennoch ist diese Geschwindigkeit für ungeübte Ratten zu schnell, um auf dem Laufband stabil zu laufen und würde wahrscheinlich zu einem ungewöhnlichen Gang und ungleichmäßigen Bewegungen führen. Diese Ereignisse ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Studie wurde von JSPS KAKENHI Grant Number JP19K19793, JP18H03129 und JP18K19739 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
9-0 Nylon-NahtBear Medic Corporation.T06A09N20-25
Anästhesiegerät für KleintiereSHINANO MFG CO., LTD.SN-487-0T
ISOFLURAN InhalationslösungPfizer Japan Inc.(01)14987114133400
Kine AnalyzerKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.Eine Analysesoftware
Flüssiger KlebstoffKANBO PRAS CORPORATIONPT-B180
MikrozangeBRC CO.
Motion RecorderKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.Eine Aufnahmesoftware
Standard-Hämostatik für chirurgische HämostatikFine Science Tools, Inc.12501-13
Chirurgische Klinge Nr. 10FEATHER Safety Razor CO., LTD100D
Chirurgischer HämostatWorld Precision Instruments503740
Dreidimensionales Bewegungserfassungsgerät (KinemaTracer für Tiere)KISSEI COMTEC CO., LTD.N.A.Ein 3D-Bewegungsanalysesystem, das aus Kameras besteht
Dreidimensionaler (3D) TaschenrechnerKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.Eine Software zur Markierungsverfolgung
LaufbandMUROMACHI KIKAI CO., LTDMK-685ein Laufband mit elektrischem Schocker, transparenten Hüllen und einem Geschwindigkeitskontrollgerät
16171080

Referenzen

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