Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt eine modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode vor, die eine Entkalkung und Verwendung eines Zell- und Gewebeklebers erfordert, um die Stücke der Cochlea-Epithel an 10 mm runden Abdeckungsscheinen für die Immunhistochemie bei erwachsenen Mauscochleae zu haften.

Zusammenfassung

Die auditive Verarbeitung in der Cochlea hängt von der Integrität der mechanosensorischen Haarzellen ab. Im Laufe eines Lebens kann Hörverlust aus zahlreichen Ätiologien wie der Exposition gegenüber übermäßigem Lärm, der Verwendung von ototoxischen Medikamenten, bakteriellen oder viralen Ohrinfektionen, Kopfverletzungen und dem Alterungsprozess erworben werden. Der Verlust sensorischer Haarzellen ist ein häufiges pathologisches Merkmal der Varianten des erworbenen Hörverlusts. Zusätzlich kann die innere Haarzellsynapse durch leichte Beleidigungen beschädigt werden. Daher sind Oberflächenpräparate von Cochlea-Epithelien in Kombination mit Immunetikettierungstechniken und konfokalen Bildern ein sehr nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Cochlea-Pathologien, einschließlich des Verlustes von Bandsynapsen und sensorischen Haarzellen, Veränderungen des Proteinspiegels in Haarzellen und unterstützenden Zellen, die Regeneration der Haarzellen und die Bestimmung der Berichtsgenexpression (d. h. GFP) zur Überprüfung der erfolgreichen Transduktion und Identifizierung von transduzierten Zelltypen. Die Cochlea, eine knöcherne spiralförmige Struktur im Innenohr, hält das auditive Sinnes-Endorgan, das Organ von Corti (OC). Sensorische Haarzellen und umgebende Stützzellen im OC sind im Cochlea-Kanal enthalten und ruhen auf der Basilarmembran, die tonotopisch mit hochfrequenter Detektion in der Basis und niederfrequenter Inderin im Scheitelpunkt organisiert ist. Mit der Verfügbarkeit molekularer und genetischer Informationen und der Fähigkeit, Gene durch Knockout- und Knock-in-Techniken zu manipulieren, wurden Mäuse in der biologischen Forschung weit verbreitet, auch in der Hörwissenschaft. Die erwachsene Mauscochlea ist jedoch winzig, und das Cochlea-Epithel ist in einem knöchernen Labyrinth eingekapselt, was die Mikrodissektion erschwert. Obwohl In vielen Laboratorien Seziertechniken entwickelt und eingesetzt wurden, ist diese modifizierte Mikrodissektionsmethode mit Zell- und Gewebeklebstoff einfacher und bequemer. Es kann in allen Arten von erwachsenen Maus Cochleae nach Entkalkung verwendet werden.

Einleitung

Die Cochlea ist der Erkennung von Klang gewidmet und für das Hören verantwortlich. Der Cochlea-Kanal ist spiralförmig im knöchernen Labyrinth gewickelt und hält das auditive Sinnes-Endorgan, das Organ von Corti (OC). Das OC ruht auf der Basilarmembran, die das Cochlea-Epithel mit einer Länge von etwa 5,7 mm besteht, wenn es bei erwachsenen CBA/CaJ-Mäusen^1,2abgewickelt wird. Da das OC tonotopisch mit hohen Frequenzen in der Basis und niedrigen Frequenzen in der Spitze detektiert ist, wird das Cochlea-Epithel oft in drei Teile für analytische Vergleiche unterteilt: die apikalen, mittleren und basalen Drehungen, ....

Protokoll

Alle Forschungsprotokolle, an denen männliche erwachsene CBA/J-Mäuse im Alter von 10–12 Wochen und C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen beteiligt waren, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Medical University of South Carolina (MUSC) genehmigt. Die Tierpflege stand unter der Aufsicht der Abteilung Labortierressourcen am MUSC.

HINWEIS: Für die nachstehend dargestellten Verfahren werden Mäuse durch intraperitoneale Injektionen mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anbeet. Mäuse werden enthauptet, nachdem das Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize wie eine Zehenzange reagiert.

Ergebnisse

Oberflächenpräparate des Cochlea-Epithels in Kombination mit Immunolabeling und konfokaler Bildgebung wurden in der Hörwissenschaft zur Untersuchung von Cochlea-Pathologien, wie z. B. Quantifizierung von Bandsynapsen, sensorischen Haarzellen, und Proteinexpression in sensorischen Haarzellen^5,6,7,8. Obwohl die Zerlegung der erwachsenen Mauscochleae für Oberflächenpräparate nicht einfach ist, kön.......

Diskussion

Die Cochlea-Mikrodissektion von Flächenpräparaten mit ganzer Montage in Kombination mit Derimmunolabeling stellt ein grundlegendes Werkzeug zur Untersuchung von Innenohrpathologien und molekularen Mechanismen bereit. Diese modifizierte Cochlea-Sektionsmethode für Erwachsene mit zell- und Gewebeklebstoff vereinfacht dieses schwierige Verfahren.

Obwohl diese modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode relativ einfach und zugänglich ist, erfordert sie dennoch Praxis, um Fähigkeiten zu er.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 mm Rund Deckgläser	Mikroskopieprodukte für Wissenschaft und Industrie	260367
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG2	Thermo Fisher Scientific	A-21131
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Maus IgG1	Thermo Fisher Scientific	A-21125
Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A11012
Mikro-Objektträgerschalen aus Karton	Fisher Scientific	12-587-10
Cell-Tak	BD Biosciences	354240
Corning Petrischalen	Fisher Scientific	353004
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
Dumont #5 Pinzetten	FST fine science tools	11251-20
EDTA Dinatriumsalz	Sigma-Aldrich	E5134
Fluorgel mit Tris-Puffer	Elektronenmikroskopie Sciences	17985-10
Vier-Well-Zellkulturschalen	Greiner Bio-One	627170
Ziege Anti-Myosin VIIa Antikörper	Proteus Biosciences	25-6790
Objektträger	Fisher Scientific	12-544-7
Maus Anti-CtBP2 Antikörper	BD Biosciences	#612044
Maus Anti-Glu2R Antikörper	Millipore	MAB397
Normales Ziegenserum	Thermo Fisher Scientific	31872
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	441244
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Fisher Scientific	BP665-1
Skalpell	VWR	100491-038
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Vannas Federschere	Fine Science Tools	15001-08