Methodenartikel

Etablierung und Charakterisierung von kleinen Darm Neuroendokrinen Tumor Sphäriden

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DOI:

10.3791/60303

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14. Oktober 2019

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1Department of Surgery, University of Iowa Carver College of Medicine, 2High Throughput Screening Facility, University of Iowa Carver College of Medicine, 3Department of Pathology, University of Iowa Carver College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Neuroendokrine Tumoren (NETs) stammen aus neuroendokrinen Zellen des Neuralkamms. Sie sind langsam wachsend und herausfordernd für die Kultur. Wir präsentieren eine alternative Strategie, um NETs aus dem kleinen Darm zu züchten, indem wir sie als Sphäroide kultivieren. Diese Sphäroide haben kleine Darm-NET-Marker und können für Drogentests verwendet werden.

Zusammenfassung

Kleine neuroendokrine Tumoren (SBNETs) sind seltene Krebsarten, die aus Enterochromaffinzellen des Darms stammen. Die Forschung auf diesem Gebiet war begrenzt, da nur sehr wenige von Patienten abgeleitete SBNET-Zelllinien erzeugt wurden. Gut differenzierte SBNET-Zellen wachsen langsam und sind schwer zu vermehren. Die wenigen Zellenlinien, die festgelegt wurden, sind nicht ohne weiteres verfügbar, und nach der Zeit in der Kultur können die Eigenschaften von NET-Zellen nicht mehr zum Ausdruck kommen. Die Erzeugung neuer Zelllinien könnte viele Jahre dauern, da SBNET-Zellen eine lange Verdoppelungszeit haben und viele Anreicherungsschritte erforderlich sind, um die sich schnell trennenden krebsassoziierten Fibroblasten zu beseitigen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ein Protokoll entwickelt, um SBNET-Zellen aus chirurgisch entfernten Tumoren als Sphäroide in extrazellulärer Matrix (ECM) zu kultiieren. Das ECM bildet eine dreidimensionale Matrix, die SBNET-Zellen kapselt und die Tumor-Mikroumgebung imitiert, um SBNET-Zellen wachsen zu lassen. Hier charakterisierten wir die Wachstumsrate von SBNET Sphäroiden und beschriebene Methoden zur Identifizierung von SBNET-Markern mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Immunhistochemie, um zu bestätigen, dass es sich bei den Sphäroiden um neuroendokrine Tumorzellen handelt. Darüber hinaus verwendeten wir SBNET Sphäroide zur Prüfung der Zytotoxizität von Rapamycin.

Einleitung

Kleine neuroendokrine Tumoren (SBNETs) stammen aus Enterochromaffinzellen des Dünndarms. Obwohl SBNETs allgemein dafür bekannt sind, langsam zu wachsen, metastasieren sie häufig zur Leber1. Während die chirurgische Entfernung oder Tumorablation in vielen Fällen in Betracht gezogen werden kann, ist das Wiederauftreten fast universell, und daher spielt die medizinische Therapie eine wichtige Rolle im Management. Es wurden enorme Anstrengungen unternommen, um neue SBNET-Zelllinien für Arzneimitteltests zu generieren. Es gab jedoch nur sehr wenig Erfolg. Es wurdennur6 SBNET-Zelllinien (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) gemeldet 2,3,4,5; und leider drückt eine Zelllinie nicht mehr die NET-Marker6 aus und drei weitere SBNET-Zelllinien (KRJ-I, L-STS, H-STS) wurden bestimmt, aus transformierten Lymphoblasten anstelle von NETs7abgeleitet zu werden. Um die Identifizierung von Arzneimitteln für SBNETs zu beschleunigen, sind alternative Methoden für In-vitro-Arzneimitteltests erforderlich.

Hier nutzen wir die Verfügbarkeit von resezierten SBNETs und haben einen Weg etabliert, diese patientenabgeleiteten SBNETs als Sphäroide zu kultitonischen, die in ECM wachsen. Das übergeordnete Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Kultur von SBNET als dreidimensionale (3D) Kultur und Umrissverfahren zu beschreiben, um diese Sphäroide zur Beibehaltung von SBNET-Markern durch Immunfluoreszenzfärbung und Immunhistochemie zu charakterisieren.

Darüber hinaus zeigen wir, wie diese SBNET Sphäroide verwendet werden können, um die Wirkung von Rapamycin, einem Krebsmedikament für NETs8,zu testen. Der Grund für dieses Protokoll ist die Entwicklung einer neuen Methode, um SBNET-Zellen in vitro zu züchten und für Arzneimitteltests zu verwenden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber der traditionellen Methode zur Festlegung einer SBNET-Zelllinie besteht darin, dass 3D-Kulturen von SBNETs schnell gewonnen werden können und Arzneimitteltests innerhalb von 3 Wochen durchgeführt werden können. SBNET Sphäroide könnten möglicherweise als Modell für die Durchführung von In-vitro-Medikamentenscreens verwendet werden, um neue Medikamente für SBNET-Patienten zu identifizieren. Da SBNET-Zelllinien nicht weit verbreitet sind, können 3D-Kulturen von SBNET-Sphäroiden als neues In-vitro-Modell für die Untersuchung von SBNETs dienen und unter Wissenschaftlern auf diesem Gebiet geteilt werden.

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Protokoll

Alle Experimente mit menschlichen neuroendokrinen Tumorproben wurden vom IRB-Ausschuss der University of Iowa Hospital and Clinics (Protokollnummer 199911057) genehmigt. Eine Liste aller Materialien und Ausrüstungen ist in der Tabelle der Materialienbeschrieben. Eine Liste der Wachstumsmedien und Schlüssellösungen finden Sie in Tabelle 1.

1. Dünndarm neuroendokrinen Tumor (SBNET) Sammlung und Zelldissoziation

  1. Erhalten Sie resektierte SBNET-Proben nach der Bestätigung von Tumorgewebe n. Chr. vom Chirurgischen Pathologiekern.
  2. SBNETs in 5 mm Würfel schneiden und in 25 ml DMEM/F12-Medium in einem konischen Rohr für den Transport ins Labor lagern.
  3. Übertragen Sie die Tumoren in DMEM, die 1% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep), 1% Glutamin (Wash Medium) enthalten und in diesem Waschmedium für 15 min inkubieren.
  4. Übertragen Sie Tumore auf eine neue Schale und Mince-Tumoren auf weniger als 1 mm Stücke mit sterilen gebogenen Scheren.
  5. Übertragen Sie das Hackfleisch in ein neues 50 ml Rohr mit 25 ml Waschmedium.
  6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 x g für 15 min bei 4 °C.
  7. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Pellets in 10 ml Waschmedium mit Kollagennase (100 U/ml) und DNase (0,1 mg/ml) wieder aus.
  8. Lassen Sie die Verdauung der gehackten Tumoren in einem 37 °C-Inkubator mit langsamem Schütteln (50 Rpm) für 1,5 h auftreten.

2. Kultur von SBNETs als Tumorsphäride im ECM

  1. Nach Abschluss der Verdauung (Schritt 1.8), Zentrifuge bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, den Überstand entsorgen und das Pellet in 15 ml Waschmedium wieder aufhängen.
  2. Legen Sie ein 70 m Zellsieb auf ein neues 50 ml-Rohr und übertragen Sie 10 ml des Waschmediums über das Zellsieb. Wirbeln Sie das Waschmedium, um die Seite des Kunststoffrohres zu bedecken, um zu verhindern, dass NET-Zellen an der Seite des Kunststoffrohres kleben.
  3. Filtern Sie die Zellsuspension durch Dasbsie.
  4. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet in 200 l Waschmedium (Gesamtvolumen beträgt 250 l) wieder auf und legen Sie es auf Eis.
  5. Übertragen Sie 5 l zellenauf 500 l Waschmedium (1/100 Verdünnungsfaktor). Verwenden Sie die verdünnten Zellen für die Zellzählung mit einem Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu erhalten. Multiplizieren Sie mit 100, um den Verdünnungsfaktor zu korrigieren.
  6. Multiplizieren Sie die Anzahl der Zellen pro ml, die in Schritt 2,5 erhalten wurden, mit dem Gesamtvolumen der Zellen in Suspension, die in Schritt 2,4 (ca. 250 l) erhalten wurden.
  7. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in flüssigem ECM (1 x 106 Zellen/ml) wieder auf und halten Sie auf Eis.
  8. Übertragen Sie 5-20 L SBNET Sphäroide in ECM auf eine 96-Well-Platte und lassen Sie das flüssige ECM erstarren, indem Sie die Platte für 5 min in einen 37 °C-Inkubator legen.
  9. Fügen Sie 200 L SBNET-Kulturmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamin + 10 mM Nicotinamid + 10 g/ml Insulin) zu jeder Bohrung der 96-Well-Platte hinzu, die die SBNET-Sphäroide in ECM enthält.
  10. Alternativ, Kultur SBNET Organoide in Stammzellenmedien ähnlich dem, was zuvor für den Anbau von menschlichen Leber oder Bauchspeicheldrüsenorganoide9 beschrieben und in der Tabelle der Materialienaufgeführt .
  11. Wechseln Sie alle 5-7 Tage die Medien.

3. Quantifizierung der SBNET Sphäroidgröße mit ImageJ

  1. Machen Sie 5-10 Bilder von SBNET Sphäroiden an Tag 1, 4, 7, 14, 23 und 97 der Kultur mit einem 10x Objektiv.
  2. Öffnen Sie gespeicherte Bilder in ImageJ. Wechseln Sie zur Registerkarte Analysieren, wählen Sie die Option Messungen festlegen aus, und aktivieren Sie die Option Bereich.
  3. Verwenden Sie das ovale Auswahlwerkzeug aus der Werkzeugleiste, um ein Ellipsoid oder einen Kreis um ein gut fokussiertes Sphäroid zu generieren.
  4. Wechseln Sie zur Registerkarte Analysieren, und wählen Sie die Option Messen aus. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5, um eine Flächenmessung von 25-50 SBNET Sphäroiden zu erhalten. Die Werte werden in Pixelquadrat bereitgestellt.
  5. Konvertieren Sie den Pixelbereich in m2, indem Sie die Größe jedes Pixels mit der Länge jedes Pixels in den Konvertierungsfaktor der Mikroskopiebilder dividieren.
    HINWEIS: SBNET-Zellen wachsen hauptsächlich als Sphäroide und irgendwann als Ellipsoide.

4. Charakterisierung von SBNETS Sphäroiden durch Immunfluoreszenz

  1. Übertragen Sie die in ECM angebauten Organoide mit einer P1000 Pipette auf ein 1,5 ml-Rohr.
  2. Zentrifuge bei 1.500 x g für 1 min und entfernen Sie den Überstand.
  3. Waschen Sie die Organoidkultur, indem Sie 1 ml PBS hinzufügen, mischen, Zentrifuge bei 1.500 x g für 1 min und entfernen Sie den Überstand.
  4. Fixieren Sie die Organoide, indem Sie 500 l 4% Paraformaldehyd hinzufügen und 15 min inkubieren.
  5. Waschen Sie die Kultur zweimal mit 1 ml PBS.
  6. Permeabilisieren Sie die Kultur, indem Sie 500 l PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 für 5 min hinzufügen.
  7. Dann dreimal mit 1 ml PBS + 3% BSA waschen.
  8. Inkubieren Sie für 1 h mit primären Antikörpern gegen Synaptophysin (SYP)10 bei 1/600 Verdünnung oder Chromogranin A (CgA)11 und Somatostatinrezeptor 2 (SSTR2)12 bei 1/400 Verdünnung im Antikörperpuffer (2,5% Rinderserumalbumin, 0,1% Natrium Azid, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid).
    HINWEIS: Verwenden Sie 300 L oder mehr Antikörperlösung pro Tube.
  9. Dreimal mit 1 ml PBS + 3% BSA waschen.
  10. Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern, die bei 1/500 Verdünnung im Antikörperpuffer für 1 h an FITC gekoppelt sind. Verwenden Sie 300 l oder mehr Antikörperlösung pro Tube.
  11. Waschen Sie 3 mal mit 1 ml PBS + 3% BSA. Achten Sie darauf, alle Überstand zu aspirieren und zu verwerfen.
  12. Fügen Sie 5 l Desonstmedium mit dem Kernfleck DAPI hinzu.
  13. Verwenden Sie eine P20-Pipette, um 5 l der SBNET Sphäroide von Schritt 4.12 auf einen Glasschlitten zu übertragen und mit einem Deckelschlupf abzudichten.
  14. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den 10x, 20x oder 40x Objektiven auf.

5. SBNET Sphäroide Charakterisierung durch Immunhistochemie (IHC)

  1. Übertragen Sie SBNET Sphäroide von der Kulturplatte auf ein 1,5 ml Rohr mit einer P1000 Pipette.
  2. Zentrifuge bei 1.500 x g für 1 min und entfernen Sie den Überstand.
  3. Fix SBNET Spheroide durch Zugabe von 500 l von 10% Formalin in das Rohr von Schritt 5.2 und inkubieren bei Raumtemperatur für 2-5 Tage vor Paraffin einbetten und schneiden 4 'm dicke Sphäroidabschnitte.
  4. Deparaffinieren, rehydrieren und verwenden Sie wärmeinduzierte Epitop-Retrieval in Antigen Retrieval Solution bei pH 9 durch Erhitzen auf 97 °C für 20 min mit der 3-in-1 automatisierten Diaverarbeitungsstation, um Dias für die Antikörperinkubation vorzubereiten.
  5. Blockrutschen und Inkubation mit primären Antikörpern gegen SYP10 bei einer Verdünnung von 1/100 für 15 min, CgA11 bei einer Verdünnung von 1/800 für 15 min und SSTR212 bei einer Verdünnung von 1/5.000 für 30 min.
  6. Inkubieren Sie mit dem sekundären Antikörper-Erkennungssystem für 15 min für die Anti-SYP- und CgA-Färbung und 30 min für Anti-SSTR2-Färbung. Nehmen Sie Bilder mit einem 400x Objektiv auf.

6. Behandlung von SBNET-Organoiden mit Rapamycin

  1. Lösen Sie Rapamycin in DMSO auf, um eine 10 mM Stofflösung zu erhalten.
  2. Bereiten Sie SBNET Kulturmedium mit DMSO (z.B. 1 ml SBNET Kulturmedium + 1 l DMSO) und SBNET Kulturmedium mit 10 M Rapamycin (z. B. 1 ml SBNET Kulturmedium + 1 l von 10 ml Rapamycin-Stammlösung) vor.
  3. Übertragen Sie 200 L-Medien mit SBNET-Kulturmedium mit DMSO oder 10 M Rapamycin in SBNET-Sphäroidkulturen.
  4. SBNET-Sphäroide 5 Tage lang im 37 °C-Inkubator inkubieren.
  5. Fügen Sie 1 M Ethidium-Homodimer hinzu und brüten Sie 30 min. Entfernen Sie das Medium, das Ethidium-Homodimer enthält, waschen Sie es mit 200 L PBS und übertragen Sie 200 L PBS auf jeden Brunnen.
  6. Nehmen Sie Mikroskopiebilder von SBNET Sphäroiden mit und ohne medikamentöse Behandlung mit dem roten Filterwürfel mit den 10x, 20x oder 40x Objektiven eines Fluoreszenzmikroskops.
    HINWEIS: Tote Zellen, die mit Ethidium homodimer gefärbt sind, erscheinen rot mit dem roten Filterwürfel G eines handelsüblichen Mikroskops (Tabelle der Materialien). Alternativ kann das Signal mit einem Spektralphotometer bei 535 nm Anregung und 624 nm Emission erfasst werden.

7. Aufteilen von SBNET Sphäroiden

HINWEIS: Dies geschieht für die Erweiterung und für den Austausch mit anderen Forschern.

  1. Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um das ECM mechanisch zu brechen und das ECM mit SBNET Sphäroiden in ein steriles 1,5 ml-Rohr zu saugen.
  2. Zentrifuge bei 1.000 x g bei 4 °C, entfernen Sie alle Überstand und legen Sie die Röhre auf Eis.
  3. Fügen Sie 2-4x das Volumen des neuen ECM in das Pellet. Mischen Sie das neue ECM mit den alten ECM- und SBNET-Sphäroiden, indem Sie 10x nach oben und unten pfeifen. Vermeidung von Luftblasen.
  4. Übertragen Sie 5-20 l des ECM- und SBNET-Sphäroid-Gemischs auf eine neue Platte und ermöglichen Sie eCM eine Erstarrung.
  5. Abdeckung mit neuem SBNET Medium und Transfer zum Inkubator. Die Wiedereinziehungsrate beträgt etwa 95 bis 100%.
  6. Für den Versand von SBNET Sphäroiden in ein anderes Labor, übertragen Sie SBNET Sphäroide mit neuem ECM auf einen T25-Kolben und lassen Sie ECM festigen.
  7. Füllen Sie den T25-Kolben mit SBNET Sphäroid-Medium, schrauben Sie die Kappe fest, und bereiten Sie das Versandpaket vor.
  8. Entfernen Sie nach dem Empfang einer SBNET-Sphäroidkultur das Kulturmedium, und führen Sie Schritt 7.1 bis 7.5 aus, um SBNET-Sphäroide wieder in die Kultur zurückzubringen.

8. Kryospeicher und Wiederherstellung von SBNET Sphäroiden

  1. Übertragen Sie SBNET Sphäroide von 5-10 kleinen Brunnen auf ein 15 ml Rohr. Zentrifuge bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, Überstand entfernen, im Gefriermedium (90% FBS + 10% DMSO) wieder aufsetzen, in einem Zellgefrierbehälter lagern und bei -80 °C platzieren.
  2. Transfer in den flüssigen Stickstoff für längere Lagerung.
  3. Um SBNET Spheroide wiederherzustellen, legen Sie die gefrorene Durchstechflasche auf Eis und warten Sie, bis der Inhalt vollständig aufgetaut ist. Invertieren Sie die Röhre und legen Sie sie wieder auf Eis, um den Auftauvorgang zu beschleunigen.
  4. Sobald die Probe aufgetaut ist, in eine vorgekühlte Zentrifuge geben und 10 min bei 1.000 x g drehen.
  5. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Sphäroide im ECM wieder auf. Halten Sie die Röhre auf Eis, übertragen Sie 20 L auf eine neue Platte und warten Sie, bis das ECM erstarrt.
  6. Übertragen Sie 200 l SBNET-Kulturmedium mit 10 M ROCK-Inhibitor (Y-27632)13 und übertragen Sie sie in den Inkubator.
  7. Lassen Sie SBNET Spheroide erholen und wachsen für 1 Woche. Entfernen Sie das alte Kulturmedium, füllen Sie es mit 200 L SBNET-Kulturmedium auf und kehren Sie zum Inkubator zurück.
  8. Lassen Sie SBNET Spheroide weiter wachsen.
    HINWEIS: Es dauert mindestens 1 Woche, bis sich schnell wachsende Sphäroide nach der Kryokonservierung zu erholen beginnen13. SBNET Sphäroide brauchen mindestens 2-4 Wochen, um mit dem Wachstum zu beginnen. Viele SBNET-Zellen sterben innerhalb der ersten 2 Wochen und die Überlebensrate liegt unter 10%. Da dies ein sehr zeitaufwändiger und ertragsarmer Prozess ist, ist es besser, mit anderen Forschern SBNET Sphäroide in Kulturkolben zu teilen (wie in Schritt 7 beschrieben). Kryostorage und Wiederherstellung sollten nur im Falle einer bakteriellen Kontamination als Backup-Plan verwendet werden.

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Ergebnisse

Es gibt derzeit nur 2 SBNET Zelllinien etabliert und veröffentlicht2,3,4,5 und sie sind nicht leicht verfügbar für viele Forscher. Hier schlagen wir vor, SBNET als Sphäroide im ECM zu kultitoben und dies als alternatives Modell zur Untersuchung der SBNET-Arzneimittelempfindlichkeit zu verwenden. Patienten-abgeleiteter Tumor aus einem SBNET, der zur Leber metastasiert wurde, verdaut wurde, um SB...

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Diskussion

Tumor-3D-Kulturen sind zu einer wertvollen Ressource für präklinische Arzneimitteltests geworden15. Verschiedene Tumororganoid-Biobanken wurden vor kurzem aus Brustkrebs und Prostatakrebs Tumoren16,17etabliert. In dieser Studie bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur SBNET als Sphäroide und eine einfache und schnelle Methode, um die Sphäroidkulturen für NET-Marker durch Immunfluoreszenz zu validieren und die Wirkstoffempfindlichk...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch NIH-Stipendien P50 CA174521 (an J.R. Howe und A.M. Bellizzi) unterstützt. P.H. Ear ist Träger des P50 CA174521 Career Enhancement Program Award.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-Kaninchen FITCJackson ImmunoResearch11-095-152Sekundäre Antikörperkopplung an ein grünes Fluorophor
Antigen Retrieval SolutionAgilent DakoS2367Lösung bei pH 9 zur Vorbereitung von Objektträgern für den IHC
Autostainer Link 48Agilent DakoNicht verfügbarAutomatisiertes System für die Antikörperfärbung
Behälter zum Einfrieren von ZellenThermo Scientific5100-0001Behälter zum Einfrieren von Zellen
CellSenceOlympusVersion 1.18Computersoftware zur Verwendung des Fluoreszenzmikroskops
Chromogranin A AntikörperAbcam-45179RB-9003-POAntikörper für IF
Chromogranin A Antikörper (Klon LK2H10)Thermo ScientificMA5-13096Antikörper für IHC
KollagenaseSigmaC0130Enzym zur Verdauung von Tumorgewebe
DMEMGibco11965-092Medium zur Gewebevorbereitung
DMEM/F12Gibco11320-033Medium für Organoidkulturen
DMSOSigmaD8418Lösungsmittel zum Auflösen von
Wirkstoff DNAseSigmaDN25Enzym zur Verdauung von Tumorgewebe
Ethidium HomodimerChemodexCDX-E0012-T1EDNA- und RNA-Bindungsfarbstoff
FBSGibco16000044Reagenz für Nährmedien
FluoreszenzmikroskopOlympusCKX35Mikroskop zum Fotografieren von SBENT-Sphäroiden
GlutaminGibcoA2916801Reagenz für Nährmedien
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.51Computersoftware für Bilder Analyse
InsulinSigmaI0516Reagenz für Nährmedien
MatrigelCorning356235Matrix zur Einbettung und Verankerung von Organoiden
Einbettmedium (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1200Fixiermittel für markierte Zellen mit einer Kernfärbung
NicotinamidSigma72340Reagenz für Nährmedien
ParaformaldehydElektronenmikroskopie Sciences15710Reagenz zur Fixierung von Zellen
PEN/STREPGibco15140-122Reagenz für Nährmedien
PT LinkAgilent DakoNicht verfügbarAutomatisiertes System zur Vorbereitung von Objektträgern für die IHC-Färbung
RapamycinAlfa AesarJ62473Medikament, das das NET-Wachstum hemmen kann
Sekundärantikörper für IHCAgilent DakoK8000Sekundärantikörper für IHC unter Verwendung des polymerbasierten EnVision FLEX Systems
SSTR2 AntikörperGeneScritpA01591Antikörper für IF
SSTR2 Antikörper (Klon UMB1)Abcamab134152Antikörper für IHC
Synaptophysin AntikörperAbcam32127Antikörper für IF
Synaptophysin Antikörper (Klon DAK-SYNAP)Agilent DakoM7315Antikörper gegen IHC
TritonXMallinckrodt3555 KBGEReagenz zur Permeablizierung von Zellen
Y-2763 ROCK-InhibitorAdipogenAG-CR1-3564-M005zur Verbesserung der Lebensfähigkeit von SBNET-Sphäroiden nach dem Auftauen durch Frost

Referenzen

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