Summary
Il carcinoma a cellule renali a cellule chiare metastatiche è una malattia senza un modello animale completo per un'indagine preclinica approfondita. Questo protocollo illustra due nuovi modelli animali per la malattia: il modello di topo ortotopicamente impiantato e il modello a membrana corioallantoica del pollo, che dimostrano entrambe metastasi polmonari simili a casi clinici.
Abstract
Il carcinoma a cellule renali a cellule chiare metastatiche (ccRCC) è il sottotipo più comune di cancro renale. CcRCC localizzato ha un esito chirurgico favorevole. Tuttavia, un terzo dei pazienti ccRCC svilupperà metastasi al polmone, che è legato a un esito molto negativo per i pazienti. Sfortunatamente, nessuna terapia è disponibile per questa fase mortale, perché il meccanismo molecolare della metastasi rimane sconosciuto. È noto da 25 anni che la perdita di funzione del gene soppressore del tumore von Hippel-Lindau (VHL) è patognomonica di ccRCC. Tuttavia, non è stato generato alcun modello di topo transgenico clinicamente rilevante di ccRCC. Lo scopo di questo protocollo è quello di introdurre e confrontare due modelli animali di nuova costituzione per il ccRCC metastatico. Il primo è l'impianto renale nel modello murino. Nel nostro laboratorio, il sistema di editing del gene CRISPR è stato utilizzato per eliminare il gene VHL in diverse linee cellulari RCC. L'impianto ortotopico di popolazioni di ccRCC eterogenee nella capsula renale ha creato nuovi modelli di ccRCC che sviluppano robuste metastasi polmonari in topi immunocompetenti. Il secondo modello è il sistema a membrana corioallantoica di pollo (CAM). Rispetto al modello di mouse, questo modello è più tempo, lavoro ed efficiente in termini di costi. Questo modello supportava anche la formazione robusta del tumore e l'intravasation. A causa del breve periodo di 10 giorni di crescita del tumore nella CAM, nessuna metastasi overt è stata osservata dall'immunohistochimica (IHC) nei tessuti embrionali raccolti. Tuttavia, quando la crescita del tumore è stata estesa di due settimane nel pollo tratteggiato, le lesioni micrometastatiche ccRCC sono state osservate dall'IHC nei polmoni. Questi due nuovi modelli preclinici saranno utili per studiare ulteriormente il meccanismo molecolare alla base della metastasi, nonché per stabilire nuovi xenografi (PDX) derivati dal paziente verso lo sviluppo di nuovi trattamenti per il ccRCC metastatico.
Introduction
Il carcinoma a cellule renali (RCC) è il7esimo cancro più comune negli Stati Uniti. Ogni anno, 74.000 americani sono stimati essere di nuova diagnosi, che rappresentano più di 14.000 morti (sottotipo istologico a cellule chiare, o ccRCC, è il sottotipo più comune, che rappresenta circa l'80% dei casi di RCC. I pazienti con malignità localizzata sono trattati con nefrectomia e hanno un tasso di sopravvivenza a 5 anni favorevole del 73%1. Tuttavia, 25%-30% dei pazienti sviluppano metastasi distanti ad organi vitali come i polmoni, con conseguente una scarsa sopravvivenza media di 13 mesi e 5 anni tasso di sopravvivenza di solo 11%1,2,3. È necessaria un'ulteriore comprensione del meccanismo metastatico per migliorare l'esito mortale per il ccRCC metastatico.
La perdita del gene del soppressore del tumore VHL è una lesione genetica distintiva osservata nella maggior parte dei casi umani di ccRCC4,5,6,7. Tuttavia, il meccanismo oncogenico preciso della perdita di VHL nel ccRCC è sconosciuto. Inoltre, lo stato dell'espressione VHL non è predittivo del risultato in ccRCC8. In particolare, nonostante i numerosi tentativi di abbattimento della VHL mirata arene,gli scienziati non sono riusciti a generare anomalie renali oltre le lesioni cistiche preneoplastiche osservate nei topi 9 , anche se combinate con la delezione di altri soppressori tumorali come PTEN e p5310. Questi risultati supportano l'idea che la perdita di VHL da sola è insufficiente per la tumorigenesi o la successiva metastasi spontanea.
Recentemente, il nostro laboratorio ha creato una nuova linea cellulare vHL (VHL-KO) utilizzando CRISPR/Cas9 ha mediato la delezione del gene VHL nella linea cellulare murine VHL ccRCC (RENCA, o VHL-WT)11,12. Abbiamo dimostrato che VHL-KO non è solo mesenchymal, ma promuove anche la transizione epiteliale a mesenchymica (EMT) delle cellule VHL-WT12. EMT è noto per svolgere un ruolo importante nel processo metastatico13. Il nostro lavoro ha inoltre dimostrato che la metastasi polmonare distante si verifica solo con la co-impianto di cellule VHL-KO e VHL-WT nel rene, sostenendo un meccanismo cooperativo di metastasi. È importante sottolineare che il nostro modello VHL-KO e VHL-WT impiantato ortotopicamente porta a robuste metastasi polmonari, ricapitolando i casi clinici di ccRCC. Questo modello di ccRCC metastatico spontaneo compensa la mancanza di un modello murino metastatico transgenico, specialmente nello sviluppo di nuovi farmaci anti-metastasi. Questo protocollo dimostra l'impianto di capsule renali delle popolazioni cellulari eterogenee di cellule RENCA genetiche.
I modelli di pollo CAM hanno una lunga storia nella ricerca per l'angiogenesi e la biologia tumorale a causa dei loro numerosi vantaggi, come riassunto nella Tabella 114,15,16,17,18. In breve, la finestra temporale per la crescita del tumore della CAM è breve, consentendo un massimo di 11 giorni fino a quando il CAM viene distrutto al momento della schiusa del pollo16. Nonostante il breve tempo di crescita, l'apporto nutritivo ricco e lo stato immunodeficiente dell'embrione di pollo consentono un innesto tumorale molto efficiente16,19,20,21. Infine, il costo di ogni uovo fecondato è di 1 dollaro, rispetto a oltre 100 dollari per un topo SCID. Insieme, il modello CAM può servire come un prezioso modello animale alternativo per stabilire nuove PDX con un grande risparmio di tempo e di costi rispetto al mouse. In questo protocollo, abbiamo valutato se il modello era in grado di ricapitolare la biologia del ccRCC metastatico osservato nel modello ortotopico del topo.
| (SCID) Mouse | Cam | Nota | |
| Costo | > 100 dollari ciascuno | 1 DOLLARO ciascuno | Viabilità che vanno dal 50 al 75% |
| Necessità di alloggiamenti per barriere | Sì | No | Riduce ulteriormente i costi e semplifica il monitoraggio seriale dei tumori |
| Tumore direttamente visibile | No | Sì | Figura 3A |
| Tempo per la prima innesto (RENCA) | 2 settimane | 2-4 giorni | rifm 14, 15 |
| Endpoint di crescita (RENCA) | 3-6 settimane | 10 giorni | rifm 14, 15 |
| Metastasi (RENCA) osservata | Sì | Sì nei pulcini | Figura 3D |
| Passaggi seriali | Sì | Sì | ref 16-18 |
| Passaggio ai topi (RENCA) | Sì | Sì | Hu, J., et al. in esame (2019) |
| Mantenere l'eterogeneità tumorale | Sì | Sì | Hu, J., et al. in esame (2019) |
Tabella 1: Vantaggi e limitazioni dei modelli mouse e CAM. Questa tabella confronta i due modelli per i loro vantaggi e limitazioni in termini di tempo richiesto, costo, manodopera, così come la biologia. Il modello CAM ha vantaggi in termini di efficienza, ma ha anche i suoi limiti unici a causa della diversa morfologia tra uccelli e mammiferi. Pertanto, è importante confermare che il modello può mantenere la biologia degli xenografi.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), designato come Comitato di Ricerca Animale del Cancelliere UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 e ARC 2017-102-01A). Il protocollo 2002-049-53 è ottimizzato per l'impianto di cellule tumorali ccRCC nella capsula renale di topi Nude o BALB/c. Gli esperimenti di impianto tumorale in uova di gallina fecondate prima della schiusa non richiedono l'approvazione di IACUC. Per prolungare il tempo per la creazione di metastasi polmonari, gli embrioni con tumore DELLA CAM sono autorizzati a schiudersi e crescere in polli. Il protocollo 2017-102-01A copre questi esperimenti sugli animali.
1. Studi ortotopici sul tumore nei topi
NOTA: la sequenza temporale per questo esperimento è illustrata nella Figura 1A. Queste procedure sono state adattate dalle pubblicazioni precedenti11,12.
- Preparazione della sospensione a singola cella per l'innesto
- Staccare le cellule RENCA VHL-WT e VHL-KO dai piatti di coltura utilizzando trypsin/EDTA.
- Contare le cellule con un emocitometro e risospendere in una miscela preraffreddata 1:1 di PBS e soluzione di matrice extracellulare ad una concentrazione di 1 x 105 cellule/ .
NOTA: Utilizzare un rapporto 1:4 delle cellule VHL-WT:VHL-KO per impianti eterogenei e VHL-WT da soli per impianti omogenei. - Trasferire le cellule risospese in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e tenerle su ghiaccio fino all'impianto.
- Impianto in capsula renale
- Anestesia: Preriscaldare un cuscinetto caldo a 37 gradi centigradi e coprirlo con un pezzo di drappeggio sterile spesso. Anestesizzare il topo per inalazione isoflurane tramite una camera di induzione o iniezione intraperitoneale (IP) di sodio pentobarbital 1% al dosaggio di 10 mL/kg.
- Rasare i capelli dal sito chirurgico. Questo passaggio può essere saltato per topi nudi.
- Disinfezione e drappeggio chirurgico: Disinfettare completamente la parte posteriore del topo con povidone-iodino 3x seguito da 70% etanolo 1x e pulirlo asciutto con tamponi di cotone sterile. Quindi applicare tre medicazioni mediche sterili in sequenza, coprendo il tutto indietro al fine di creare un campo chirurgico e per immobilizzare il topo.
- Incisione e esternalizzazione renale: Prima dell'operazione, disinfettare le dita dell'operatore con povidone-iodine o utilizzare un paio di guanti sterili. Posizionare il mouse in posizione prona e utilizzare le dita per individuare il rene sinistro destra sotto il fianco sinistro. Utilizzare un paio di pinze e forbici smussate per tagliare la pelle aperta e lo strato muscolare sotto la posizione specificata. Utilizzare tamponi sterili di cotone e pinze per esternare parzialmente il rene sinistro fuori dall'addome.
- Impianto delle cellule tumorali: Caricare la sospensione cellulare preparata nel passaggio 1.1 in siringhe di insulina o siringhe Hamilton personalizzate (vedere Tabella dei materiali per le specifiche). Iniettare 20 - di cellule risospese sotto la capsula renale.
NOTA: L'iniezione riuscita è determinata dalla formazione di un rigonfiamento traslucido sulla superficie del rene. L'iniezione accidentale nel parenchyma renale provoca sanguinamento e un tasso di mortalità post-operatorio fino al 90% a causa di emorragia fatale nel sito di iniezione. - Estrarre lentamente l'ago per consentire alla soluzione a matrice extracellulare di solidificare e prevenire emorragie o perdite di cellule tumorali. Quindi, usando un tampone sterile di cotone, spingere il rene di nuovo nell'addome.
- Cuciture della ferita: utilizzare una sutura VICTRYL rivestita 5-0 per cucire lo strato muscolare. Disinfettare la pelle con povidone-iodio una volta e chiudere la pelle con autoclip della ferita.
- Recupero: Posizionare il mouse sul pad caldo fino a quando non si sveglia. Se il topo è stato anetizzato per inalazione, ritirare l'isoflurane e tenere il mouse sul pad caldo fino a quando non è sveglio.
- Bioluminescenza imaging (BLI) e raccolta di tessuti
- Sei settimane dopo l'impianto del tumore, prendi le immagini BLI basate sulla lucciola-luciferasi. Poi eutanasia topi con inalazione di isoflurane seguita da lussazione cervicale.
- Raccogliere il sangue per il rilevamento delle cellule tumorali circolanti (CTC) per citometria di flusso.
- Raccogliere tumore e organi di interesse (reni, polmoni, fegato, intestino, e milza) utilizzando una tecnica di raccolta dei tessuti sterili22. Fissarli in 4% paraformaldeide durante la notte per l'incorporamento di cera di paraffina.
2. Modello di xenotrapianto tumorale CAM
NOTA: queste procedure sono state adattate e modificate dai protocolli pubblicati in precedenza23,24. La sequenza temporale per questa procedura è illustrata nella Figura 1B. Questo articolo presenta solo il protocollo semplificato. Per protocolli dettagliati, si prega di fare riferimento a un altro articolo JoVE pubblicato dal nostro gruppo25.
- Preincubazione: Incubare uova di gallina appena deposta e fecondate in un'incubatrice rotante di ovuli a 37 gradi centigradi e 55-65% di umidità per 7 giorni.
- Rilasciare il CAM e aprire la finestra (giorno di sviluppo 7):
- Individuare e contrassegnare il sacco d'aria e le vene.
NOTA: Di solito il 10-15% delle uova viene rimosso perché non sono fecondati o muoiono entro 7 giorni dalla fecondazione. - Creare un nuovo sacco d'aria sopra una vena marcata.
- Delineare il nuovo sacco d'aria, applicare il nastro di imballaggio, e rimettere le uova per l'incubatrice.
NOTA: la procedura può essere sospesa qui. Si consiglia di riprendere le procedure entro lo stesso giorno perché il sacco d'aria può muoversi. - Aprire una finestra: utilizzando un paio di forbici microcondici curve e un paio di pinze a ago-naso, tagliare una finestra circolare di 1,5 x 1,5 cm nel guscio.
NOTA: L'interruzione della CAM è indicata dal sangue e da un pezzo di CAM presente sul pezzo del guscio tagliato. - Sigillare il foro con una medicazione medica trasparente e posizionare le uova in un'incubatrice stazionaria a 37 gradi centigradi e 55%-65% di umidità.
NOTA: Utilizzare la stessa incubatrice di uova del punto 2.1. Spegnere il rotatore per renderlo fermo.
- Individuare e contrassegnare il sacco d'aria e le vene.
- Controllo dello stato (giorno di sviluppo 9): Rimuovere le uova morte e quindi raggruppare casualmente il resto delle uova per l'impianto delle cellule tumorali.
NOTA: Idealmente, il tasso di sopravvivenza a questo punto è di circa l'80% del giorno di sviluppo 0. - Innesto delle cellule tumorali sulla CAM appena esposta (giorno dello sviluppo 10)
- Diluire la soluzione a matrice extracellulare nel doppio del volume di RPMI 1640 preraffreddato (con L-glutamine). Staccare le cellule RENCA e risospendere nella soluzione di cui sopra per raggiungere una concentrazione di 2 x 104 cellule/ .
NOTA: Utilizzare un rapporto 1:1 delle cellule VHL-WT:VHL-KO per impianti eterogenei e VHL-WT da soli per l'impianto omogeneo. - Per presolidificare la sospensione cellulare, riempire 100 lof ciascuno di ogni miscela cellulare in 200 punte di pipetta e metterle in un'incubatrice cellulare per 15 minuti.
- Impianto 100 L di sospensione cellulare per ogni uovo sulla superficie CAM attraverso la finestra.
NOTA: Alcuni protocolli richiedono il graffio del CAM prima dell'impianto23. Questo non è necessario per le cellule RENCA, perché crescono molto rapidamente.
- Diluire la soluzione a matrice extracellulare nel doppio del volume di RPMI 1640 preraffreddato (con L-glutamine). Staccare le cellule RENCA e risospendere nella soluzione di cui sopra per raggiungere una concentrazione di 2 x 104 cellule/ .
- Coltiva le cellule sul CAM per 10 giorni e fotografa ogni 2 giorni.
- Eutanasia e raccogliere il tumore, il sangue e gli organi.
- Il giorno dello sviluppo 20 (giorno del tumore 10), raccogliere il sangue attraverso la vena corioallantoica con una siringa eparinizzata 10 mL.
- Eutanasia gli embrioni mettendoli sul ghiaccio per 15 min.
- Raccogliere e pesare i tumori. Disintocimi di polmoni e fegati utilizzando una tecnica di raccolta dei tessuti sterili simile a quella utilizzata per i topi22.
NOTA: I fegati di pollo hanno due lobi, che sono i primi organi osservati nella cavità addominale. Non confonderli con i polmoni. I polmoni di pollo si trovano sotto il cuore e il setto26. La corretta raccolta dei polmoni può essere confermata dalle costole esposte. - Fissare i tumori e gli organi sezionati in 4% paraformaldeide durante la notte per l'incorporamento di cera di paraffina.
- Cova i polli.
- Per consentire un lungo periodo di crescita del tumore, continuare l'incubazione fino al giorno 21 e lasciare che i polli si schiudano a 37 gradi centigradi e almeno 60% di umidità.
NOTA: I polli si schiudono naturalmente dopo il giorno 21 per un periodo di tempo di 24 ore, ma occasionalmente hanno difficoltà a schiudersi da soli. In questo caso, rompere i gusci d'uovo alcuni aiuta. È importante che i polli completino il processo di schiusa entro 24 ore perché moriranno per mancanza di nutrienti dopo di allora. - Coltivare i polli in un impianto per animali (2017-102-01A) per 2 settimane.
- Il giorno dello sviluppo 34 (giorno del tumore 24), eutanasia i pulcini con inalazione isoflurana seguita da lussazione cervicale.
- Dissezionare i polmoni utilizzando una tecnica di raccolta dei tessuti sterili simile a quelli utilizzati per i topi22. Quindi, fissarli in 4% paraformaldeide durante la notte per l'incorporamento di cera paraffina.
- Per consentire un lungo periodo di crescita del tumore, continuare l'incubazione fino al giorno 21 e lasciare che i polli si schiudano a 37 gradi centigradi e almeno 60% di umidità.
3. Immunoistochimica
NOTA: tutte le sezionazioni e le colorazioni H&E sono state eseguite dal Translational Pathology Core Laboratory (TPCL) dell'Università della California, Los Angeles.
- Cuocere i vetrini a 65 gradi centigradi per 20 min e deparaffinare 3 volte con xilene e reidratare in serie dal 100% di etanolo all'acqua.
- Recuperare gli antigeni in un tampone di citrati bollito in un piroscafo vegetale per 25 min.
- Applicare 1% BSA per il blocco. Quindi applicare gli anticorpi primari (anti-VHL, anti-HA, anti-bandiera) preparati con un rapporto di diluizione 1:200 in PBS. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
- Dopo aver lavato 3x con TBST (7 min ciascuno), incubare i vetrini con l'anticorpo secondario a 1:200 didiluizione. Lavare 3x con TBST (7 min ciascuno) e applicare reagenti DAB seguiti da controtendenza dell'ematossino.
4. Citometria di flusso
- Elaborare il buffer di lisi di topo o di pollo con i globuli rossi (RBC) in base al protocollo del produttore.
NOTA: Una lisi RBC sufficiente è particolarmente importante quando si analizza il sangue CAM perché gli RBC di pollo sono nucleati e non possono essere facilmente distinti nella citometria di flusso utilizzando la dispersione in avanti e laterale. - Eseguire citometria di flusso sul lisaritmo di sangue e analizzare i dati per mStrawberry ed EGFP espressione.
- Impostare i cancelli primari in base alla dispersione in avanti e laterale escludendo detriti, cellule morte e RBC non a limeggiate.
- Impostare i cancelli di fluorescenza in base ai campioni incontaminati e ai singoli controlli macchiati. Utilizzare il lisigio di sangue innescato con VHL-WT, VHL-KO, o cellule RENCA senza etichetta come i singoli controlli macchiati e controlli non statuati, rispettivamente.
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Representative Results
Ogni esperimento è stato eseguito almeno 3 volte, salvo diversa indicazione. I dati sono presentati come media : deviazione standard (SD). Il significato è stato determinato da un abbinato, test T di Student quando c'erano due gruppi o da un ANOVA di sola andata quando c'erano tre o più gruppi. Per stabilire il significato è stato utilizzato un taglio a valore p pari a 0,05.
Le cellule RENCA impiantate ortotopicamente sono cresciute con successo sui reni dei topi, come confermato dalla colorazione BLI e H&E (Figura 2A-B). Anche se non c'era differenza nella crescita primaria, solo il tumore eterogeneo e metastatico aveva una robusta metastasi al polmone, come indicato dal segnale BLI molto forte e dai noduli metastatici nella colorazione H&E. D'altra parte, i tumori omogenei e non metastatici non metastatizzavano a organi distanti. I conteggi CTC erano più alti nei topi con tumori metastatici rispetto a quelli con tumori non metastatici (Figura 2C-D).
Nella concordanza con il modello murino, il sistema CAM ha mantenuto con successo la crescita e il comportamento metastatico dei tumori RENCA. Mentre non c'era differenza di crescita tra tumori metastatici e non metastatici, i conteggi CTC erano significativamente più alti nelle uova con tumori metastatici rispetto a quelli con controparti non metastatiche (Figura 3A-C). La schiusa delle uova con tumori della CAM e la possibilità per i pulcini di crescere di altre due settimane hanno prolungato il periodo per le cellule tumorali metastatiche per stabilire metastasi istologicamente rilevabili nel polmone dei pulcini, come mostrato nella macchia H&E e HA delle sezioni del tessuto polmonare di pollo (Figura 3D). La maggior parte dei noduli metastatici consisteva in cellule VHL-WT con etichettatura HA, mentre la VHL-KO con tag flag erano raramente viste, come abbiamo osservato nei topi.
Figura 1: Panoramica dei due modelli animali per xenogratti di ccRCC metastatici. (A) Rappresentazione schematica del modello ortotopico del mouse. I topi di 3 o 4 settimane sono impiantati ortotopicamente con tumori non metastatici o metastatici. Sei settimane dopo l'impianto, la crescita del tumore e la metastasi sono state visualizzate con BLI. Poi, tumore, sangue, e organi sono stati raccolti per le analisi a valle. (B) Rappresentazione schematica del modello CAM che illustra i seguenti passaggi: Preincubazione, apertura della finestra, impianto cellulare ed eutanasia prima o dopo la schiusa. Le stesse analisi del modello di topo vengono condotte per i campioni raccolti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Crescita del tumore e metastasi nei topi impiantati ortotopicamente. (A) BLI di topi e organi estratti (rene, polmone, fegato, intestino e milza) 6 settimane dopo l'impianto ortotopico delle cellule RENCA. Sinistra: non metastatica (non soddisfatta), destra: metastatica. (B) Vista lorda e crescente ingrandimento della colorazione H&E per il rene e il polmone (20x e 100x). Sinistra: non metastatica (non soddisfatta), destra: metastatica. (C) Analisi di flusso rappresentativa per il rilevamento delle cellule mStraw e EGFP che circolano nel sangue. (D) Grafico percentuale della popolazione delle cellule mStraw e EGFP. Non-met: non metastatico. Il pannello A è stato adattato da Hu etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Crescita del tumore e metastasi nel modello CAM. (A) Tumori RENCA coltivati in CAM. Ci sono state 7 ripetizioni per ogni gruppo. Non-met: non metastatico. (B) Analisi di flusso rappresentativa per il rilevamento delle cellule mStraw e EGFP che circolano nel sangue. (C) Grafico della popolazione delle cellule circolanti mStraw e EGFP. < 0,01. (D) Colorazione IHC del polmone da un pulcino di 2 settimane che portava un tumore metastatico durante la sua fase embrionale. Da sinistra, le sezioni mostrano H&E, HA e colorazione bandiera. : arteria polmonare di pollo; freccia: noduli metastatici. Questa cifra è stata adattata da Hu J et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per molti pazienti con malignità epiteliale, la metastasi agli organi vitali è la causa primaria della mortalità. Pertanto, è essenziale trovare il meccanismo sottostante e una nuova via di terapia per la malattia metastatica. Purtroppo, mancano modelli animali metastatici ccRCC. La sfida in gran parte è dovuta all'incapacità di ricreare ccRCC nei topi nonostante la generazione di numerosi modelli di topo da knockout VHL mirati a i reni transgenici9,10. Qui, dimostriamo i metodi per stabilire un tumore al ccRCC metastatico impiantabile in due sistemi animali, il topo e il POLLO CAM. Questi risultati hanno convalidato il comportamento metastatico dei tumori in due ambienti disparati, e quindi forniscono opportunità uniche per studiare ulteriormente il meccanismo molecolare delle metastasi. Nel primo modello, la popolazione renCA eterogenea è stata impiantata ai topi immunocompetenti ortotopicamente nella loro capsula renale. Dopo 6 settimane, questi topi hanno mostrato metastasi polmonare dilagante. Nella concordanza con il modello murino, l'impianto di cellule RENCA eterogenee sulla CAM è cresciuto con successo e intravasato nel sangue degli embrioni del pulcino. Estendendo il periodo di crescita del tumore a 2 settimane dopo la schiusa, sono state osservate metastasi polmonari simili a quelle osservate nel topo nei pulcini.
Per entrambi i modelli, un'attenta attenzione ai dettagli tecnici di ogni fase e pratica per migliorare le competenze tecniche sono essenziali per aumentare la sopravvivenza degli animali e l'innesto tumorale di successo e la metastasi. Per il modello murino, un'attenta scelta dell'attrezzatura e l'iniezione accurata delle cellule tumorali alla capsula renale massimizza il tasso di successo diminuendo la mortalità post-operatoria e aumentando la possibilità per il tumore di ottenere un adeguato apporto di sangue per crescere e Metastasi. Il modello CAM richiede una maggiore ottimizzazione nella configurazione e nella tecnica. Nei nostri studi, la vitalità dell'embrione era inferiore al 30% all'inizio. È importante mantenere sempre la temperatura e l'umidità al livello desiderato, avendo buone attrezzature, monitoraggio frequente e il completamento più rapido delle procedure. Anche dopo l'ottimizzazione, la sopravvivenza varia dal 50-75% a seconda dello sperimentatore e del singolo lotto di uova. Si consiglia di ordinare sempre uova extra per il backup. Nella nostra esperienza, padroneggiare le tecniche CAM richiede più di 1 anno. Abbassare la membrana CAM e aprire la finestra è il passo critico in cui si verificano più spesso danni accidentali e fatali all'embrione. La vitalità dell'embrione del pulcino può essere migliorata prevenendo danni alla CAM.
Ci sono diverse limitazioni al modello tumorale della CAM. In primo luogo è l'applicabilità del modello a tutti i tipi di cellule tumorali. Abbiamo avuto un tasso di successo del 100% engrafting diverse linee cellulari tumorali stabiliti su CAM, tra cui le linee cellulari renali, vescica, e le cellule del tumore della prostata (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) e linee cellulari del cancro ovarico (ID8 e SKOV3). Due ulteriori studi del nostro gruppo forniscono ulteriori informazioni su questi tumori della CAM25,27. Tuttavia, la crescita di alcune cellule tumorali ovariche sulla CAM è migliorata dal completamento del fattore di crescita o cellule associate al tumore25. L'ottimizzazione del numero di cella o del fattore di crescita essenziale per ogni riga o tipo di cella è importante. Incorporiamo anche geni di reporter o marcatori, come luciferasi, tag proteici (ad esempio, HA o bandiera), o tag di fluorescenza (ad esempio, mStrawberry o EGFP), per facilitare il monitoraggio della crescita e della metastasi del tumore negli animali25,27. Sulla base della nostra esperienza, una grande maggioranza delle linee cellulari del cancro proliferanti può essere stabilita sulla CAM. Una limitazione chiave all'innesto potrebbe essere la breve finestra di 10 giorni consentita per la crescita del tumore, che potrebbe essere particolarmente difficile per una linea cellulare a crescita lenta per stabilire una massa sufficiente in un lasso di tempo così breve.
Un altro difetto del modello CAM è la differenza di fisiologia tra l'embrione aviario e i mammiferi. La metastasi dal tumore della CAM ai principali organi come il fegato o i polmoni dell'embrione è stata rilevata prevalentemente da tecniche PCR sensibili28. Il breve periodo di crescita della CAM sarebbe insufficiente per stabilire grandi lesioni metastatiche che possono essere verificate mediante analisi istologiche. Inoltre, la perfusione vascolare ridotta del polmone embrionale non gonfiato non è favorevole per stabilire o sostenere la crescita delle metastasi polmonari. Per superare questi limiti, è stata ottenuta un'approvazione da parte del nostro comitato istituzionale per l'uso degli animali (IACUC) per schiudere i polli dagli embrioni che portano il tumore della CAM e ospitarli altre 2 settimane dopo la schiusa. Estendere il tempo di crescita del tumore in questo modo ci ha permesso di rilevare metastasi polmonari lontane da IHC. Anche se gli studi sui polli schiusi richiedono l'approvazione aggiuntiva di IACUC che gli studi sul tumore DELLA CAM non lo fanno, questo approccio offre una preziosa opportunità per studiare la cascata metastatica nei polli come precedentemente fatto nei topi. Il sistema immunitario del pollo è stato segnalato per sviluppare a partire dal giorno 12 dopo la fecondazione20. Data l'alta efficienza dell'innrafazione murine derivato tumori RENCA riportati qui e molte altre linee cellulari di cancro umano e PDX nella CAM il giorno 10 dopo la fecondazione24,25,27, potremmo dedurre che il sistema immunitario nell'embrione non è completamente sviluppato a questo punto. L'interazione tra il sistema immunitario del pollo e il tumore della CAM richiede chiaramente ulteriori indagini.
Il nostro lavoro fornisce una forte prova di supporto che il modello tumorale della CAM potrebbe essere un semplice modello iniziale in vivo per studiare la biologia del cancro, comprese le metastasi. A causa delle limitazioni indicate in precedenza, il modello CAM non deve sostituire il modello del mouse, ma integrarlo. La nostra ricerca in corso suggerisce che il crosstalk del segnale tra popolazioni di cellule eterogenee in ccRCC è strumentale nel governare la progressione metastatica11,12. L'uso sia dei modelli CAM che dei modelli murini può essere un mezzo prezioso per convalidare il crosstalk metastatico in gioco in ccRCC. Crediamo che i numerosi vantaggi del modello CAM qui presentato potrebbero accelerare il ritmo di scoperta di nuovi meccanismi metastatici e trattamenti efficaci per porre rimedio a questa fase mortale del cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione UCLA JCCC seed, UCLA 3R grant, UCLA CTSI, e UC TRDRP (LW). Ringraziamo il Crump Institute's Preclinical Imaging Facility, il TPCL e il Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) dell'UCLA per il loro aiuto con metodi sperimentali. La citometria di flusso è stata eseguita nell'UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) e nel Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility, supportato dai premi P30 CA016042 e 5P30 AI028697, e dal JCCC, l'UCLA AIDS Institute, la David Geffen School of Medicine dell'UCLA, l'ufficio del Cancelliere dell'UCLA e l'Ufficio di Ricerca del Vice cancelliere dell'UCLA. La consulenza statistica e i servizi di analisi dei dati sono stati forniti dal programma UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiologia e Research Design (BERD) supportato dal NIH/National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
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