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Methodenartikel

Erzeugung von Porcine Hodenorganoiden mit Testis-spezifischer Architektur mit Microwell-Kultur

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DOI:

10.3791/60387

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3. Oktober 2019

 ,  ,  ,  , 
1Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary, 2Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary, 3Biomedical Engineering Graduate Program, University of Calgary, 4Alberta Diabetes Institute, University of Alberta

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur reproduzierbaren Erzeugung von Schweinehodenorganoiden mit Testis-spezifischer Gewebearchitektur unter Verwendung des handelsüblichen Mikrowell-Kultursystems vor.

Zusammenfassung

Organoide sind dreidimensionale Strukturen, die aus mehreren Zelltypen bestehen, die in der Lage sind, Gewebearchitektur und Funktionen von Organen in vivo zu rekapitulieren. Die Bildung von Organoiden hat verschiedene Wege der Grundlagen- und Translationsforschung eröffnet. In den letzten Jahren haben Hodenorganoide Interesse auf dem Gebiet der männlichen Reproduktionsbiologie geweckt. Hodenorganoide ermöglichen die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, Gewebeentwicklung und der Keimzellnische Mikroumgebung und ermöglichen das Screening von Arzneimitteln und Toxizitäten mit hohem Durchsatz. Eine Methode ist erforderlich, um Hodenorganoide mit Hoden-spezifischer Gewebearchitektur zuverlässig und reproduzierbar zu erzeugen. Das Mikrobrunnenkultursystem enthält eine dichte Reihe von pyramidenförmigen Mikrobrunnen. Hodenzellen, die aus präpubertären Hoden gewonnen werden, werden in diese Mikrobrunnen zentrifugiert und kultiviert, um Hodenorganoide mit hodenspezifischer Gewebearchitektur und Zellassoziationen zu erzeugen. Tausende von homogenen Organoiden können über diesen Prozess erzeugt werden. Das hier berichtete Protokoll wird für Forscher, die die Männliche Fortpflanzung untersuchen, von breitem Interesse sein.

Einleitung

In den letzten Jahren ist das Interesse an dreidimensionalen (3D) Organoiden wieder gestiegen. Verschiedene Organe wie Darm1, Magen2, Bauchspeicheldrüse3,4, Leber5und Gehirn6 wurden erfolgreich in 3D-Organoid-Systeme abgeleitet. Diese Organoide haben architektonische und funktionelle Ähnlichkeiten mit den Organen in vivo und sind biologisch relevanter für die Untersuchung der Gewebemikroumgebung als monolayer Kultursysteme7. Als Ergebnis, Hodenorganoide haben begonnen, Interesse zu gewinnen sowie8,9,10,11,12. Die meisten bisher gemeldeten Methoden sind komplex, nicht hoher Durchsatz10 und erfordern die Zugabe von ECM-Proteinen8,10. Diese Komplexität führt auch zu Problemen mit der Reproduzierbarkeit. Es wird eine einfache und reproduzierbare Methode benötigt, die die Erzeugung von Hodenorganoiden mit Zellassoziationen ermöglicht, die wie Hoden in vivo sind.

Wir haben vor kurzem ein System gemeldet, um diese Anforderungen zu erfüllen12. Unter Verwendung des Schweins als Modell verwendeten wir einen zentrifugalen erzwungenen Aggregationsansatz im Mikrowell-System. Im Mikrowell-System enthält jeder Brunnen eine große Anzahl identischer kleinerer Mikrobrunnen13. Dies ermöglicht die Erzeugung zahlreicher Sphäroide einheitlicher Größe. Das Microwell-System ermöglichte die Erzeugung einer großen Anzahl einheitlicher Organoide mit einer testis-spezifischen Architektur. Das System ist einfach und erfordert keine Zugabe von ECM-Proteinen.

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Protokoll

HINWEIS: Die Hoden von einwöchigen Ferkeln wurden von einer gewerblichen Schweinehaltung als Nebenprodukt aus der Kastration von Handelsschweinen gewonnen. Die Beschaffung von Hoden wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary genehmigt.

1. Herstellung von Enzymlösungen für die Gewebeverdauung

HINWEIS: Es werden drei verschiedene enzymatische Lösungen benötigt, die zwei verschiedene Kollagenase-IV-Lösungen (Lösung A, B) und eine Desoxyribonuklease-I-Lösung (DNase I) umfassen.

  1. Um Lösung A vorzubereiten, lösen Sie 20 mg Kollagenase IV S (Materialtabelle) und 40 mg Kollagenase IV W (Materialtabelle) in 25 ml hochglukosen Dulbecco es Modified Eagle es Medium (DMEM). Anschließend wird der Filter mit einem 0,22-m-Filter sterilisiert. Fügen Sie 0,4 ml fetales Rinderserum (FBS) zu Lösung A hinzu, um die Trypsinaktivität zu hemmen.
  2. Um Lösung B vorzubereiten, lösen Sie 80 mg Kollagenase IV W (Materialtabelle) in 40 ml DMEM auf. Anschließend wird der Filter mit einem 0,22-m-Filter sterilisiert.
  3. Um DNase I Lösung (7 mg/ml) vorzubereiten, 70 mg DNase I in 10 ml DMEM auflösen. Anschließend wird der Filter mit einem 0,22-m-Filter sterilisiert.
    HINWEIS: Die hier beschriebene Enzymkonzentration für Kollagenase-IV-Lösungen unterscheidet sich von den im ursprünglichen Artikel14genannten Konzentrationen (2 mg/ml). Das aktuelle Protokoll ergibt Zellen mit etwas höherer Lebensfähigkeit. Jedoch, Zellen, die durch beide Protokolle isoliert produzieren Organoide mit identischer Gewebearchitektur.

2. Testisgewebe enzymatische Verdauung

  1. Die Hoden in ein steriles Becherglas einsammeln und mit Phosphat gepufferter Saline (PBS) waschen, die 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) enthält. Nach dem Waschen die Hoden auf eine 100 mm Gewebekulturschale mit PBS mit 1% P/S übertragen und die Tunika vaginalis und epididymis mit autoklavierter Schere und Zange entfernen. Die isolierten Hoden auf eine neue 100-mm-Schale übertragen und gründlich mit PBS mit 1% P/S waschen.
  2. Um die Sterilität aufrechtzuerhalten, verwenden Sie einen anderen Satz steriler Schere und Zangen, um das Hodenparenchym aus der Tunika albuginea zu schälen. Schneiden Sie die Hoden entlang der Längsachse direkt unter der Tunika. Dann die Hoden mit zwei Zangen aus der Tunika schälen und in eine neue 100-mm-Schale mit 1 ml DMEM mit 1% P/S geben.
  3. Die geschälten Hoden mit steriler Schere in 1-2 mm Gewebestücke zerkleinern. Nach dem Hacken verwenden Sie sterile Zangen, um weiße Fragmente des Bindegewebes zu entfernen.
  4. Die gehackten Gewebestücke in Lösung A übertragen und auf 50 ml mit DMEM aufziehen, um eine Konzentration von 0,4 mg/ml für Kollagenase IV S (Materialtabelle) und eine Konzentration von 0,8 mg/ml für Kollagenase IV W (Materialtabelle)zu erhalten. Lösung A mit den Gewebeteilen 30 min in ein 37 °C-Wasserbad geben, die Röhrchen alle 5 min sanft umkehren und visuell auf die Freisetzung von DNA überprüfen.
    1. Fügen Sie 500 l DNase I hinzu, wenn frei schwebende DNA beobachtet wird. Nach 30 min zentrieren Sie das Rohr bei 90 x g mit Bremsen bei 25 °C für 1,5 min und entsorgen Sie den Überstand.
      HINWEIS: DNA würde als trübe Substanz erscheinen. Wenn die Röhren geschüttelt werden, setzen sich die Gewebestücke ab, während die DNA über Wasser bleiben würde.
  5. Fügen Sie Lösung B in das Rohr und aufladen Bis zu 50 ml mit DMEM, um eine Konzentration von 1,2 mg/ml Kollagenase IV W (Materialtabelle) zu erhalten. Legen Sie das Rohr 30 min in ein 37 °C-Wasserbad und alle 5 min. das Rohr sanft umkehren. Fügen Sie 500 l DNase I hinzu, wenn frei schwebende DNA beobachtet wird.
  6. Nach 30 min zentrieren Sie das Rohr bei 90 x g mit Bremsen bei 25 °C für 1,5 min. Danach den Überstand entsorgen und einmal mit PBS mit 1% P/S waschen.
    HINWEIS: Die ausrangierten Überstande aus Lösung A und B enthalten in erster Linie interstitielle Zellen.
  7. Das Rohr mit PBS bis zu 50 ml aufladen. Sammeln Sie vorsichtig die Tubuli von oben und legen Sie sie in ein neues 50 ml Rohr.
    HINWEIS: Die großen unverdauten Gewebefragmente setzen sich schnell am Boden ab, während verdaute seminiferöse Tubuli in Suspension bleiben. Es sollten keine großen Gewebefragmente gesammelt werden. Dieses Verfahren kann mehrmals wiederholt werden, bis die Lösung im Originalrohr fast klar ist und nur noch unverdaute Gewebefragmente verbleiben, die entsorgt werden können.
  8. Zentrifugieren Sie die Tubuli bei 90 x g mit Bremsen bei 25 °C für 1,5 min und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie wieder frische PBS und Zentrifuge hinzu. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
  9. Nach der letzten PBS-Wäsche den Überstand entfernen und die seminiferen Tubuli in 5 ml PBS wieder aussetzen. Dann 15 ml 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in die Tubuli geben. Legen Sie das Rohr in 37 °C Wasserbad und sanft alle 2 min invertieren. Wenn eine Menge frei schwebender DNA beobachtet wird, fügen Sie 500 l DNase I mit 5 ml DMEM hinzu.
  10. Bewerten Sie die enzymatische Verdauung von Tubuli an einzelnen Zellen unter dem Mikroskop (erst nach 5 min, dann alle 2 min). Wenn meist einzelne Zellen detektiert werden können, stoppen Sie die Reaktion mit 5 ml FBS und filtern Sie durch ein 70-m-Netz und dann durch ein 40-m-Netz.
    HINWEIS: Es ist darauf zu achten, dass die Kappen an den 50 ml-Rohren, die für die Verdauung verwendet werden (Lösung A, B und 0,25 % Trypsin-EDTA), ordnungsgemäß angezogen werden. Wenn eine Kontamination im Wasserbad ein Problem darstellt, kann Paraffinfolie um die Kappe gewickelt werden, um Sterilität zu gewährleisten.
  11. Zentrifugieren Sie die Einzelzellen bei 500 x g mit Bremsen bei 25 °C für 5 min, resuspendieren Sie im Anreicherungsmedium (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) mit 5% FBS und 1% P/S) und zählen die Anzahl der lebensfähigen Zellen. Dies ist die Anfangszellenpopulation. Fixieren Sie 100 x 103 Zellen und führen Sie die Immunzytochemie für den Keimzellmarker UCHL1 (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) wie beschrieben12 durch und bestimmen Sie den Prozentsatz der Keimzellen in dieser Ausgangszellpopulation.
    HINWEIS: Keimzellmarker Promyelocytic Leukämie Zinkfingerprotein (PLZF)15 könnte auch als geeignete Alternative für UCHL1 verwendet werden. In der Anfangszellpopulation beträgt die erwartete Zellausbeute etwa 700-800 x 109/g Gewebe. Der Anteil der Keimzellen in dieser Zellpopulation sollte 4-5% betragen.
  12. Legen Sie etwa 20 x 106 dieser Ausgangszellpopulation in zwei ultraniedrige Aufsatz 100 mm Petrischalen (10 x 106 Zellen in 10 ml DMEM/F12 mit 1% P/S in jeder Schale) für 2 Tage in einem Gewebekultur-Inkubator (37 °C) , 5% CO2, 21% Sauerstoff). Führen Sie die Keimzellanreicherung mit den verbleibenden Zellen durch.
    HINWEIS: Um eine optimale Lebensfähigkeit und Zellqualität zu gewährleisten, während die Keimzellanreicherung und anschließende Quantifizierung stattfindet, wird die Ausgangszellpopulation in Kultur in ultra niedrigen Anhang Gewebekultur Gerichte für 2 Tage platziert.

3. Keimzellanreicherung

HINWEIS: Das oben beschriebene Verfahren führt in erster Linie zu Sertoli-Zellen und Keimzellen. Unterschiedliche Haftungseigenschaften ermöglichen die Trennung von Sertoli-Zellen und Keimzellen durch Differentialbeschichtung.

  1. Samen 20-25 x 106 Zellen der Ausgangszellpopulation pro 100 mm Gewebekulturschale in einem Gesamtvolumen von 8 ml Anreicherungsmedium (DMEM/F12 mit 5% FBS und 1% P/S) für Differentialbeschichtung. Legen Sie die Zellen in einen Inkubator (37 °C, 5%CO2, 21%O2) und stellen Sie nach 1,5 h sicher, dass die Mehrheit der Sertoli-Zellen an der Platte befestigt ist.
  2. Sammeln und kombinieren Sie den Überstand (hauptsächlich keimzellenhaltiger) von 2 Platten zu einer neuen 100-mm-Platte und legen Sie ihn wieder in den Inkubator. Nach 1 h wieder den Überstand von 2 Platten zu einer neuen 100 mm Platte kombinieren. Legen Sie die Platten für die Nacht wieder in den Inkubator.
    HINWEIS: Die kombinierten Überstande enthalten in erster Linie Keimzellen. Die haftenden Zellen, die zusammen mit den Platten verworfen werden, sind in erster Linie hodenförmige somatische Zellen wie Sertoli und peritubuläre Myoidzellen.
  3. Sammeln Sie die angereicherten Keimzellen in zwei Fraktionen wie folgt.
    HINWEIS: Angereicherte Keimzellen haften unterschiedlich, nicht haftender Fraktion und leicht haftender Bruch. Beide Fraktionen bilden zusammen die angereicherte Keimzellpopulation
    1. Nicht haftende Fraktion: Sammeln Sie den Überstand.
    2. Leicht haftende Fraktion: Waschen Sie die Platten vorsichtig mit PBS, behandeln Sie mit 2 ml 1:20 Verdünnung von 0,25% Trypsin-EDTA für 5 min bei Raumtemperatur, stoppen Sie die Reaktion mit 2 ml Anreicherungsmedium und sammeln Sie in der gleichen Röhre wie nicht haftende Fraktion.
      HINWEIS: 0,25% Trypsin-EDTA muss mit PBS verdünnt werden, um eine 1:20 Trypsin-Lösung zu produzieren.
  4. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Zellzähler, fixieren Sie 100 x 103 Zellen und führen Sie die Immunzytochemie für den Keimzellmarker UCHL1 wie beschrieben12 durch und bestimmen Sie den Prozentsatz der Keimzellen in dieser angereicherten Zellpopulation.
    HINWEIS: Der Prozentsatz der Keimzellen in dieser Zellpopulation sollte mindestens 60-70% betragen. Da die Immunzytochemie für die Quantifizierung 1 Tag erfordern würde, sollten die angereicherten Zellen in eine ultra niedrige Aufsatz 100 mm Petrischale mit DMEM/F12 ergänzt mit 1% P/S für die Dauer platziert werden, um eine optimale Zellqualität und Lebensfähigkeit zu gewährleisten.

4. Vorbereitung von Zellen für die Aussaat

  1. Um die Ausgangszellenzubereitung zu ernten, sammeln Sie den Überstand in einem 50 ml Rohr aus dem ultra niedrigen Aufsatz 100 mm Geschirr. Waschen Sie die Platten kräftig mit PBS, um die haftenden Zellen zu sammeln. Eine enzymatische Verdauung ist nicht erforderlich.
    HINWEIS: Einige der Hodenzellen, in erster Linie Sertoli-Zellen, können leicht an den ultraniedrigen Befestigungsplatten haften.
  2. Kombinieren Sie die Ausgangszellpräparation und angereicherte Keimzellen zu einem Arbeitszellenpräparat mit 25% Keimzellen. Zentrifuge bei 500 x g mit Bremsen bei 25 °C für 5 min, Den Überstand entsorgen und die Zellen im Organoidbildungsmedium wieder aufsetzen (DMEM/F12 ergänzt mit Insulin 10 g/ml, Transferrin 5,5 g/ml, Selen 6,7 ng/ml, 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor , 1% P/S). Stellen Sie die Zelldichte auf 2,4 x 106 pro ml ein.
    HINWEIS: Jeder Brunnen in den Mikrowell-Platten, die13 in diesem Protokoll verwendet wurden, enthielt 1.200 Mikrobrunnen.
  3. Verwenden Sie die folgende Formel, um die Anzahl der Zellen pro Brunnen zu berechnen, wie unten beschrieben.
    Anzahl der Zellen pro Bohrkörper = Anzahl der Mikrobrunnen x Anzahl der Zellen, die für jedes Organoid gruppiert werden sollen.
  4. Um Organoide aus jeweils 1.000 Zellen zu erzeugen, samen Sie jeweils mit (jeweils 1.200 x 1.000 Zellen=) 1,2 x 106 Zellen. Passen Sie die Zelldichte in der Zellsuspension so an, dass die Zellen in einem Volumen von 0,5 ml Medium gesät werden. Für Organoide, die aus jeweils 1.000 Zellen gebildet werden, verwenden Sie eine Dichte von 2,4 x 106 Zellen pro ml (1,2 x 106 Zellen in 0,5 ml).

5. Vorbereitung von Mikrobrunnen zur Aufnahme von Zellen

HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Zellen nicht an der Mikrowell-Oberfläche haften, behandeln Sie mit einer Tensidspüllösung, die vom Hersteller zum Kauf erhältlich ist.

  1. Fügen Sie 0,5 ml Spüllösung zu jedem Brunnen hinzu. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Brunnen gefangen sind. Um Luftblasen zu entfernen, zentrieren Sie die Platte bei 2.000 x g mit Bremsen bei 25 °C für 2 min.
  2. Beobachten Sie die Platte unter einem invertierten Mikroskop mit geringer Vergrößerung, um zu überprüfen, ob die Blasen aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Wenn eingeschlossene Blasen beobachtet werden, zentrifugieren Sie wieder bei 2.000 x g mit Bremsen bei 25 °C für 2 min, um alle verbleibenden Blasen zu entfernen.
  3. Bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und brüten Sie 30 min bei Raumtemperatur. Nach Abschluss der Behandlung die Spüllösung entfernen und die Platte sofort mit sterilem Wasser oder PBS waschen. Stellen Sie sicher, dass die Platte nach der Behandlung mit der Spüllösung nicht austrocknet.

6. Erzeugung von Hodenorganoiden

  1. Fügen Sie 0,5 ml Organoid-Formationsmedium (ohne Zellen) zu jedem Brunnen und Zentrifuge bei 2.000 x g mit Bremsen bei 25 °C für 2 min, um alle eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen. Beobachten Sie den Brunnen unter einem invertierten Mikroskop mit geringer Vergrößerung, um zu überprüfen, ob die Luftblasen entfernt wurden. Wenn eingeschlossene Blasen beobachtet werden, zentrifugieren Sie wieder bei 2.000 x g mit Bremsen bei 25 °C für 2 min, um alle verbleibenden Blasen zu entfernen.
  2. 0,5 ml der Arbeitszellenaufhängung hinzufügen und sanft mischen, indem sie nach oben und unten pfeifen. Zentrifuge bei 500 x g mit Bremsen bei 25 °C für 5 min. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich die Zellen in den Mikrobrunnen gruppiert haben.
  3. Übertragen Sie die Platte für 5 Tage in einen Zellkultur-Inkubator und eine Kultur. Wechseln Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums.
    1. Um das Medium zu wechseln, ohne Organoide zu verlieren, berühren Sie die Pipettenspitze an die Wand des Brunnens und senken Sie sanft, um den Meniskus zu berühren und langsam das Medium zu zeichnen. Achten Sie darauf, den Meniskus zu folgen, wie es nach unten fällt. Um frisches Medium hinzuzufügen, berühren Sie die Pipettenspitze an der Wand des Brunnens auf der gleichen Seite wie das Medium Rückzug und fügen Sie frisches Medium sanft gegen die Brunnenwand, so dass es langsam die Wand hinunter fließen.
  4. Um die Organoide zu erholen, pipette das Medium vorsichtig nach oben und unten mit einer breiten Mundpipette. Dies würde es den Organoiden ermöglichen, aus den Mikrobrunnen zu kommen.
  5. Organoide sammeln, mit PBS waschen, Immunzytochemie für Keimzellmarker (UCH-L1), Sertoli-Zellmarker (GATA Binding Protein 4-GATA4), peritubulären myoiden Zellmarker (-Smooth Muscle Actin-SMA) und Leydig-Zellmarker (Cytochrom) fixieren und durchführen P450-CYP450) wie beschrieben12 und visualisieren unter einem konfokalen Mikroskop.

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Ergebnisse

Isolierte Zellen aus 1 Wochen alten Schweinehoden, die in den Mikrobrunnen selbst organisiert in Sphäroide kultiviert wurden (Abbildung 1A, Abbildung 2), mit abgegrenzten und ausgeprägten äußeren (seminiferen Epithel) und Innenfächern ( interstitium) (Abbildung 1B, Abbildung 2). Die beiden Fächer wurden durch eine Kollagen-IV+ve-Kel...

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Diskussion

Wir haben eine einfache Methode etabliert, die die konsistente, wiederholbare Erzeugung einer großen Anzahl von Hodenorganoiden mit Gewebearchitektur ermöglicht, die Hoden in vivo12ähnelt. Während der Ansatz mit Schweine-Hodenzellen entwickelt wurde, ist er breiter angelegt auch auf Maus, nicht-menschliche Primaten und menschliche Hoden12anwendbar. Für die Herstellung von Hodenorganoiden 8,9,

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Offenlegungen

Dr. Ungrin hat als Erfinder ein finanzielles Interesse an der AggreWell-Technologie.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von NIH/NICHD HD091068-01 an Dr. Ina Dobrinski unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mm Gewebekulturschale mit extrem geringer BindungCorning#CLS3262
100 mm GewebekulturschaleCorning#353803
Aggrwell 400Stemcell Technologies#34411
Anti-Adhärenz-SpüllösungStemcell Technologies#07010
Kollagenase Typ IV aus Clostridium histolyticumSigma-Aldrich#C5138bezeichnet als Kollagenase IV S
Kollagenase Typ IV WorthingtonWorthington-Biochem#LS004189bezeichnet als Kollagenase IV W
Desoxyribonuklease I aus der RinderbauchspeicheldrüseSigma-Aldrich#DN25
Dulbecco" s Modifizierter Adler" s Medium/F12Gibco#11330-032
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium - hoher GlukosegehaltSigma-Aldrich#D6429
Dulbecco' s Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-Aldrich#D8537
Epidermaler WachstumsfaktorR& D Systems#236-EG
Falcon Zellsiebe 70 µ mFisherScientific#352350
Falcon Zellsiebe 40 µ mFisherScientific#352340
Fötales RinderserumThermoFisher Scientific#12483-020
Insulin-Transferrin-SelenGibco#41400-045
Penicillin-StreptomycinSigma-Aldrich#P4333
Hodengewebe von SchweinenSunterra Farms Ltd (Alberta, Kanada)
Steriflip-GP Sterile Zentrifugenröhrchen-Top-FiltereinheitMillipore#SCGP00525
Trypsin-EDTASigma#T4049

Referenzen

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