Methodenartikel

Native Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Immunoblot-Analyse der endogenen IRF5-Dimerisierung

DOI:

10.3791/60393

⸱

6. Oktober 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, City University of Hong Kong

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine native Western Blot-Methode zur Analyse der endogenen Interferon-Regulierungsfaktor 5-Dimerisierung in der CAL-1-Plasmazytoid-Dendritischen Zelllinie wird beschrieben. Dieses Protokoll kann auch auf andere Zelllinien angewendet werden.

Zusammenfassung

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Interferon-Regulierungsfaktor 5 (IRF5) ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die Regulierung der Immunantwort. Es wird nach dem Signalweg des toll-ähnlichen Rezeptor-Myeloiden-Differenzierungsgens 88 (TLR-MyD88) aktiviert. Die IRF5-Aktivierung beinhaltet Phosphorylierung, Dimerisierung und nachfolgende Translokation vom Zytoplasma in den Zellkern, was wiederum die Genexpression verschiedener pro-inflammatorischer Zytokine induziert. Ein Nachweistest für die IRF5-Aktivierung ist für die Untersuchung von IRF5-Funktionen und deren relevanten Wegen unerlässlich. Dieser Artikel beschreibt einen robusten Test zum Nachweis der endogene IRF5-Aktivierung in der CAL-1-Linie der humanen Plasmazytoid-Dendritischen Zelle (pDC). Das Protokoll besteht aus einem modifizierten nicht denatorischen Elektrophorese-Assay, der IRF5 in seiner Monomer- und Dimerform unterscheiden kann und somit einen erschwinglichen und sensiblen Ansatz zur Analyse der IRF5-Aktivierung bietet.

Einleitung

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Interferon-Regulierungsfaktor 5 (IRF5) ist ein wichtiger Transkriptionsregulator, der eine herausragende Rolle bei der Regulierung der Immunantwort spielt, insbesondere bei der Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen und Typ-I-Interferonen (IFNs)1,2 ,3. Die Fehlregulation von IRF5 ist ein Faktor bei zahlreichen Autoimmunerkrankungen, wie verschiedene Polymorphismen im IRF5-Lokus zeigen, die mit systemischem Lupus erythematodes, Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis usw. assoziiert sind.4, 5,6,7,8,9,10. Daher ist ein robuster Nachweis-Test für den endogenen IRF5-Aktivierungszustand entscheidend für das Verständnis der regulatorischen Pfade und nachgelagerten Wirkungen von IRF5 in einem physiologisch relevanten zellulären Kontext.

IRF5 wird konstitutiv in Monozyten, dendritischen Zellen (DCs), B-Zellen und Makrophagen1,11ausgedrückt. Wie bei anderen Transkriptionsfaktoren der IRF-Familie befindet sich IRF5 im Zytoplasma in seinem latenten Zustand. Bei aktivierung wird IRF5 phosphoryliert und bildet Homodimere, die sich dann in den Kern transortieren und an spezifische regulatorische Elemente von Genen binden, die Typ I IFNs und pro-inflammatorische Zytokine kodieren, was schließlich die Expression dieser Gene induzieren1 ,2,11,12,13. IRF5 reguliert die angeborenen Immunantworten stromabwärts von verschiedenen tollähnlichen Rezeptoren (TLRs), wie TLR7, TLR 8 und TLR 9, die in Endosomen lokalisiert sind und MyD88 für die Signalisierung1,11,14verwenden. Diese TLRs erkennen in erster Linie fremde Nukleinsäurearten wie einsträngige RNA (ssRNA) und unmethylierte CpG-DNA, die symptomatisch für eine Infektion15,16,17,18sind. IRF5 hat gezeigt, dass Immunreaktionen gegen bakterielle, virale, und Pilzinfektionen regulieren19,20,21. Angesichts der einflussreichen und vielfältigen Rolle von IRF5 im Immunsystem könnte die Verbesserung oder Dämpfung der IRF5-Aktivität als neuer Weg für die Entwicklung von therapeutischen Wirkstoffen dienen22. Daher ist es wichtig, ein Protokoll zur Überwachung des Aktivierungsstatus des endogenen IRF5 zu entwickeln, um eine gründliche Untersuchung der Wege und Mechanismen zur Regulierung der IRF5-Aktivität in verschiedenen Zelltypen zu ermöglichen.

Nach bestem Wissen und Gewissen wurde vor der Entwicklung dieses Protokolls kein biochemischer oder gelelektrophoretischer Assay zur endogenen IRF5-Aktivierung veröffentlicht. Die Phosphorylierung hat sich als wichtiger erster Schritt der IRF5-Aktivierung erwiesen, und es wurde ein phosphospezifischer IRF5-Antikörper entwickelt, der zur Entdeckung und Bestätigung eines für die IRF5-Aktivität wichtigen Serinrückstands führte13. Während der Antikörper jedoch deutlich phosphoryliertes IRF5 erkennt, wenn er immunpräzipiert oder überexprimiert23 ist,kann er die IRF5-Phosphorylierung in einem ganzen Zelllysat in unseren Händen nicht erkennen (Daten werden nicht angezeigt). Dimerisierung ist der nächste Schritt der IRF5-Aktivierung, und viele wichtige Studien, die diesen Schritt bisher untersuchten, stützten sich auf die Überexpression von IRF5 mit Epitop-Tag, oft in irrelevanten Zelltypen, die normalerweise Nicht IRF511,12 ausdrücken. ,24,25. Frühere Studien haben gezeigt, dass dimerisierte IRF5 kann nicht immer in den Kern translosien und ist daher nicht unbedingt voll aktiviert25,26. Ein Test für die endogene IRF5-Kernlokalisierung wurde entwickelt, um die IRF5-Aktivierung durch bildgebende Durchflusszytometrie27zu bewerten. Dieser Test wurde in Studien angewendet, die für das Verständnis der IRF5-Aktivität entscheidend waren, insbesondere bei primären oder seltenen Zelltypen28,29 und das Wissen auf diesem Gebiet stark weiterentwickelt. Dieser Test stützt sich jedoch auf ein spezialisiertes Instrument, das forschern nicht allgemein zugänglich ist. Darüber hinaus ist es häufig notwendig, die ersten Schritte der Aktivierung zu untersuchen, während die IRF5-Regulierungspfade seziert und vorgeschaltete Regulierungs- und Signalwegkomponenten identifiziert werden. Diese Studie bietet einen robusten und zuverlässigen biochemischen Test für die frühen Aktivierungsereignisse von IRF5, der in Laboren durchgeführt werden kann, die mit molekularbiologischen Werkzeugen ausgestattet sind. Das hier beschriebene Protokoll wird sehr nützlich sein, um die Wege und Mechanismen von IRF5-Aktionen zu untersuchen, insbesondere in Kombination mit orthogonalen Assays wie der zytometrischen Analyse des bildgebenden Durchflusses der IRF5-Kernlokalisierung23, 27,28,30.

Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (native PAGE) ist eine weit verbreitete Methode zur Analyse von Proteinkomplexen31,32. Im Gegensatz zur Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) trennt native PAGE Proteine anhand ihrer Form, Größe und Ladung. Es behält auch native Proteinstruktur ohne Denaturierung31,33,34,35. Das vorgestellte Protokoll nutzt diese Funktionen der nativen PAGE und erkennt sowohl monomere als auch dimerische Formen von IRF5. Diese Methode ist besonders wichtig für die Erkennung von Frühaktivierungsereignissen, da es keinen geeigneten handelsüblichen Antikörper gibt, der endogene phosphorylierte IRF5 detektieren kann. Zuvor wurden in mehreren veröffentlichten Studien native PAGE verwendet, um die IRF5-Dimerisierung zu bewerten. Die meisten dieser Studien hingen jedoch von der Überexpression von exogenem Epitop mit IRF5-Tags ab, um den Aktivierungsstatus2,13,24,36,37 zu analysieren. . Diese Arbeit stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Analyse der endogenen IRF5-Dimerisierung über eine modifizierte native PAGE-Technik in einer menschlichen Plasmazytoid-Dendritischen Zelle (pDC) dar, bei der sich die IRF5-Aktivität als entscheidend für ihre Funktion erwiesen hat1, 38,39,40. Dieselbe Technik wurde auch auf andere Zelllinienangewendet 23.

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Protokoll

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HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll verwendet CAL-1 pDC-Zelllinie, die mit resiquimod (R848), einem Agonisten für TLR7/8, behandelt wird. Dieses Protokoll wurde auf andere menschliche und murine Zelltypen angewendet, einschließlich RAW 264.7 (murine Makrophagenlinie), THP-1 (menschliche monozytäre Zelllinie), BJAB (menschliche B-Zelllinie), Ramos (menschliche B-Zelllinie) und MUTZ-3 (menschliche dendritische Zelllinie)23.

1. Stimulation von CAL-1-Zellen

  1. Halten Sie CAL-1-Zellkulturen in einem T75-Kolben bei 37 °C und 5 %CO2 unter sterilen Bedingungen mit 20 bis 25 ml RPMI 1640 Medium, das 5% fetales Rinderserum (FBS), 25 mM HEPES und 1x Mercaptoethanol (d. h. komplettes RPMI 1640 medium) enthält.
  2. Übertragen Sie die Zellen in ein 50 ml konisches Rohr.
    HINWEIS: CAL-1-Zellen sind nicht haftende Zellen. Bei anhaftenden Zelltypen kann eine Standard-Trypsinisierung durchgeführt werden, um Zellen zu ernten.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 8 ml des gesamten RPMI 1640 Mediums wieder auf, um eine homogene einzellige Suspension zu erhalten.
  4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte mit 4 ml vorgewärmten kompletten RPMI 1640 Medium in jedem Brunnen. Inkubieren Sie für 20 bis 24 h bei 37 °C und 5 %CO2, damit die Konfluenz 90 % bis 95 % erreichen kann (entsprechend etwa 1,5 x 106 Zellen).
  5. Stimulieren Sie die Zellen, indem Sie 4 l von 1 mg/ml R848 pro Bohrung der 6 Wellplatte (Endkonzentration von 1 g/ml) hinzufügen. Richten Sie auch eine unstimulierte Kontrolle gut mit Zellen ohne die R848 Behandlung.
  6. Stellen Sie sicher, dass der R848 gleichmäßig verteilt ist, indem Sie die Platte sanft zur Seite schaukeln. Dann inkubieren Sie die Zellen für 2-16 h im Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.

2. Extraktion von Zellproteinen

  1. Übertragen Sie die Zellsuspensionen von der 6-Well-Platte in 5 ml Zentrifugenrohre.
  2. Zentrifugieren Bei 200 x g für 5 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml phosphatgepufferter Saline (PBS) wieder auf, um eine homogene einzellige Suspension zu erhalten.
  3. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr.
  4. Drehen Sie bei 12.000 x g für 0,5 x 1 min bei 4 °C kurz nach unten und entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
  5. Vorbereiten des Lysepuffers mit 6,25 ml von 1 M Tris-HCl pH 7,4 (Endkonzentration von 25 mM), 7,5 ml 5 M NaCl (Endkonzentration von 150 mM), 0,5 ml von 0,5 m EDTA (Endkonzentration von 1 mM), 2,5 ml NP-40 (Endkonzentration von 1%) und 7,5 ml Glycerin (Endkonzentration von 5%) in 250 ml entionisiertem Wasser (ddH2O). Fügen Sie 100x Protease-Hemmer-Einweg-Cocktail in eine endige Konzentration von 1x in den Lysepuffer kurz vor Gebrauch. Den vorbereiteten Lysepuffer auf Eis halten.
    HINWEIS: Der Lysepuffer ohne Protease kann bei 4 °C gelagert werden.
  6. Setzen Sie das Zellpellet in 30 l eiskalten Lysepuffer auf und mischen Sie es durch Pipettieren nach oben und unten.
  7. Auf Eis für 15-20 min inkubieren.
  8. Klären Sie das Lysat durch Zentrifugieren bei 12.000 x g für 15 bis 20 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein neues vorgechilltes 1,5 ml Zentrifugenrohr. Halten Sie die Extrakte jederzeit auf Eis.
    HINWEIS: Zelllysate können bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden. Kochen Sie die Proben nicht.
  9. Messen Sie die Proteinkonzentration mit Bradford-Reagenz.

3. Analyse der IRF5-Dimerisierung durch Native PAGE

  1. Bereiten Sie die oberen (-) und unteren (+) Kammerelektrophoresepuffer vor. Der obere Kammerpuffer besteht aus 0,3% Natriumdeoxycholat (NaDOC) im 1x nativen PAGE-Laufpuffer, und die untere Kammer besteht aus nur 1x nativem PAGE-Laufpuffer.
    HINWEIS: Bereiten Sie einen frischen oberen Kammerpuffer für jeden neuen Lauf vor.
  2. Spülen Sie ein 3%-12% natives PAGE-Gel gründlich mit Wasser, ohne die Brunnen zu verzerren. Setzen Sie das Gel in den Mini-Geltank und entfernen Sie den Kamm. Das Gel in einem 4 °C-Kaltraum oder auf Eis bei 150 V 30 min vorrunden.
    HINWEIS: Prerunning entfernt übermäßige Ammoniak- und Persulfationen, die das Laufen des Gels stören können.
  3. Bereiten Sie während der Vorlaufzeit die Proben für die Beladung vor, indem Sie die auf Eis gehaltenen zellulären Proteine mit einem 4x nativen Probenpuffer mischen.
  4. Laden Sie nach der Vorrunde 10 bis 15 g Protein mit einem Endvolumen von 10 bis 15 l pro Probe.
    HINWEIS: Eine Überlastung des Proteins kann zu Verschmierungen führen.
  5. Führen Sie Gel bei 85 V für 30 min, dann 150 V für 2 h.
    HINWEIS: Unter Berücksichtigung der Unterschiede in der Ausrüstung und zelllinien, die von verschiedenen Labors verwendet werden, können geringfügige Änderungen an der Konzentration von Proteinproben, Spannung und Laufzeit geeignet sein, dieses Protokoll zu optimieren. Die Senkung der Vorlauf- und Laufspannung bei gleichzeitiger Erhöhung der Laufzeit kann dazu beitragen, die Dimer-Auflösung und die Ergebniskonsistenz zu verbessern.
  6. Das Gel in SDS-Laufpuffer (25 mM Tris pH 8,3, 250 mM Glycin, 0,1% SDS) 30 min bei RT einweichen.
    HINWEIS: Es ist keine Agitation erforderlich. Gelegentlich kann die Intensität des Bandes nicht proportional zur Menge des Proteins sein, das aufgrund einer ineffizienten Übertragung in Gegenwart von Desoxycholat (DOC) geladen wird, was hauptsächlich die monomere Form von IRF5 betrifft. Das Einweichen des Gels in den SDS-Laufpuffer vor der Übertragung löst dieses Problem. Das Gel ist zerbrechlich. Behandeln Sie mit extremer Sorgfalt vom unteren (d. h. höheren Prozentsatz) Ende des Gels.

4. Immunoblot-Analyse von IRF5

  1. Aktivieren Sie die Polyvinylidendifluorid-Membran (PDVF), indem Sie sie ca. 5 min in Methanol einweichen.
  2. Machen Sie einen Schnitt an einer Ecke der Membran, um ihre Ausrichtung anzuzeigen. Montieren Sie das Transfer-Sandwich gemäß der sequenziellen Reihenfolge, die im Herstellerprotokoll beschrieben ist, mit besonderer Sorgfalt, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Inneren gefangen sind.
  3. Legen Sie die Transferkassette in den Tank und übertragen Sie bei 20 V für 1 h auf Eis.
    HINWEIS: Führen Sie alle Inkubationen und Wälzungen in den folgenden Schritten mit einem schaukelnden Shaker durch.
  4. Entfernen Sie die Membran mit Kunststoffzangen aus der Kassette, nachdem die Übertragung abgeschlossen ist. Blockieren Sie die Membran im Blockierpuffer (TBS) für 45 min bei RT.
    HINWEIS: TBS-Puffer mit 5% BSA kann auch als Blockierpuffer verwendet werden.
  5. Inkubieren Sie die Membran mit dem in Tabelle 1aufgeführten primären Antikörper. Waschen Sie die Membran mit 1x TBST Waschpuffer (20 mM Tris, pH 7,0, 150 mM NaCl und 0,1% Tween 20) für 3 min beim Schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche 2x.
DillutionDillution-PufferausbrütenKommentare
Primärer Antikörper (Anti-IRF5)1/1,000TBS-BlockierpufferÜbernachtung bei 4 °C oder 2 h bei RTVerdünnte Antikörper können mehrmals wiederverwendet werden, wenn sie bei 4 °C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert werden.
Sekundärer Antikörper (Anti-Kaninchen)1/10,000TBS-Blockierpuffer45 Min. bei RTVerdünnte Antikörper können mehrmals wiederverwendet werden, wenn sie bei 4 °C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert werden.
HINWEIS: Die Verdünnung muss optimiert werden, da sie von Hersteller zu Hersteller unterschiedlich ist.

Tabelle 1: Spezifikationen der Antikörper, die im Immunoblotting-Verfahren verwendet werden.

  1. Inkubieren Sie die Membran mit dem in Tabelle 1aufgeführten sekundären Antikörper. Waschen Sie die Membranen für 3 min in 1x TBST Waschpuffer. Wiederholen Sie die Wäsche 2x.
  2. Scannen Sie den Fleck mit einem geeigneten Gel-Dokumentationssystem.

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Ergebnisse

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Der Immunoblot (IB) mit einem Anti-IRF5-Antikörper wurde an CAL-1-Zellen durchgeführt, die unstimuliert oder stimuliert wurden mit 1 g/ml R848 für 2 h(Abbildung 1). Zelllysate wurden vorbereitet, und die native PAGE wurde durchgeführt. In nicht stimulierten CAL-1-Zellen wurde IRF5 als einzelnes Band auf der nativen PAGE nachgewiesen, entsprechend seiner monomeren Form. Bei der Behandlung von CAL-1-Zellen mit R848 für 2 h verringerte sich der Gehalt an IRF5-Monomer mit einer gleichzeitigen Zu...

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Diskussion

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Das hier beschriebene Protokoll ist eine modifizierte native PAGE, die sowohl monomische als auch dimerische Formen endogener IRF5 unterscheidet. Es gab nur wenige Studien, die über den Nachweis der endogenen IRF5-Aktivierung mit der spezialisierten Bildflusszytometrietechnik23,27,28,30berichteten. Dieses Protokoll verwendet eine gängige Technik und gängige Reagenzien und Werkzeuge, um den endo...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Arbeit wurde durch Fördermittel der Croucher Foundation und der Startup-Fonds der City University unterstützt. Wir danken allen Mitgliedern des Chow-Labors für die Hilfe beim Experiment und der kritischen Lektüre des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-MercaptoethanolLife Technologies, HK21985023
300 W/250 V Stromversorgung 230 V ACLife Technologies, HKPS0301
Anti-IRF5 AntikörperBethyl Laboratories, USAA303-385
BIOSAN Rocker Shaker (kühlraumsicher)EcoLife, HKMR-12
EDTA Puffer, pH 8, 0,5 M 4x 100 mLLife Technologies
Glycerol 500 mLLife Technologies15514011
GlycineLife Technologies, HK15527013
Ziege Anti-Maus IgG DyLight 800 Konjugierter AntikörperLAB-A-PORTER/Rockland, HK610-145-002-0,5
Ziege Anti-Kaninchen IgG DyLight 800 Konjugierter AntikörperLAB-A-PORTER/Rockland, HK611-145-002-0,5
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)Thermo Fisher Scientific, HK78430
HEPESLife Technologies, HK15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS)Gene Company, HK927-50000
Mini Tank Blot Modul Combo; Transfermodul, ZubehörLife Technologies, HKNW2000
NativePAGE 3-12% Gele, 10 Well KitLife Technologies, HKBN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20xLife Technologies, HKBN2001
NativePAGE Probenpuffer 4xLife Technologies, HKBN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylen GlykolZinn Hang/ Calbiochem, HK#492016-100ML
PBS 7.4Life Technologies, HK10010023
Polyvinylidendifluorid (PVDF)-MembranBio-Gene/Merck Millipore, HKIPFL00010
Protein-Assay-Kit II (BSA)Bio-Rad, HK5000002
R848Invivogen, HKtlrl-r848
RPMI 1640Life Technologies, HK
NatriumchloridThermoFisherBP358-1
Natriumdesoxycholat ≥ 97% (Titration)Zinn Hang/Sigma, HKD6750-100G
TrisLife Technologies, HK15504020
TWEEN 20Zinn Hang/Sigma, HK#P9416-100ML
1557502061870127

Referenzen

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