Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Zusammenfassung

Ubiquitin (ub) und ubiquitin-like (ubl) abhängige posttranslationale Modifikationen von Proteinen spielen grundlegende biologische regulatorische Rollen innerhalb der Zelle, indem sie Proteinstabilität, Aktivität, Wechselwirkungen und intrazelluläre Lokalisation kontrollieren. Sie ermöglichen es der Zelle, auf Signale zu reagieren und sich an Veränderungen in ihrer Umgebung anzupassen. Veränderungen innerhalb dieser Mechanismen können zu schweren pathologischen Situationen wie neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs führen. Ziel der hier beschriebenen Technik ist es, ub/ubls abhängige PTMs-Profile schnell und genau aus kultivierten Zelllinien zu erstellen. Der Vergleich verschiedener Profile, die unter verschiedenen Bedingungen gewonnen werden, ermöglicht die Identifizierung spezifischer Veränderungen, wie sie z. B. durch eine Behandlung induziert werden. Lentivirale, vermittelte Zelltransduktion wird durchgeführt, um stabile Zelllinien zu erzeugen, die eine Zwei-Tags-Version (6His und Flag) des Modifikators (Ubiquitin oder ein Ubl wie SUMO1 oder Nedd8) exdrücken. Diese Tags ermöglichen die Reinigung von Ubiquitin und damit von ubiquitinierten Proteinen aus den Zellen. Dies geschieht durch einen zweistufigen Reinigungsprozess: Der erste wird unter Denaturierung von Bedingungen mit dem 6His-Tag und der zweite unter systemeigenen Bedingungen mit dem Flag-Tag durchgeführt. Dies führt zu einer hochspezifischen und reinen Isolierung modifizierter Proteine, die anschließend durch Flüssigchromatographie identifiziert und halbquantifiziert werden, gefolgt von der Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Technologie. Die einfache informatierte Analyse von MS-Daten mit Excel-Software ermöglicht die Erstellung von PTM-Profilen durch eliminierung von Hintergrundsignalen. Diese Profile werden zwischen den einzelnen Bedingungen verglichen, um spezifische Veränderungen zu identifizieren, die dann genauer untersucht werden, beginnend mit ihrer Validierung durch Standard-Biochemie-Techniken.

Einleitung

Die hier vorgeschlagene Methode ist der Untersuchung von PTMs gewidmet, die von Ubiquitin-Familienmitgliedern aus kultivierten Säugetierzellen vermittelt werden, um potenzielle Veränderungen im Zusammenhang mit einer bestimmten Erkrankung (Behandlung, Differenzierung usw.) zu identifizieren. PTM stellen den letzten Schritt der Regulierung der Proteinfunktionen^{dar 1}. In der Tat, einmal von der translationalen Maschinerie produziert, die meisten, wenn nicht alle Proteine unterziehen verschiedene Arten von PTMs, die ihre Aktivität, molekulare Wechselwirkungen und intrazelluläre Lage^{modulieren 1}. Zu den vielen PTMs gehören d....

Protokoll

1. Erzeugung stabiler Zelllinien, die 6His-Flag-Ubl exdrücken

HINWEIS: Ko-Transfektion von HEK-293T-Zellen mit pCCL-6HF-Ubl, pVSVG und Delta-Helper.

1. Tag 0: Samen 293T Zellen in einer 6-Well-Platte, um 50-70% Zusammenfluss am Tag danach zu erhalten.
2. Tag 1: Ko-Transfekte 50-70% konfluente Zellen mit einer Mischung aus 1 g pCCL-6HF-Ubl oder pCCL-GFP, 1 g pVSVG und 1 g Delta-Helper-Vektoren unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes und eines Protokolls für die Lentivirus-Produktion. Nach 6 h Transfektion das Medium in ein frisches zu verändern, das den zu transduzierenden Zellen entspricht. Säen Sie die Zellen, die in ei....

Ergebnisse

Transduktion von Kultur-Säugetierzellen zur Erzeugung von GFP- und 6HF-Ub-exemitten Zellen
Zur Herstellung von Lentiviren, die später zur Transduce von MiaPaCa-2-Zellen verwendet werden, werden 70% konfluente HEK-293T-Zellen mit einer gleichen Menge der drei Vektoren, pCCL-6HF-Ubiquitin oder GFP/Delta-Helper/pvSvG, kotransfiziert. Nach 24 h Produktion wird das Medium, das lentivirale Partikel enthält, zurückgewonnen und gefiltert. An dieser Stelle ist es möglich, die E.......

Diskussion

Wir haben eine robuste und zuverlässige Methodik entwickelt, um Profile von Proteinen zu generieren, die von den wichtigsten Ubiquitin-Familienmitgliedern modifiziert wurden. In der Tat haben wir dieses Protokoll erfolgreich angewendet, um Profile von PTMs durch Ubiquitin, aber auch durch SUMO und Nedd8 zu generieren und Veränderungen im Zusammenhang mit einer Behandlung zu erkennen⁷, als Reaktion auf die Überexpression oder den Knockdown eines bestimmten Gens (Daten nicht und in Zellen, die einen.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	bindet alle Flag-markierten Proteine
anti-Flag M2 Antikörper	Sigma-Aldrich	F3165	zum Nachweis der 6His-Flag-markierten Expression von ub/ubl
Cell strainer 40 & micro; m	Falcon	352350	zur Entfernung von schwimmenden Pellets aus Guanidin-lysierten Zellen
Flaggenpeptid	Sigma-Aldrich	F3290	eluiert markierte Proteine aus Anti-Flaggenkügelchen
Guanidinhydrochlorid	Sigma-Aldrich	50933	chaotropes Mittel zur Denaturierung aller Proteine im Zelllysat
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513	eluiert 6His-Bindungsproteine aus Ni-NTA-Kügelchen
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	zur Transfektion von HEK-293T-Zellen zur Herstellung von Lentiviren
Lobind-Röhrchen	Sigma-Aldrich	Z666491	vermeidet die Aufnahme von Edelmaterial
Membranfilter, 0,45 &μ; m	Millipore	HAWP04700F1	zur Filterung des lentiviralen Überstands
Ni-NTA	Qiagen	30210	des 6His-Tags

Reinigung