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Methodenartikel

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

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⸱

DOI:

10.3791/60434

⸱

13. Dezember 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Pohang University of Science and Technology, 2School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology, 3Asan Institute for Life Science, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, 4Division of Hepato-Biliary and Pancreatic Surgery, Department of Surgery, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, 5Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dezelluläre extrazelluläre Matrix (dECM) kann geeignete mikroökologische Hinweise liefern, um die inhärenten Funktionen von Zielgeweben in einem konstruierten Konstrukt zu rekapitulieren. Dieser Artikel erläutert die Protokolle für die Dezellularisierung von Bauchspeicheldrüsengewebe, die Bewertung von DECM-Bioink aus Bauchspeicheldrüsengewebe und die Generierung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer Bioprinting-Technik.

Zusammenfassung

Die Transplantation von Pankreasinseln ist eine vielversprechende Behandlung für Patienten, die an Typ-1-Diabetes leiden, begleitet von Hypoglykämie und sekundären Komplikationen. Die Inseltransplantation hat jedoch noch einige Einschränkungen, wie z. B. die geringe Lebensfähigkeit transplantierter Inselchen aufgrund schlechter Inselverordnung und feindlicher Umgebungen. Darüber hinaus haben die Insulin produzierenden Zellen, die sich von menschlichen pluripotenten Stammzellen unterscheiden, nur begrenzte Fähigkeit, ausreichende Hormone zu sezernieren, die den Blutzuckerspiegel regulieren können; Daher ist eine Verbesserung der Reifung durch die Kultivierung von Zellen mit geeigneten mikroökologischen Hinweisen dringend erforderlich. In diesem Artikel erläutern wir Protokolle zur Vorbereitung einer pankreasischen, dezellularisierten extrazellulären Matrix (pdECM)-Bioink, um eine vorteilhafte Mikroumgebung zu schaffen, die die Glukoseempfindlichkeit von Pankreasinseln erhöhen kann, die Prozesse zur Erzeugung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer Mikroextrusions-basierten Bioprinting-Technik.

Einleitung

Kürzlich wurde die Pankreas-Islet-Transplantation als vielversprechende Behandlung für Patienten mit Typ-1-Diabetes angesehen. Die relative Sicherheit und minimale Invasivität des Verfahrens sind große Vorteile dieser Behandlung1. Jedoch, Es hat mehrere Einschränkungen wie die geringe Erfolgsrate der isolierenden Inseln und die Nebenwirkungen von immunsuppressiven Medikamenten. Darüber hinaus nimmt die Zahl der eingepfropften Inselchen nach der Transplantation aufgrund der feindlichen Umgebung stetig ab2. Verschiedene biokompatible Materialien wie Alginat, Kollagen, Poly(Milch-Co-Glykolsäure) (PLGA) oder Polyethylenglykol (PEG) wurden bei der Pankreas-Islet-Transplantation angewendet, um diese Schwierigkeiten zu überwinden.

Die 3D-Zelldrucktechnologie entwickelt sich in der Tissue-Engineering aufgrund ihres großen Potenzials und ihrer hohen Leistung. Selbstverständlich sind Bioinks als wichtige Komponenten bekannt, um eine geeignete Mikroumgebung zu schaffen und die Verbesserung zellulärer Prozesse in gedruckten Gewebekonstrukten zu ermöglichen. Eine beträchtliche Anzahl von scherendünnenden Hydrogelen wie Fibrin, Alginat und Kollagen sind weit verbreitet als Bioinks verwendet. Diese Materialien weisen jedoch einen Mangel an struktureller, chemischer, biologischer und mechanischer Komplexität im Vergleich zur extrazellulären Matrix (ECM) im nativen Gewebe3auf. Mikroökologische Hinweise wie die Wechselwirkungen zwischen Inselchen und ECM sind wichtige Signale zur Verbesserung der Funktion von Inselchen. Dezellularisiertes ECM (dECM) kann die gewebespezifische Zusammensetzung verschiedener ECM-Komponenten wie Kollagen, Glycosaminoglycane (GAGs) und Glykoproteine nachbilden. Beispielsweise weisen primäre Inselchen, die ihre peripheren ECMs (z. B. Typ I, III, IV, V und VI Kollagen, Laminin und Fibronectin) behalten, eine geringe Apoptose und eine bessere Insulinempfindlichkeit auf, was darauf hindeutet, dass gewebespezifische Zellmatrix-Wechselwirkungen wichtig sind, um ihre Fähigkeit zu verbessern, ähnlich wie das ursprüngliche Gewebe zu funktionieren4.

In diesem Beitrag erläutern wir Protokolle zur Vorbereitung von Pankreasgewebe-abgeleiteten dezellularisierten extrazellulären Matrix (pdECM) Bioink, um vorteilhafte mikroökologische Hinweise zur Steigerung der Aktivität und Funktionen der Pankreasinseln zu bieten, gefolgt von den Prozessen zur Erzeugung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer mikroextrusionbasierten Bioprinting-Technik (Abbildung 1).

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Protokoll

Schweine-Pankreasgewebe wurden aus einem örtlichen Schlachthof gesammelt. Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Asan Medical Center, Seoul, Korea, genehmigt.

1. Gewebedezellularisierung

  1. Bereiten Sie die Lösungen für die Dezellularisierung vor.
    HINWEIS: 1x phosphatgepufferte Salzsäure (PBS), die in allen Lösungspräparaten verwendet wird, wird durch Zugabe von destilliertem Wasser zu 10x PBS verdünnt.
    1. Für die 1% Triton-X 100 Lösung 100 ml 100% Triton-X 100 Lösung in 900 ml 1x PBS mit einem magnetischen Rührstab mit dem Rühren bei 150 Rpm für 6 h auflösen. Machen Sie 400 ml 1% Triton-X 100 Lösung mit 40 ml 10% Triton-X 100 Lösung und 360 ml 1x PBS kurz vor Gebrauch vorbereitet.
      HINWEIS: Die 10% Triton-X 100 Lösung kann bei Raumtemperatur gespeichert werden, bis sie benötigt wird.
    2. Für die 0,1%ige Peressigsäurelösung 8,5 ml 4,7% Peressigsäure in 22,8 ml 70% Ethanol mit 368,7 ml destilliertem Wasser kurz vor Gebrauch verdünnen.
  2. Entfernen Sie das periphere Gewebe der Bauchspeicheldrüse und schneiden Sie das Gewebe vor der Dezellularisierung.
    1. Waschen Sie die resected Schweinebauchspeicheldrüse mit fließendem Leitungswasser und entfernen Sie das periphere Gewebe mit einer sterilisierten Schere.
    2. Die Bauchspeicheldrüse mit Zangen in eine Plastiktüte geben und bei -80 °C für 1 H einfrieren, um die Bauchspeicheldrüse für den nächsten Schritt effektiv zu schneiden.
    3. Die gefrorene Bauchspeicheldrüse mit einer Reibe in 1 mm dicke Stücke schneiden.
    4. 50 g des geschnittenen Gewebes in einen 500 ml Kunststoffbehälter geben.
      HINWEIS: Ein Kunststoffbehälter mit Deckel wird hier empfohlen, um Gewebe vor Verunreinigungen zu schützen und eine Verdunstung von Lösungen zu verhindern.
  3. Behandlung mit Reagenzien.
    HINWEIS: Der gesamte Dezellularisierungsprozess sollte bei 4 °C an einem digitalen Orbital-Shaker bei 150 Rpm durchgeführt werden. In allen Entzellularisierungsschritten ist eine physische Ablösung mit Zangen erforderlich, um zu verhindern, dass die Scheiben der Bauchspeicheldrüse zusammenkleben. Das Waschen des Behälters mit destilliertem Wasser ist notwendig, um die Restreagenzien vollständig im Behälter zu entfernen.
    1. Waschen Sie vor jeder Reagenzienbehandlung 50 g in Scheiben geschnittene Bauchspeicheldrüse mit 300 ml destilliertem Wasser mit einem Shaker.
    2. Rühren Sie das Gewebe kontinuierlich bei 150 Umdrehungen pro Minute, bis das trübe Wasser verschwindet (nach ca. 12 h). Ersetzen Sie das destillierte Wasser alle 2 h.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, das destillierte Wasser stündlich zu wechseln, um das trübe Wasser schneller zu entfernen.
    3. Entsorgen Sie das Wasser und behandeln Sie die 50 g Gewebe mit 400 ml 1% Triton-X 100 in 1x PBS-Lösung für 84 h. Erfrischen Sie die Lösung alle 12 h.
      HINWEIS: An diesem Punkt nimmt die Menge an Gewebe ab, da die zellulären Komponenten entfernt werden.
    4. Mit 400 ml Isopropanol (IPA) 2 h behandeln, um das restliche Fett aus der Bauchspeicheldrüse zu entfernen.
      HINWEIS: Es ist normal, dass das Gewebe durch die Entfernung von Fett in diesem Prozess hart wird.
    5. Nach 2 h entfernen Sie das IPA und waschen Sie das Gewebe mit 400 ml 1x PBS für 24 h. Erfrischen Sie die 1x PBS alle 12 h.
    6. Um das dezellularisierte Gewebe zu sterilisieren, entsorgen Sie die vorherige Lösung und behandeln Sie mit 400 ml 0,1% Peressigsäure in 4% Ethanol für 2 h.
    7. Um Restwaschmittel zu entfernen, waschen Sie das Gewebe mit 400 ml 1x PBS für 6 h. Erfrischen Sie die Lösung alle 2 h.
    8. Sammeln Sie das dezelluläre Gewebe in einem 50 ml konischen Rohr mit Zangen.
    9. Die Probe bei -80 °C für 1 h einfrieren. Bedecken Sie das konische Rohr mit einem fusselfreien Wisch anstelle des Deckels und fixieren Sie es mit einem Gummiband für eine effiziente Lyophilisierung.
    10. Lyophilisieren Sie das dezellularisierte Gewebe bei -50 °C für 4 d.
      HINWEIS: Für Schritt 1.3 sollten 1 g nicht-dezellularisiertes Gewebe auch unter den gleichen Bedingungen gefriergetrocknet werden.

2. Bewertung von dezellularisiertem Gewebe

ANMERKUNG: Um die Restmenge von dsDNA, Glycosaminoglycans (GAGs) und Kollagen im dezellularisierten Gewebe im Vergleich zu nativem Gewebe zu bewerten, werden mindestens 1 g des nicht-dezellularisierten Gewebes (natives Gewebe) und dezellularisiertes Gewebe für Bewertungscharge. Die Menge an dsDNA, GAGs und Kollagen kann basierend auf dem Trockengewicht des Gewebes berechnet werden.

  1. Bereiten Sie Lösungen für biochemische Assays vor.
    1. Bereiten Sie Papain-Lösung für die Probenverdauung.
      HINWEIS: Die Menge des zu machenden Puffers kann entsprechend der Anzahl der Proben angepasst werden.
      1. 119 mg 0,1 M Natriumphosphat (monobasic), 18,6 mg 0,5 mM Na2-EDTA und 8,8 mg 5 mM Cystein-HCl in 10 ml autoklavem Wasser auflösen.
      2. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 6,5 ein, indem Sie eine 10 M NaOH-Lösung hinzufügen.
      3. Fügen Sie der oben genannten Lösung 125 l von 10 mg/ml Papain-Stammlösung und Wirbel hinzu, sodass sich jedes Element gleichmäßig mischen kann.
    2. Bereiten Sie Lösungen für Dimethyl-Methylen-Blau (DMMB) Assay vor.
      1. Um DMMB-Farbstoff herzustellen, lösen Sie 8 mg 1,9-Dimethyl-Methylenblau-Zinkchlorid-Doppelsalz, 1,52 g Glycin und 1,185 g NaCl in 500 ml autoklavem Wasser auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 3 ein, indem Sie 0,5 M HCl-Lösung hinzufügen, während Sie den wechselkundigen pH-Wert mit einem pH-Meter messen. Filtern Sie diesen dann durch einen 500 ml Flaschen-Staubsauger-Filter.
      2. Machen Sie 15 l von 10 mg/ml Chondroitinsulfat Eine Lösung für Standard.
    3. Bereiten Sie Lösungen für Hydroxyprolin-Assay vor.
      1. Für die Chloramin-Arbeitslösung 2,4 g Natriumacetat, 1 g Zitronensäure und 0,68 g Natriumhydroxid in 24 ml destilliertem Wasser auflösen und 240 l Eisessig, 10 l Toluol und 6 ml IPA hinzufügen.
        HINWEIS: Lösen Sie alle Pulver in Lösung mit einem Wirbelmischer. Chloramin-Arbeitslösung kann bis zu drei Monate bei 4 °C gelagert werden.
      2. Für Chloramin-T-Lösung 0,35 g Chloramin T in 20 ml Chloramin-Arbeitslösung auflösen und 2,5 ml IPA hinzufügen. Vortex, um alle Komponenten zu mischen.
        HINWEIS: Bereiten Sie sich unmittelbar vor der Verwendung vor.
      3. Für P-DAB-Lösung 3,75 g P-DAB in 6,5 ml Perchlorsäure und 15 ml IPA setzen; in Aluminiumfolie einwickeln.
        HINWEIS: Bereiten Sie sich unmittelbar vor der Verwendung vor.
  2. Fügen Sie 1 ml Papainlösung zu 10 mg lyophilisiertem Gewebe in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr hinzu und wirbeln Sie das Rohr, um die Probe besser zu verdauen.
  3. Legen Sie das 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr in ein Gummiregal und verdauen Sie die Proben in einem 500 ml Becher, der 300 ml Wasser bei 60 °C für 16 h enthält.
  4. Zentrifugieren Sie bei 9.500 x g für 20 min, sammeln Sie den Überstand und übertragen Sie ihn in ein neues Rohr.
  5. Quantifizieren Sie die Rest-DNA und die wichtigsten Proteine im dezellularisierten Gewebe.
    1. Laden Sie 1 L der verdauten Probe in das Spektrometer und messen Sie die Menge an dsDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Der Experimentator sollte sein Haar zurückbinden und eine Maske tragen, um eine Kontamination der Probe zu vermeiden.
  6. Führen Sie einen DMMB-Test durch, um die Menge an GAGs zu quantifizieren, die im dezellularisierten Gewebe verbleibt.
    1. Mischen Sie 1 L Chondroitinsulfat A-Lösung und 499 l 1x PBS, um Standards zu bilden. Die Chondroitinsulfat-Lösung Eine Lösung mit destilliertem Wasser in Konzentrationen von 0, 4, 8, 12, 16 und 20 g/ml verdünnen.
    2. Last-Triplicate von 50 l jeder Konzentration des Standards und verdauen Proben in eine 96-Well-Platte.
    3. Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 L des DMMB-Farbstoffs zu jedem Brunnen hinzu.
    4. Lesen Sie sofort die Absorption bei 525 nm auf einem Mikroplattenleser.
  7. Führen Sie einen Hydroxyprolin-Assay durch, um die Kollagenmenge zu quantifizieren.
    1. Um einen Hydroxyprolin-Assay durchzuführen, inkubieren Sie 250 l der verdauten Probe mit gleichen HCl-Volumen bei 120 °C für 16 h.
    2. Trocknen Sie die Rückstände bei Raumtemperatur für 3 h, um die Proben zu kühlen und lösen Sie die Proben dann in 1 ml 1x PBS wieder auf.
    3. Zentrifuge bei 2.400 x g für 10 min bei 4 °C.
    4. Bereiten Sie standardmäßig eine 100-g/ml-Hydroxyprolinlösung vor.
    5. Hydroxyprolinlösung mit destilliertem Wasser in einer Konzentration von 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 g/ml für eine Standardlösung verdünnen.
    6. Last-Triplicate von 50 l Proben und Standardlösung in eine 96-Well-Platte.
    7. Fügen Sie 50 l Chloramin-T-Lösung hinzu und inkubieren Sie dann 20 min bei Raumtemperatur.
    8. Fügen Sie 50 l p-DAB-Lösung hinzu und brüten Sie 30 min bei 60 °C.
      HINWEIS: Aliquot in einem dunklen Raum. Nach der Zugabe die Platte mit Aluminiumfolie umwickeln.
    9. Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
    10. Messen Sie nach dem Abkühlen die Absorption bei 540 nm auf einem Mikroplattenleser.

3. Bioink-Präparation

HINWEIS: pdECM-Pulver kann mindestens ein Jahr lang stabil bei -80 °C gelagert werden. Vor der pH-Einstellung kann die verdaute pdECM-Lösung einen Monat lang bei -20 °C gelagert werden. Vor der Verwendung die Probe der gefrorenen pdECM-Lösung über Nacht bei 4 °C auftauen. Die pH-angepasste pdECM-Lösung kann bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. Die verdaute pdECM-Lösung kann mindestens ein paar Tage bei 4 °C gelagert werden, sollte aber 1 Woche nicht überschreiten.

  1. Das gefriergetrocknete pdECM mit Pepsin verdauen.
    1. Zur effektiven Verdauung von Bioink pulverisieren Sie das lyophilisierte pdECM mit flüssigem Stickstoff mit einem Mörtel und Stößel.
    2. Sammeln Sie 200 mg des pdECM-Pulvers in der 50 ml konischen Röhre und fügen Sie 20 mg Pepsin und 8,4 ml der 0,5 M Essigsäure (Endkonzentration beträgt 2 w/v%).
    3. Den magnetischen Rührstab in das 50 ml kegelförmige Rohr legen und bei 300 U/min 96 h rühren.
  2. Stellen Sie den pH-Wert der verdauten pdECM-Lösung ein.
    HINWEIS: Um eine Gelation vor der pH-Einstellung zu vermeiden, sollte dieser Prozess auf Eis durchgeführt werden.
    1. Filtern Sie die unverdauten Partikel in der pdECM-Lösung mit einem 40-m-Zellsieb mit einer positiven Verdrängungspipette auf Eis heraus, um die optimale Verdauung der Teile zu erhalten.
    2. Fügen Sie 1 ml der 10x PBS und Wirbel vor der Verwendung von NaOH.
    3. Stellen Sie den pH-Wert auf 7 ein, wobei 10 M NaOH den pH-Wert mit pH-Indikatorstreifen überprüft.
      HINWEIS: Wirbel jedes Mal, wenn NaOH hinzugefügt wird, so dass der Bioink gründlich mit den anderen Reagenzien gemischt wird.

4. Rheologische Analyse

  1. Experimentelle Einrichtung
    1. Bereiten Sie die 1,5% (w/v) von pdECM bioink vor, um die rheologischen Eigenschaften zu bewerten.
    2. Richten Sie im ratengesteuerten Modus eines Rheometers eine 20 mm Kegelplattengeometrie (Kegeldurchmesser von 20 mm mit einem Winkel von 2°) ein.
    3. Erstellen Sie experimentelle Sequenzen in der installierten Software (TRIOS), um die Viskosität, Gelationskinetik und den dynamischen Modul des pdECM-Bioinks zu messen.
      1. Viskosität: Legen Sie den pdECM-Bioink auf die Platte. Messen Sie die komplexe Viskosität (Pas) von pdECM bioink unter einer steigenden Scherrate von 1 bis 1.000 s-1 bei einer konstanten Temperatur von 15 °C.
      2. Gelationskinetik: Legen Sie den pdECM-Bioink auf die Platte. Berechnen Sie den komplexen Modul (G*), indem Sie den Speicher- und Verlustmodul von pdECM-Bioink bei 4-37 °C mit einer inkrementellen Steigerungsrate von 5 °C/min (Time-Sweep-Modus) messen.
      3. Dynamischer Modul: Legen Sie den pdECM-Bioink vor der Messung 60 min bei 37 °C auf die Platte. Messen Sie den frequenzabhängigen Speichermodul (G') und den Verlustmodul (G'') des pdECM-Bioinks im Bereich von 0,1-100 rad/s bei 2% Dehnung.

5. 3D-Zelldruck von Pankreasgewebekonstrukten mit einer Islet

  1. Vorbereitung isolierter Inselchen
    1. Isolieren Sie primäre Inselchen von einer Ratte gemäß den Protokollen, die in einem früheren Werk beschrieben wurden5.
    2. Um Trümmer und abgestorbene Zellen von der isolierten Zelle zu trennen, passieren Sie die Zellsuspension durch ein 70 m zelleigenes Sieb. Insellets mit einem Durchmesser von weniger als 70 m gelten als tot oder abnormal.
    3. Die isolierten Inselchen in RPMI-1640 medium aussetzen und auf die Petrischale legen. Entfernen Sie Mit einer P200-Volumenpipette unter dem Mikroskop (4x Objektivlinse) im Biosicherheitsschrank Inselchen mit einem Durchmesser von mehr als 300 m.
  2. Islet-Verkapselung in pdECM-Bioink
    1. Bereiten Sie pH-angepasste pdECM-Bioink und isolierte Islet vor.
      HINWEIS: Um eine Gelation vor der pH-Anpassung zu vermeiden, sollte dieser Prozess auf Eis durchgeführt werden.
    2. Mischen Sie den pdECM-Bioink und die mit Inselchen (Verhältnis 3:1) aufgehängten Medien vorsichtig mit einer positiven Verdrängungspipette, bis sie gleichmäßig vermischt ist.
      HINWEIS: Die Endkonzentration des pdECM-Bioinks beträgt 1,5% und die Zelldichte im pdECM-Bioink 3.000 IEQ/ml.
  3. 3D-Zelldruck von Pankreasgewebekonstrukten
    1. Bereiten Sie eine sterilisierte Spritze und 22 G Düse vor.
      HINWEIS: Dieses Messgerät wurde für den Druck von Inselchen mit einem Durchmesser von 100-250 m ausgewählt.
    2. Mit der Islet beladenen pdECM-Bioink in die Spritze einladen.
    3. Drucken Sie den Bioink mit dem optimierten Druckzustand (Vorschubleistung: 150 mm/min; pneumatischer Druck: 15 kPa) bei 18 °C in Form eines Gitters.
    4. Um den Bioink zu vernetzen, legen Sie das gedruckte Konstrukt 30 min im Inkubator auf.
    5. Tauchen Sie das gedruckte Konstrukt in die Isletkulturmedien ein, die RPMI-1640 Medium sind, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin.

6. 3D-Zelldruck von Bauchspeicheldrüsenkonstrukt mit gemusterter Struktur

  1. Herstellung von zwei Arten des Bioinks
    1. Um die Druckvielfalt mit mehreren Bioinks zu validieren, bereiten Sie zwei Sätze von pdECM-Biotinten vor und färben Sie sie, indem Sie jedem pdECM-Bioink 0,4% Trypan Blue und Rose Bengal Lösung im Verhältnis 1:20 hinzufügen.
      HINWEIS: Um eine Gelation vor der pH-Anpassung zu vermeiden, sollte dieser Prozess auf Eis durchgeführt werden.
    2. Mischen Sie den pdECM-Bioink und die mit Inselchen (Verhältnis 3:1) aufgehängten Medien vorsichtig mit einer positiven Verdrängungspipette, bis sie gleichmäßig vermischt ist.
      HINWEIS: Die Endkonzentration des pdECM-Bioinks beträgt 1,5% und die Zelldichte im pdECM-Bioink 3.000 IEQ/ml.
  2. 3D-Zelldruck von multimaterialbasierten Pankreasgewebekonstrukten
    1. Bereiten Sie sterilisierte Spritzen und eine 25 G Düse vor.
    2. Jeder Bioink (blau und rot) in zwei verschiedene Spritzen geben.
    3. Drucken Sie den Biok mit optimiertem Druckzustand (Vorschubleistung: 150 mm/min; pneumatischer Druck: 15 kPa) bei 18 °C in Form eines Gitters mit abwechselnden Linien von blau und rot.
    4. Um den Bioink zu vernetzen, legen Sie das gedruckte Konstrukt 30 min im Inkubator auf.
    5. Tauchen Sie das gedruckte Konstrukt in Islet Kulturmedien ein, die RPMI-1640 Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin ergänzt sind.

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Ergebnisse

Dezellularisierung von Bauchspeicheldrüsengewebe
Wir haben das Verfahren zur Herstellung von pdECM-Bioink entwickelt, um pankreasgewebespezifische Mikroumgebungen zur Verbesserung der Funktionalität von Inselchen in einem 3D-Biodruckgewebekonstrukt bereitzustellen (Abbildung 2A). Nach dem Dezellularisierungsprozess wurden 97,3 % der dsDNA entfernt und repräsentative ECM-Komponenten wie Kollagen und GAGs blieben bei 1278,1%...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschrieb die Entwicklung von pdECM-Bioinks und die Herstellung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten unter Verwendung von 3D-Zelldrucktechniken. Um die Mikroumgebung des Zielgewebes im 3D-Technischen Gewebekonstrukt zu rekapitulieren, ist die Wahl des Bioinks entscheidend. In einer früheren Studie haben wir validiert, dass gewebespezifische dECM-Bioinks vorteilhaft sind, um die Stammzelldifferenzierung und Proliferation zu fördern10. Im Vergleich zu synthetischen Polymeren kann dECM a...

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Danksagungen

Diese Forschung wurde durch das Bio & Medical Technology Development Program der National Research Foundation (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIT) (2017M3A9C6032067) und dem "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) gefördert wurde. iITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Biologische SicherheitswerkbänkeCRYSTEPURICUBE 1200
TiefkühltruheThermo Scientific Forma957
Digitaler OrbitalschüttlerDAIHAN ScientificDH.
TrockenschrankDAIHAN ScientificWON-155
GefriertrocknerLABCONCO7670540
KühlschrankSANSUNGCRFD-1141
ReibeABM1415605793
Inverse MikroskopeLeicaDMi1
MikrozentrifugeCRYSTEPURISPIN 17R
Mikroplatten-ReaderThermo Fisher ScientificMultiskan GO
Mini-ZentrifugeDAIHAN ScientificCF-5
Multi-Heizplatten-RührerDAIHAN ScientificSMHS-6
NanodropThermo FisherScientific ND-LITE-PR
PH-TischmessgerätThermo Fisher ScientificSTARA2110
RheometerTA InstrumentDiscovery HR-2
Vortex-MischerDAIHAN ScientificVM-10
Cirurgical Instruments
Operating ScissorsHiroseHC.13-122
ForcepKorea Ace ScientificHC.203-30
Materials
1,7 mL MikrozentrifugenröhrchenAxygenMCT-175-C
10 ml GlasfläschchenScilabSL. VI1243
40 &Mikro; m ZellensiebFalcon352340
5 L BecherDong Sung ScienceSDS 2400
50 mL CornicalTube Falcon352070
500 mL BecherglasKorea Ace ScientificKA.23-08
500 mL Flaschenaufsatz-VakuumfilterCorning431118
500 mL KunststoffbehälterLOCK& LOCKINL301
96well PlatteFalcon353072
AluminiumfolieDAEKYO
KimwipeKimtech
MagnetstangeKorea Ace ScientificBA.37110-0003
Mörser und StößelDAIHAN ScientificSC. MG100
MehrkanalpipetteEppendorf4982000314
PetrischaleSPL10100
pH-IndikatorstreifenSigma-Aldrich1095350001
Sieb FiltergewebeDAIHAN Scientific
Dezellularisation
10x pbsHycloneSH30258.01
4,7 % PeressigsäureOmegafarm
70 % EthanolSAMCHUN CHEMICALSE0220 SAM
Destilliertes Wasser
IPASAMCHUN CHEMICALSsamchun I0348
Triton-X 100BiosesangT1020
Biochemischer Assay
1,9-Dimethyl-Methylenblau, Zinkchlorid, DoppelsalzSigma-Aldrich341088
NaOHBiosesangS2018
Chloramin TSigma-Aldrich,857319
Chondroitinsulfat, A, Sigma-AldrichC4384
Zitronensäure, Supelco46933
Cysteine-HClSigma-AldrichC1276
EisessigsäureMerok100063
GlycinSigma-Aldrich410225
HClSigma-AldrichH1758
Na2-EDTASigma-AldrichE5134
NaClSAMCHUN CHEMICALSS2097
PapainSigma-Aldrichp4762
P-DABSigma-AldrichD2004
PerchlorsäureSigma-Aldrich311421
NatriumacetatSigma-AldrichS5636
NatriumhydroxidSupelcoSX0607N
Natriumphosphat (einbasisch)Sigma-AldrichRDD007
ToluolSigma-Aldrich244511
Bioink
charakterisiert FBS HycloneSH30084.03
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
PepsinSigma-AldrichP7215
Rose bengalSigma-Aldrich198250
RPMI-1640mittel Thermo FisherScientific 11875093
Trypanblau LösungSigma-AldrichT8154
WSO04010, 10 N, , , , ,

Referenzen

  1. Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268(2017).
  2. Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
  3. Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
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