Hier präsentieren wir eine Methode mit durchlässigen Membranstützen, um die Untersuchung der berührungslosen Parakrinsignalisierung zu erleichtern, die von Tumorzellen verwendet wird, um die Immunantwort zu unterdrücken. Das System ist für die Untersuchung der Rolle von tumorsezerseten Faktoren bei der Dämpfung der Makrophagenaktivierung geeignet.
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Methodenartikel
Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die tumorabgeleitete Parakrinsignalisierung ist eine übersehene Komponente der lokalen Immunsuppression und kann zu einer freizügigen Umgebung für anhaltendes Krebswachstum und Metastasierung führen. Parakrine Signale können Zell-Zell-Kontakt zwischen verschiedenen Zelltypen beinhalten, wie PD-L1 auf der Oberfläche von Tumoren, die direkt mit PD-1 auf der Oberfläche von T-Zellen interagieren, oder die Sekretion von Liganden durch eine Tumorzelle, um eine Immunzelle zu beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur-Methode, um die Auswirkungen von tumorsezerseligierten Liganden auf die Aktivierung von Immunzellen (Makrophagen) abzufragen. Dieses einfache Verfahren verwendet handelsübliche 0,4 m Polycarbonat-Membran-permeable Stützen und Standard-Gewebekulturplatten. Dabei werden Makrophagen in der oberen Kammer und Tumorzellen in der unteren Kammer kultiviert. Das Vorhandensein der 0,4-mm-Barriere ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Signalisierung ohne die verwirrende Variable des physikalischen Kontakts, da die beiden Zelltypen das gleiche Medium und die Exposition gegenüber parakrinen Liganden aufweisen. Dieser Ansatz kann mit anderen kombiniert werden, wie genetische Veränderungen der Makrophagen (z. B. Isolierung von genetischen Knock-out-Mäusen) oder Tumor (z. B. CRISPR-vermittelte Veränderungen), um die Rolle bestimmter abgesonderter Faktoren und Rezeptoren zu untersuchen. Der Ansatz eignet sich auch für molekularbiologische Standardanalysen wie quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Western Blot-Analyse, ohne dass eine Flusssortierung erforderlich ist, um die beiden Zellpopulationen zu trennen. Enzymgebundene Immunsorbent-Assays (ELISAs) können ebenfalls verwendet werden, um abgesonderte Liganden zu messen, um die dynamische Wechselwirkung der Zellsignalisierung im Kontext des Multiple-Zell-Typs besser zu verstehen. Die Dauer der Kokultur kann auch für das Studium zeitlich regulierter Ereignisse variiert werden. Diese Co-Kultur-Methode ist ein robustes Werkzeug, das das Studium von tumorseften Signalen im Immunkontext erleichtert.
Einleitung
Jüngste Studien haben sich auf die Fähigkeit von Krebszellen konzentriert, den Nachweis durch Immunzellen zu vermeiden, die lokale Immunaktivierung zu unterdrücken oder ein tolerogenes tumorpermissives Milieu in der Tumormikroumgebung zu produzieren. Es wurden zwei große Klassen von Tumor- und Immunzellinteraktionen beschrieben, die diese Effekte erleichtern: kontaktvermittelte Wechselwirkungen oder tumorsekrete Liganden. Einer der am besten untersuchten und klinisch traktierbaren Mechanismen der kontaktvermittelten Immunhemmung, die von Tumoren genutzt werden, ist die Expression von PD-L1, die mit PD-1 auf T-Zellen interagiert, um ihre Aktivierung und Funktion zu hemmen1,2. Als Reaktion auf Interferon-Gamma (IFN), das durch eine Reihe von aktivierten Immunzellen exprimiert wird, können Tumorzellen die Expression von PD-L1 erhöhen, um die Erschöpfung von PD-1-exprimierenden aktivierten T-Zellen zu induzieren, wodurch sie daran gehindert werden, Tumorzellen effektiv auszurotten3. Die Verwendung von Antikörpern, um die Wechselwirkung zwischen PD-L1 und PD-1 zu blockieren, wird derzeit zur Behandlung mehrerer Krebsarten beim Menschen verwendet4. Angesichts dieses klinischen Erfolgs und anderer, die Identifizierung und Ausrichtung von Tumor-abgeleiteten immunsuppressiven Mechanismen hat zunehmende Aufmerksamkeit erhalten.
Über die Unterdrückung der adaptiven Immunität hinaus sind Tumore auch dafür bekannt, Faktoren zu sezernieren, die die entzündungshemmenden Reaktionen angeborener Immunzellen unterdrücken. Tumor-abgeleitete oder tumorinduzierte Sekrete, einschließlich IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, und Kolonie stimulierende Faktor (CSF-1), haben gezeigt, antitumor-Antworten von natürlichen Killer (NK) Zellen, Granulozyten, und dendritischen Zellen in der Tumor-Mikroumgebung5,6,7hemmen. Tumorzellen können auch Faktoren absondern, die die Rekrutierung und Differenzierung von myeloiden Zellen in der Tumormikroumgebung verzerren, um die Unterdrückung der T-Zellaktivierung zu fördern8,9.
Eine Art von angeborenen Immunzelle, die eine tiefgreifende Wirkung auf die Tumorprogression hat, ist die Makrophagen. Seit vielen Jahren wird das Vorhandensein von tumorassoziierten Makrophagen (TAMs) als negative Prognose für das Überleben des Patienten10verwendet. Das Konzept, dass immunsuppressive TAMs die immunzellvermittelte Clearance von Tumoren dämpfen, wurde vor mehr als 40 Jahren eingeführt11. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass die Makrophagen-Pro-Entzündungsreaktion herunterreguliert werden kann, während ein Pro-Tumor-Phänotyp in der Tumormikroumgebung induziert werden kann. Diese immunsuppressiven Makrophagen können zu einer tolerogenen Reaktion beitragen, die die Tumorprogression und Die Resistenz gegen Chemo- und Immuntherapie12antreibt. Angesichts der Tatsache, dass Makrophagen oft eine der häufigsten Leukozyten mit dem Tumor sind, stellt die Wiederherstellung ihrer tumorspezifischen Immunaktivität ein potenzielles Ziel für Krebstherapeutikadar 13.
Während kontaktvermittelte Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Makrophagen durch direkte Kokultur modelliert werden können, kann der Einsatz durchlässiger Membranstützen aufklären, welche tumorsekretierten Faktoren immunmodulatorisch sind, ohne den potenziell verwirrenden Einfluss des Tumor-Immunzell-Zellkontakts. Mit etwas ähnlichen Methoden haben andere das Potenzial der Identifizierung von sezernierten Faktoren in Mikroglia/neuronalen Wechselwirkungen14 sowie Tumorzellen mit Mesothelzellen15gezeigt. Wir haben diese Co-Kultur-Technik auch erfolgreich eingesetzt, um die Rolle eines tumorsekretierten Proteins, Pros1, als Unterdrücker der pro-inflammatorischen Genexpression nach der Stimulation von peritonealen Makrophagen mit LPS und Interferon-gamma16zu charakterisieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die verwendet werden kann, um zu hinterfragt, wie tumorsekrete Faktoren die Makrophagenaktivierung beeinflussen können.
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Protokoll
Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Ernte und Verwendung von murinen Peritonealmakrophagen wurden an der University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) durchgeführt und vom UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. Makrophagenkultur
HINWEIS: Bei diesem Verfahren können primäre peritoneale Makrophagen (siehe unten im Detail), knochenmarkabgeleitete Makrophagen oder Makrophagenzelllinien wie J774 (ATCC) oder RAW264 (ATCC) verwendet werden.
- Ernte peritoneale Makrophagen wie zuvor beschrieben16,17 und Platte direkt in die obere Kammer(n) einer 0,4 m Polyestermembran einfügen Co-Kultur 6 WellPlatte (Abbildung 1A).
ANMERKUNG: Die ungefähre Ausbeute von Makrophagen aus jeder Isolierung beträgt 1 x 106 Zellen insgesamt, so dass die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Bohrkörper 1,5–1,6 x 105 Zellen in einer 6-Well-Platte beträgt. - Kultur die geernteten Makrophagen in Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x Penicillin/Streptomycin, 20 ng/mL Makrophagenkolonie stimulierender Faktor (M-CSF) für 3 Tage bei 37 °C, 5% CO2.
ANMERKUNG: Die obere Kammer enthält 1 ml Kulturmedium, während die untere Kammer mit 1,5 ml gefüllt ist. Das Medium muss jeder Kammer hinzugefügt werden.
2. Kokultur von Tumorzellen mit Makrophagen
- Vor der Anwendung, Kultur kommerziell erhältlich Tumorzellen in ihrem jeweiligen Medium nach ATCC-empfohlenen Gewebekultur-Methoden.
- Anhängsige Tumorzellen einmal mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) waschen, 0,05% Trypsin + Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzufügen und bei 37 °C brüten, bis sich die Zellen lösen. Setzen Sie die Zellen in FBS, die medium enthalten, wieder aus, quantitieren Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler und zentrieren Sie dann für 5 min bei 220 x g pellet.
- Während der Zentrifugation das Medium aus den oberen und unteren Kammern der makrophagenhaltigen durchlässigen Membranträgerplatten ansaugen und durch frisches Medium ersetzen.
- Für niedrigere Kammern, in denen Tumorzellen plattiert werden, füllen Sie mit 1 ml Medium statt 1,5 ml, um ein ausreichendes Volumen für die Zellzugabe zu ermöglichen.
- Aspirieren Sie Daseinspirieren von pelletierten Tumorzellen und Resuspendzellen in DMEM/F12 mit 10% FBS, 1x Penicillin/Streptomycin und 20 ng/ml M-CSF in einer Konzentration von 3 x 105 Zellen/ml.
- Fügen Sie 0,5 ml von 3 x 105 Zellen/ml Tumorzellen in die untere Kammer der gewünschten Brunnen ein (Abbildung 1B).
HINWEIS: Zellen können sofort behandelt werden.
3. Behandlung von ko-kultivierten Zellen
- Um die pro-inflammatorische Genexpression der Makrophagen zu induzieren, behandeln Sie singly oder co-cultured Makrophagen, indem Sie 100 ng/mL IFN und 50 ng/ml LPS hinzufügen.
- Variieren Sie die Dauer der Behandlungszeiten in der Kultur nach Bedarf. Die Makrophagenaktivierung erfolgt innerhalb von 2 h und einige tumorvermittelte Unterdrückung enden durch 8 h. Co-Kultur für 24 h ergibt eine robuste und konsistente tumorabgeleitete Unterdrückung.
HINWEIS: Alternativ können Makrophagen durch Zugabe von Faktoren wie Interleukin-10 (IL10) und der Wirkung des tumorseften Liganden zur Annahme eines pro-wundheilenden Phänotyps induziert werden.
- Variieren Sie die Dauer der Behandlungszeiten in der Kultur nach Bedarf. Die Makrophagenaktivierung erfolgt innerhalb von 2 h und einige tumorvermittelte Unterdrückung enden durch 8 h. Co-Kultur für 24 h ergibt eine robuste und konsistente tumorabgeleitete Unterdrückung.
- Als negativer Kontrolle, Kultur Makrophagen singly und lassen unbehandelt. Behandeln Sie als Positivkontrolle singly kultivierte Makrophagen mit 100 ng/mL IFN und 50 ng/ml LPS.
4. Nachgelagerte Analyse von ko-kultivierten Zellen
- Nachdem die gewünschte Inkubationszeit verstrichen ist, isolieren Sie das Zelllysat oder konditionierte Kulturmedium je nach Testbedarf nach Belieben.
- Um das Zelllysat für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu isolieren, die Medien aus beiden Kammern des Brunnens zu aspirieren und einmal mit 2 ml PBS zu waschen. Tragen Sie den RNA-Lysepuffer auf die obere Kammer auf, die die Makrophagen enthält. Kratzen Sie die Membran vorsichtig, um das Zelllysat freizusetzen, und übertragen Sie es zur Weiterverarbeitung gemäß dem Protokoll des Herstellers des RNA-Isolationskits in ein Sammelrohr.
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Ergebnisse
Um die Wirkung von tumorsezerseten Liganden auf die Makrophagenpolarisation zu bestimmen, wurde das beschriebene Verfahren verwendet. Peritoneale Makrophagen, die in Abwesenheit von Tumorzellen kultiviert wurden, wurden als negative (unbehandelt = ganz links) und positive (IFN- und LPS-stimulierte =2. von links) Kontrollen verwendet (Abbildung 2A). Alternativ wurden peritoneale Makrophagen mit B16F10 Melanom-Tumorzellen (ATCC) kokultiviert (Abbildung 1A
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Diskussion
Der hier vorgestellte Co-Kultur-Assay ist eine Modifikation von zuvor etablierten Assays, die die Untersuchung von tumorsekretierten Faktoren bei der Aktivierung von Immunzellen ermöglicht. Während Zell-Zell-Kontakt bekannt ist, Veränderungen in der Immunaktivität zu induzieren, ist die Fähigkeit von tumor-sezertierten Liganden, die Immunaktivierung zu modulieren, weniger gut verstanden. Wir beschreiben eine Methode, die im Gegensatz zur direkten Co-Kultur verwendet werden kann, um zu hinterfragt, wie tumorabgeleitete ab...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Eric Ubil wurde zum Teil vom American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB) finanziert. Die Arbeit wurde durch ein Stipendium des NIH (R01-CA205398) und einen Breast Cancer Research Foundation Award (BCRF-18-041) an DIE HSE unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA-Synthesekit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 Medien | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fötales Rinderserum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharide aus Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Maus M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 Pros1 | |
| ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC ATCC TIB-71 | ||
| Rekombinante Maus IFN&gamma | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX Kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable Stützen | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
Referenzen
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- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
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- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
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Nachdrucke und Genehmigungen
