Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

Kelly Pittman; Shelton Earp; Eric Ubil

doi:10.3791/60453

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Methodenartikel

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

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DOI:

10.3791/60453

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28. November 2019

Kelly Pittman¹ , Shelton Earp¹ , Eric Ubil²

¹Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, ²O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode mit durchlässigen Membranstützen, um die Untersuchung der berührungslosen Parakrinsignalisierung zu erleichtern, die von Tumorzellen verwendet wird, um die Immunantwort zu unterdrücken. Das System ist für die Untersuchung der Rolle von tumorsezerseten Faktoren bei der Dämpfung der Makrophagenaktivierung geeignet.

Zusammenfassung

Die tumorabgeleitete Parakrinsignalisierung ist eine übersehene Komponente der lokalen Immunsuppression und kann zu einer freizügigen Umgebung für anhaltendes Krebswachstum und Metastasierung führen. Parakrine Signale können Zell-Zell-Kontakt zwischen verschiedenen Zelltypen beinhalten, wie PD-L1 auf der Oberfläche von Tumoren, die direkt mit PD-1 auf der Oberfläche von T-Zellen interagieren, oder die Sekretion von Liganden durch eine Tumorzelle, um eine Immunzelle zu beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur-Methode, um die Auswirkungen von tumorsezerseligierten Liganden auf die Aktivierung von Immunzellen (Makrophagen) abzufragen. Dieses einfache Verfahren verwendet handelsübliche 0,4 m Polycarbonat-Membran-permeable Stützen und Standard-Gewebekulturplatten. Dabei werden Makrophagen in der oberen Kammer und Tumorzellen in der unteren Kammer kultiviert. Das Vorhandensein der 0,4-mm-Barriere ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Signalisierung ohne die verwirrende Variable des physikalischen Kontakts, da die beiden Zelltypen das gleiche Medium und die Exposition gegenüber parakrinen Liganden aufweisen. Dieser Ansatz kann mit anderen kombiniert werden, wie genetische Veränderungen der Makrophagen (z. B. Isolierung von genetischen Knock-out-Mäusen) oder Tumor (z. B. CRISPR-vermittelte Veränderungen), um die Rolle bestimmter abgesonderter Faktoren und Rezeptoren zu untersuchen. Der Ansatz eignet sich auch für molekularbiologische Standardanalysen wie quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Western Blot-Analyse, ohne dass eine Flusssortierung erforderlich ist, um die beiden Zellpopulationen zu trennen. Enzymgebundene Immunsorbent-Assays (ELISAs) können ebenfalls verwendet werden, um abgesonderte Liganden zu messen, um die dynamische Wechselwirkung der Zellsignalisierung im Kontext des Multiple-Zell-Typs besser zu verstehen. Die Dauer der Kokultur kann auch für das Studium zeitlich regulierter Ereignisse variiert werden. Diese Co-Kultur-Methode ist ein robustes Werkzeug, das das Studium von tumorseften Signalen im Immunkontext erleichtert.

Einleitung

Jüngste Studien haben sich auf die Fähigkeit von Krebszellen konzentriert, den Nachweis durch Immunzellen zu vermeiden, die lokale Immunaktivierung zu unterdrücken oder ein tolerogenes tumorpermissives Milieu in der Tumormikroumgebung zu produzieren. Es wurden zwei große Klassen von Tumor- und Immunzellinteraktionen beschrieben, die diese Effekte erleichtern: kontaktvermittelte Wechselwirkungen oder tumorsekrete Liganden. Einer der am besten untersuchten und klinisch traktierbaren Mechanismen der kontaktvermittelten Immunhemmung, die von Tumoren genutzt werden, ist die Expression von PD-L1, die mit PD-1 auf T-Zellen interagiert, um ihre Aktivierung und Funktion zu hem....