Summary
Questo documento descrive i protocolli di valutazione della risposta Tfh e GC B nel modello di topo di infezione da virus influenzale.
Abstract
Le cellule T Follicular Helper (Tfh) sono un sottoinsieme indipendente di cellule CD4+ T specializzato nel fornire aiuto per lo sviluppo del centro germinale (GC) e la generazione di anticorpi ad alta affinità. Nell'infezione da virus influenzale, le risposte robuste delle cellule Tfh e GC B sono indotte a facilitare un'efficace eradicazione del virus, che conferisce un modello di topo qualificato per lo studio associato a Tfh. In questo documento, abbiamo descritto i protocolli nel rilevamento della risposta immunitaria associata a Tfh di base durante l'infezione da virus influenzale nei topi. Questi protocolli includono: inoculazione intranasale del virus influenzale; colorazione citometrica a flusso e analisi di cellule Tfh policlonali e antigene specifiche, cellule GC B e cellule plasmatiche; individuazione dell'immunofluorescenza dei TC; saggio immunoassorbente legato all'enzima (ELISA) dell'anticorpo specifico del virus influenzale nel siero. Questi test quantificano fondamentalmente la differenziazione e la funzione delle cellule Tfh nell'infezione da virus influenzale, fornendo così aiuto per studi nel meccanismo di differenziazione e nella strategia di manipolazione.
Introduction
Nell'ultimo decennio, numerosi studi si sono concentrati sul sottoinsieme di cellule CD4+ T appena identificato, sottoinsieme cellulare Tfh, per i suoi ruoli essenziali nello sviluppo del centro germinale (GC) B. Il linfoma a cellule B 6 (Bcl6), che è principalmente considerato come repressore genico, è il fattore che definisce il lignaggio delle cellule Tfh per la prova che l'espressione ectopica di Bcl6 è sufficiente per guidare la differenziazione Tfh mentre la carenza di Bcl6 si traduce in una differenziazione Tfhscomparsa 1,2,3. A differenza di altri sottoinsiemi di helper CD4+ T che eseguono la loro funzione di effettore tramite migrazione verso i siti di infiammazione, le cellule Tfh forniscono l'aiuto della cellula B principalmente nella zona follicolare delle cellule B di milza e linfonodo. Le molecole co-stimolanti ICOS e CD40L, svolgono un ruolo significativo nell'interazione tra cellule Tfh e GC B. Durante la differenziazione Tfh, L'ICOS trasmette i segnali necessari dalle cellule B affini e agisce anche come recettore che riceve segnali di migrazione da cellule B passanti per la localizzazione della zona cellulare B4,5. CD40L è un mediatore di segnali provenienti dalle cellule Tfh per la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule B6. Un altro fattore che gioca il ruolo simile a CD40L è la citochina IL21, che è principalmente secreta dalle cellule Tfh. IL21 regola direttamente lo sviluppo e la produzione di cellule GC B di anticorpi ad alta affinità, ma il suo ruolo nella differenziazione Tfh èancora controverso 7,8. Pd-1 e CXCR5, che sono ora più frequentemente utilizzati nell'identificazione delle cellule Tfh nell'analisi della citometria del flusso, svolgono anche ruoli significativi nella differenziazione e nella funzione di questo sottoinsieme. CXCR5 è il recettore della chemiochina follicolare cellulare B e media la localizzazione delle cellule Tfh nei follicoli cellulari B9. Pd-1 è ora identificato non solo per avere la funzione di guida follicolare, ma anche trasmettere segnali critici nel processo di maturazione dell'affinità delle cellule GC B10. Sulla base di questi risultati, valutare l'espressione di queste molecole potrebbe fondamentalmente riflettere la maturazione e la funzione delle cellule Tfh.
Il GC è una struttura microanatomica transitoria indotta negli organi linfoidi secondari e altamente dipendente dalle cellule Tfh, essendo così una lettura perfetta per valutare la risposta di Tfh. In GC, dopo aver ricevuto segnali mediati da citochine e molecole co-stimolanti, le cellule B sono soggette a commutazione di classe e ipermutazione somatica per generare anticorpi adalta affinità 11. La commutazione differenziale della classe di anticorpi avviene nella nicchia differenziale della citochina, in cui IL4 e IL21 inducono la commutazione di classe IgG1 mentre IFNγ induce la commutazione di classe IgG212. Le cellule plasmatiche sono i produttori di anticorpi secreti e sono cellule differenziate terminalemente. Come le cellule Tfh, lo sviluppo di cellule B in GC è associato all'espressione dinamica di molte molecole significative. Sulla base dello studio attuale, le cellule GC B possono essere identificate come cellule B220+PNA+Fas+ o B220+GL7+Fas+ e cellule plasmatiche, rispetto ai loro precursori, espressione di downregolato di B220 e upregolazione espressione CD13813. Inoltre, entrambe queste caratteristiche possono essere rilevate nella citometria del flusso e nell'analisi dell'immunofluorescenza, essendo quindi un'adeguata valutazione della risposta gc.
Risposte cellulari e umoriali robuste sono indotte nell'infezione da virus influenzale, con cellule Tfh e Th1 che dominano la risposta cellulare CD4+ T14, il che lo rende un modello perfetto per lo studio di differenziazione delle cellule Tfh. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), che è un ceppo comunemente usato adattato al topo, è frequentemente usato in questostudio 14,15,16. Qui descriviamo alcuni protocolli di base del saggio Tfh rilevante per lo studio nell'infezione da virus influenzale: 1) inoculazione intranasale del virus PR8; 2) cellule Tfh specifiche dell'antigene, cellule GC B e plasma e rilevamento IL21 con citometria a flusso; 3) visualizzazione istologica del GC; 4) rilevazione di formicolio anticorpale specifico dell'antigene nel siero con ELISA. Questi protocolli forniscono le tecniche necessarie per i nuovi ricercatori nello studio associato a Tfh.
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Protocol
Esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Institut Pasteur di Shanghai, Cina. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti sulla base dei protocolli animali approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
NOTA: L'infezione da virus dei topi e l'isolamento degli organi devono essere eseguiti in condizioni ABSL2.
1. Inoculazione del virus dell'influenza PR8 e registrazione del peso dei topi
- Preparare topi C57BL/6 maschi di 8 settimane per l'infezione nella stanza ABSL2.
NOTA: Questo protocollo è adatto anche in esperimenti con topi femmine. - Diluizione del virus PR8:esegnare il virus dal congelatore -80 °C e incubare sul ghiaccio fino a quando non si scioglie in liquido. Vortice il virus stock accuratamente e diluire il virus a 2 PFU/μL con soluzione salina sterile tamponata da fosfati (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) in un tubo pre-refrigerato da 1,5 ml.
-
Anestesia dei topi: pesare ogni topo e calcolare il volume (4 volte (μL) del peso del topo (g)) del pentobarbital di sodio (2 mg/mL) da utilizzare. Iniettare il volume calcolato di pentobarbital di sodio intraperitoneale.
NOTA: Questo passaggio è quello di far respirare i topi in modo costante e pacifico, in modo che un titolo accurato di virus possa essere inoculato per via intranasale. Battiti cardiaci troppo veloci o lenti indicano un'anestesia inappropriata. Inoltre, si consiglia l'uso di unguento veterinario per evitare secchezza degli occhi. - Inoculazione intranasale:vortice del virus PR8 diluito accuratamente. Pipetta 10 μL ed eseguire con attenzione l'inoculazione intranasale su un lato goccia a goccia. Dopo aver terminato l'inoculazione di tutti i topi in una gabbia (massimo 5 topi) su questo lato, ripetere l'inoculazione dall'altra parte (mantenere la respirazione del topo pacifica e costante per tutta l'inoculazione). Ogni topo è infettato da 40 PFU di virus PR8 in totale.
- Posizionare i topi in recumbency sternale in gabbie calde per una migliore rinascita.
- Monitorare il peso del mouse ogni giorno per 10 giorni. (Il giorno dell'infezione è registrato come Giorno 0).
2. Isolamento dei linfociti dalla milza e dal linfonodo mediastino (mLN)
- Eutanasia del topo:mettere i topi in una piccola camera ed eutanasiare i topi pompando in CO2 pacificamente dal fondo della camera. Eseni i topi quando non si muovono ed eseguono la lussazione cervicale per assicurarti che i topi muoia completamente. Immergere i topi con il 75% di etanolo e trasferirli nella cappa di biosicurezza.
- Immobilizzare i topi con aghi di dissezione sulla piastra di schiuma di dissezione ricoperta di carta assorbente. Tagliare la pelle lungo la linea mediana addominale e le zampe posteriori con le forbici di dissezione e allungare la pelle con una pinzetta. Immobilizzare la pelle tesa con aghi di dissezione.
- Preparare due piatti da 6 cm per ogni topo e tenerli sul ghiaccio. Mettere un colino cellulare da 70 μm in ogni piatto e aggiungere 5 mL di DMEM integrato con siero bovino fetale all'1% (DMEM (1% FBS))
- Isolamento della milza: tagliare il peritoneo per esporre la cavità addominale con forbici di dissezione. Prendi la milza e mettila nel piatto preparato.
- isolamento mLN: tagliare il diaframma e il fondo della costola della gabbia in prossimità del timo. Tirare da parte la costola e pernirla con aghi di dissezione per esporre la cavità toracica. Tirare il polmone da parte sul lato destro e utilizzare una pinzetta per prendere mLN, sotto il cuore e vicino al lato ventrale della trachea.
- Mettere il mLN nel piatto preparato.
- Ottenere le sospensioni a cella singola: intrecciare delicatamente la milza o il mLN con uno stantuffo di siringa da 3 ml attraverso il filtro cellulare da 70 μm. Risciacquare il filtro cellulare con 1 mL di DMEM fresco (1% FBS). Rimospendare la sospensione cellulare e trasferirlo in un tubo di centrifuga da 15 ml.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 6 min a 4 °C. Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di DMEM (1% FBS).
- Resuspend il pellet di cella con 1 mL-pipetta accuratamente. Aggiungere 4 mL di DMEM (1% FBS) nelle sospensioni cellulari di milza e mantenerle sul ghiaccio per le seguenti operazioni.
NOTA: È necessario rimospendare il pellet cellulare con 1 mL di mezzo in primo luogo, non 5 mL, per isolare completamente singole celle dal pellet.
Da questo passaggio in poi, tutte le operazioni possono essere eseguite nel laboratorio normale. -
Conteggio celle milza
- Rimospendare le celle ruotando i tubi su e giù per più volte. Assumere 10 μL in 90 μL di tampone dilisi dei globuli rossi (RBC) (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 155mM NH4Cl). Incubare a temperatura ambiente (RT) per 3 minuti e aggiungere 900 μL di PBS freddo per terminare la reazione.
- Centrifugare a 400 x g per 6 min a 4 °C e rimuovere il supernatante. Resuspend con 100 μL di PBS freddo. Prendere 10 μL di cellule in 10 μL dello 0,4% w/v trypan blu e togliere 10 μL dalla miscela per il conteggio cellulare con l'emocitometro.
- Calcolo: calcolare le celle come metodo regolare. In breve, contare i numeri di cella in due quadrati d'angolo diagonali sull'emocitometro e ottenere N1, N2 per ogni quadrato d'angolo. La concentrazione cellulare della sospensione cellulare da 5 mL deve essere calcolata come (N1+N2)/2 x 104/mL.
3. Immunostaining di cellule Tfh policlonali con PD-1 e CXCR5
- Colorazione con anticorpo biotina-anti-CXCR5.
- Resuspend sospensioni cellulari ruotando il tubo su e giù. Prendere 2 x 106 celle nel tubo FACS e aggiungere 2 ml di tampone di colorazione (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). Lavare con vortice sul dispositivo di oscillazione del vortice.
- Centrifuga a 350 x g per 6 min a 4 °C. Scartare il supernatante versando il liquido e immergere due volte la bocca del tubo sulla carta assorbente.
- Allentare il pellet cellulare con il liquido residuo toccando il fondo del tubo. Mettere il tubo nel supporto del tubo sul ghiaccio.
NOTA: Il volume del liquido residuo è di circa 25 μL. - Aggiungere 0,2 μL di CD16/CD32 (blocco del recettore Fc) anti-mouse per ogni tubo. Vortice toccando delicatamente il fondo del tubo e incubando sul ghiaccio per 10 minuti.
NOTA: Preparare la miscela di anticorpi per più campioni per diluizione con 5μL di tampone di colorazione per ciascun tubo. La ricetta per la miscela deve essere preparata per diluito (n/10+1) x blocco del recettore Fc da 0,2 μL in (n/10+1) x 5 μL tampone di colorazione e aggiungere una miscela di 5,2 μL in ogni tubo. - Aggiungere 0,3 μL di biotina-anti topo CXCR5 nel residuo 30 μL del tampone di colorazione per ciascun tubo e vortice toccando il fondo del tubo.
NOTA: Preparare la miscela come descritto al passaggio 3.1.4. - Incubare sul ghiaccio per 1 h con cellule che rimospendenti delicatamente toccando il tubo a 30 minuti.
NOTA: Vortice a 30 min è quello di evitare aggregati cellulari per una migliore colorazione. - Aggiungere 2 mL di tampone di colorazione e vortice sul dispositivo di oscillazione del vortice. Centrifugare a 350 x g per 6 min a 4 °C e scartare il supernatante come descritto al passaggio 3.1.2. Vortice toccando il tubo e incubando sul ghiaccio per la successiva colorazione.
- Colorazione con altri marcatori di superficie.
- Preparare la miscela di anticorpi(tabella 1)come descritto al passaggio 3.1.4.
- Aggiungere la miscela di anticorpi in ogni tubo. Vortice toccando il fondo del tubo e incubando sul ghiaccio per 30 minuti.
- Lavare le celle con 2 mL di tampone di colorazione. Centrifuga a 350 x g per 6 min a 4 °C.
- Scartare il supernatante e aggiungere 400 μL di tampone di colorazione. Vortice il tubo sul dispositivo di oscillazione del vortice e mantenere il tubo in buio fino all'analisi della citometria del flusso.
4. Immunostaining delle cellule Tfh specifiche del virus dell'influenza PR8 NP
NOTA: Questo protocollo di colorazione delle cellule Tfh specifiche di NP proviene da studiprecedenti 15,17.
- Eseguire la colorazione biotina-CXCR5 come descritto al passaggio 3.1, tranne per il fatto che il numero di cellule prelevate per la colorazione è 3 x 106 per registrare abbastanza cellule specifiche dell'antigene nella citometria del flusso.
- Aggiungere 0,3 μL di tetramero APC-coniugato-IAbNP311-325 MHC classe II (NP311-325) nel tubo da 3.1.7. Preparare la miscela per più campioni come nel passaggio 3.1.4
NOTA: È importante macchiare il tetramero prima dell'aggiunta dell'anticorpo anti-CD4 poiché il legame tra anticorpo CD4 e anti-CD4 interferirebbe con la colorazione ottimale del tetramero. - Rimorsi la miscela cellulare toccando delicatamente il tubo e incubare al buio a RT per 30 minuti.
NOTA: Coprire una carta bagnata sulla bocca dei tubi per ridurre l'evaporazione - Aggiungere la miscela di altri marcatori di superficie (tabella 1) e continuare l'incubazione a RT per 30 minuti.
- Lavare e rimorsire le cellule come descritto nei passaggi 3.2.3 e 3.2.4.
5. Immunostaining di Bcl6 nelle cellule Tfh policlonali
- Eseguire la colorazione dei marcatori di superficie (Tabella 2) come descritto nella sezione 3, ad eccezione del fatto che l'ultimo lavaggio con 2 mL di PBS, anziché tampone di colorazione.
- Centrifuga a 350 x g per 6 min a 4 °C. Scartare i pellet di cellule supernatanti e resuspend toccando delicatamente il fondo del tubo.
- Aggiungere 300 μL di soluzione di formaldeide al 3,7% (diluita dal 37% di formaldeide con PBS) nel tubo per la fissazione cellulare. Vortice sul dispositivo di oscillazione del vortice e incubare a RT per 20 minuti.
- Aggiungere 2 mL di tampone di colorazione per lavaggio e centrifuga a 500 x g per 6 min a 4 °C. Scartare le cellule supernatanti e resuspend toccando delicatamente il tubo.
- Aggiungere 300 μL dello 0,2% di Triton-X 100 e rimospendare le celle per vortice sul dispositivo di oscillazione del vortice. Incubare a RT per 15 minuti.
- Aggiungere 2 mL di tampone di colorazione per il lavaggio. Centrifuga a 500 x g per 6 min a 4 °C. Scartare le cellule supernatanti e resuspend toccando delicatamente il fondo del tubo.
- Aggiungere 1,5 μL di anticorpo PE-anti-Bcl6 per ogni tubo. Toccare delicatamente il fondo del tubo per rimorsi la miscela e incubare a RT per 2 ore con maschiatura delicata del tubo ogni 30 minuti.
NOTA: Coprire una carta bagnata sulla bocca dei tubi per ridurre l'evaporazione della miscela. - Aggiungere 2 ml di PBS integrato con 0,01% Triton-X 100 nel tubo. Vortice e centrifuga a 500 x g per 6 min a 4 °C.
- Ripetere il lavaggio come passaggio 5.8. Cellule resuspend con 400 μL di tampone di colorazione. Mantenere le cellule al buio sul ghiaccio fino all'analisi della citometria del flusso.
6. Colorazione intracellulare di IL21
- Stimolare le cellule con PMA (phorbol 12-miristato 13-acetato) e ionomicina.
- Prendere 2 x 106 cellule dalla sospensione cellulare splenica e centrifugare a 350 x g per 6 min a 4 °C. Scartare il pellet di cellule supernatanti e resuspend con 500 μL di mezzo cellulare T completo. Trasferire le cellule nella piastra da 24 pozzi.
- Aggiungere 20 nmol PMA e 2 μmol ionomicina in 500 μL di mezzo completo18 e mescolare accuratamente tubazione su e giù.
- Aggiungere la soluzione preparata nel passaggio 6.2 nella sospensione cellulare nella piastra da 24 po 'e mescolare scuotendo la piastra. Impostare il controllo non stimolato aggiungendo 500 μL di mezzo cellulare T completo senza aggiunta di PMA e ionomicina nelle cellule. Incubare in un incubatore di CO2 a 37°C per 4 ore.
- Aggiungere 10 μmol BFA (Brefeldin A, sciolto con metanolo) in ogni pozzo per bloccare il trasporto di proteine mediate dall'apparato golgi. Rimettere la piastra nell'incubatrice cellulare e incubare per 2 ore.
- Eseguire la colorazione del marcatore della superficie cellulare.
- Rimospendare le celle tubazionando delicatamente su e giù e trasferire le celle in un tubo FACS. Aggiungere 1 ml di tampone di colorazione nel tubo e centrifugare a 350 x g per 6 min a 4 °C.
- Eseguire la colorazione del bloccante del recettore Fc come passaggio 3.1.4.
- Eseguire la colorazione dei marcatori di superficie cellulare (tabella 3) come descritto nei passaggi da 3.2.1 a 3.2.3, ad eccezione delle celle di lavaggio con 2 mL di PBS.
- Centrifuga a 350 x g per 6 min a 4 °C. Scartare le cellule supernatanti e resuspend toccando il fondo del tubo.
- Aggiungere 0,2 μL di reagente dal kit di colorazione Aqua Dead Cell fissabile live/dead e incubare il tubo al buio a RT per 10 minuti per eseguire la colorazione delle cellule morte.
- Aggiungere 2 ml di PBS nel tubo e nel vortice sul dispositivo di oscillazione del vortice. Centrifugare a 350 x g per 6 min a 4 °C e scartare il supernatante.
- Eseguire la fissazione delle celle come descritto nei passaggi 5.3 e 5.4.
- Aggiungere 300 μL di tampone di colorazione per riposiziosare le celle e conservare i tubi nel frigorifero a 4 °C durante la notte. Centrifuga a 500 x g per 6 min a 4 °C per rimuovere il supernatante.
NOTA: questo passaggio potrebbe essere omesso e continuare a fare il passaggio 6.7 direttamente dopo il passaggio 6.5. - Aggiungere 1 ml di tampone di saponina (tampone di colorazione integrato con saponina allo 0,2%(w/v) nel tubo e nel vortice sul dispositivo di oscillazione del vortice. Incubare sul ghiaccio per 20 minuti per eseguire la permeabilizzazione cellulare.
- Centrifuga a 500 x g per 6 min a 4 °C e scarta il supernatante.
- Aggiungere 0,5 μL di recettore Fc-IL21 umano in ogni tubo. Preparare la miscela di anticorpi per multipli come fase 3.1.4, ad eccezione di quell'anticorpo diluito con tampone di saponina invece di tampone di colorazione.
- Incubare a RT per 1 h con toccare delicatamente il fondo del tubo per rimospendare le cellule a 30 minuti.
- Aggiungere 2 mL di tampone di saponina per lavare le cellule e centrifugare a 500 x g per 6 min. Scartare il supernatante e ripetere il lavaggio una volta.
- Aggiungere 0,1 μL di Ig(H+L) APC-anti-umano in ogni tubo. Preparare la miscela per più campioni come fase 3.1.4, ad eccezione di quell'anticorpo diluito con tampone di saponina invece di tampone di colorazione.
- Incubare i campioni sul ghiaccio per 30 minuti e lavare come fase 6.11.
- Cellule resuspend con 400 μL di tampone di colorazione. Mantenere il campione al buio sul ghiaccio fino all'analisi della citometria del flusso.
7. GC B e colorazione delle cellule plasmatiche
- Prendere le cellule ed eseguire la colorazione degli anticorpi anti-Recettore Fc come passaggi da 3.1.1 a 3.1.4.
- Eseguire la colorazione dei marcatori disuperficie (tabella 4) come passaggi da 3.1.5 a 3.1.7, tranne per il fatto che il tempo di incubazione è di 30 minuti anziché di 1 h.
- Cellule resuspend con 400 μL di tampone di colorazione. Mantenere i campioni al buio sul ghiaccio fino all'analisi della citometria del flusso.
8. Isolamento del siero dal sangue
- Il giorno 14 dopo l'infezione (d.p.i 14), raccogliere il sangue dalla vena facciale e tenere campioni di sangue in un frigorifero a 4 °C durante la notte.
NOTA: Eseguire la raccolta del sangue a condizione ABSL2 e da questo passaggio in poi tutte le procedure potrebbero essere eseguite nel laboratorio regolare. - Centrifugare il sangue a 400 x g per 10 minuti a 4 °C. Isolare attentamente il siero con la pipetta da 200 μL per evitare l'inquinamento dei globuli rossi. Aliquota in 3 tubi per ogni campione e conservarli a -80°C.
9. Dosaggio del tintore anticorpale specifico ha con ELISA
- Rivestire le piastre ELISA con 50 μL di 2 μg/mL di soluzione proteica HA per pozzo e incubarle nel frigorifero a 4 °C durante la notte.
- Lavare tre volte con 200 μL di interpolazione pbs diluita dello 0,05% (PBST). Aggiungere 100 μL di latte scremato diluito al 5% di PBST in ogni pozzo e incubare a RT per 2 ore per bloccare il legame non specifico.
- Diluizione e incubazione del siero: preparare il 3% di BSA in PBS come tampone di diluizione. Diluire il siero nel tampone di diluizione come 1:50, 1:150, 1:450, ...... a 1:36450 (si consiglia una diluizione seriale di 3 volte). Aggiungere 50 μL di siero diluito ad ogni pozzo e incubare nel frigorifero a 4°C durante la notte.
- Scartare il siero e lavare rapidamente i pozzi una volta aggiungendo 200 μL di PBST in ogni pozzo (scuoterlo dolcemente, quindi scartare). Quindi lavare lentamente le piastre sullo shaker con 200 μL di PBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
- Aggiungere 100 μL di anticorpo secondario etichettato HRP specifico per igG totale, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, diluito con PBST) e incubare a RT per 1 h. Lavare le piastre con PBST come descritto al 9.4.
- Esegua lo stesso volume del buffer A e del buffer B (TMB) dalla conservazione a 4 °C e riscaldati per almeno 30 minuti a RT prima dell'uso. Mescolare A e B e aggiungere 100 μL di TMB in ogni pozzo e incubarli per 10-30 minuti a RT scuotendo dolcemente.
NOTA: Questa è una breve descrizione del manuale TMB Substrate Reagent Set (BD,555214). - Pipetta 100 μL di 2M H2SO4 in ogni pozzo per terminare la reazione. Leggi il valore OD450 attraverso lo strumento.
- Analisi dei dati: ottenere il valore finale OD450 sottraendo il segnale di fondo (valore OD450 del pozzo vuoto). Disegnare la curva corrispondente a un isotipo anticorpale di ciascun campione con il fattore di diluizione sull'asse X e il valore OD450 sull'asse Y.
10. Istologia
- Isolare le milza a d.p.i 10. Fissarli in soluzione di formaldeide al 3,7% per 1 h a RT. Scartare il buffer di fissazione e lavare con PBS per 5 minuti sullo shaker per tre volte.
- Disidratare le milza in PBS (10% di saccarosio) a 4°C per 1 h e quindi disidratarle in PBS (30% di saccarosio) a 4°C con tremorò dolcemente fino a quando le milza affondano sul fondo del tubo da 15 ml.
- Esezione delle milza disidratata, incorporarle in un composto ottimale a temperatura di taglio e criosezione.
- Pre-raffreddare l'acetone a -20°C. Incubare le sezioni tissutali con acetone pre-refrigerato per 10 minuti. Lavare il tessuto con PBS per tre volte.
- Permeabilizzare le sezioni tissutali con PBS contenente lo 0,2% di Tritone X-100 per 20 minuti e lavarle per tre volte con PBS.
- Bloccare il legame non specifico con PBS contenente il 10% di siero di capra normale (tampone di blocco) per 1 h a RT e lavare una volta le sezioni tissutali con PBS.
- Bloccare l'attacco non specifico con il kit di blocco STREPTAVIDIN/BIOTIN.
NOTA: Non lasciare asciugare i campioni da questo passaggio in poi. - Colorazione con anticorpo primario: aggiungere con attenzione la biotina-PNA diluita tampone di blocco (25 μg/mL) e l'IgD anti-topo del ratto (2,5 μg/mL) sulle sezioni del tessuto. Incubare le sezioni tissutali nella camera umida nel congelatore a 4 °C durante la notte.
- Lavare rapidamente le sezioni del tessuto con PBST una volta. Lavare rapidamente le sezioni del tessuto nel PBST tremando lentamente per 5 minuti. Ripetere il lavaggio per tre volte.
- Diluire gli anticorpi Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) e Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG (1:500) con tampone di blocco e aggiungerli accuratamente alle sezioni del tessuto
- Incubare a RT per 1 h.
- Lavare le sezioni tissutali come fase 10.8 e montare con cura con la soluzione prolungata. Coprire il tessuto con le labbra di copertura con attenzione e mantenerle al buio a 4°C fino all'analisi confocale.
- Analizzare la grandezza della reazione GC contando i numeri GC per dimensione dell'area.
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Representative Results
Caratterizzazione della morbilità del topo nell'infezione da virus influenzale
Dopo l'infezione da virus influenzale, i topi sono meno attivi e anoressici a causa di una malattia, che si riflette in una grave perdita di peso, un sintomo comunemente usato per monitorare la morbilità deltopo 19. Come mostrato nella figura 1a, i topi infetti da virus PR8 hanno iniziato a perdere peso il giorno 6, hanno raggiunto il livello di perdita più alto il giorno 8 e sono tornati al livello iniziale il giorno 10. Come previsto, la perdita di peso non è stata osservata per tutto il periodo nei topi di controllo trattati con PBS. Per i sintomi in vivo, l'infezione da virus porta a una robusta espansione dei linfociti nel linfonodo drenante, mLN in questo caso. Pertanto, nei topi infetti da virus PR8 sono state osservate dimensioni significativamente maggiori rispetto ai topi di controllo (Figura 1b). Nel loro insieme, tutti questi topi hanno mostrato sintomi attesi e sono stati qualificati per il successivo studio di risposta immunitaria associato a Tfh.
Rilevamento della differenziazione Tfh e delle molecole associate alla funzione
Per analizzare la differenziazione di Tfh, i topi sono stati sacrificati il giorno 5, 7, 10 e 14 dopo che l'infezione e mLN o milza sono stati isolati per l'analisi della citometria del flusso. La figura 2a e la figura 2b mostrano la strategia di gating della popolazione Tfh, con Tfh gated come cellule PD-1hi CXCR5hi e non Tfh come cellule basse CXCR5 basse PD-1. Con questa strategia di gating, sono state testate la cinetica della differenziazione Tfh durante l'infezione da virus influenzale. Come mostrato nella figura 2c, la differenziazione Tfh inizializzata al giorno 5 e ha raggiunto il picco al giorno 10. Quindi abbiamo preso campioni del giorno 10 per ulteriori analisi. Come mostrato nella figura 3a, la robusta differenziazione cellulare Tfh è stata indotta nei topi infetti da virus influenzale rispetto ai topi di controllo. Per analizzare le cellule Tfh specifiche del virus influenzale, nel pannello di colorazione delle cellule Tfh policlonali(tabella 1)sono stati aggiunti tetrameri IAbNP311-325 MHC di classe II con etichetta fluorocromo. Sia nelle mLN che nelle milza dei topi infetti da virus influenzali, le cellule CD4+ T specifiche di NP311-325sono state indotte in modo significativo e le cellule Tfh specifiche di NP311-325potrebbero essere analizzate con l'aggiunta di PD-1 e CXCR5nell'analisi(Figura 3e). A causa dei ruoli essenziali di Bcl6 nella differenziazione Tfh, le cellule Bcl6+CXCR5+ possono anche rappresentare la popolazione Tfh. Coerentemente, anche le cellule Tfh identificate con questa strategia sono state indotte in modo robusto (Figura 3b). Abbiamo inoltre analizzato l'espressione di Bcl6 nelle cellule Tfh e non Tfh. Come illustrato nella figura 3c, l'espressione superiore di Bcl6 nelle celle Tfh rispetto a quella delle celle non Tfh indica una colorazione Bcl6 corretta. Con una strategia simile, ICOS, è stata analizzata anche un'altra molecola associata a Tfh (Figura 3d). A causa del ruolo specializzato delle cellule Tfh nel fornire aiuto alle cellule B, il dosaggio dell'espressione di IL21, che viene secreta principalmente dalle cellule Tfh e dimostrata per regolare direttamente la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule B, potrebbe rivelare che le cellule Tfh funzionano in una certa misura. Come mostrato nella figura 3f, la colorazione intracellulare di IL21 ha rivelato che l'infezione da PR8 ha indotto una produzione significativamente più elevata di questa citochina, con cellule non stimolate come controllo della gating. Nel loro insieme, questi saggi potrebbero riflettere le informazioni di base della differenziazione Tfh e fornire le intuizioni sulla capacità di aiuto cellulare B.
Individuazione dello sviluppo di GC B e cellule plasmatiche e di anticorpi specifici del virus influenzale nel siero
La funzione principale delle cellule Tfh è fornire aiuto alle cellule B nei HC, in cui si verificano la commutazione della classe di anticorpi e la maturazione dell'affinità. Quindi lo sviluppo gc B potrebbe riflettere indirettamente la differenziazione e la funzione delle cellule Tfh. Le celle GC B possono essere gategate come B220+PNA+Fas+ celle (Figura 2d). Attraverso questa strategia di gating, abbiamo analizzato la cinetica della risposta cellulare GC B e abbiamo scoperto che la risposta GC B è iniziata al giorno 10 e ha continuato ad aumentare al giorno 14 (Figura 2e). Il confronto tra topi infetti da virus PR8 e topi di controllo ha mostrato che il GC B robusto è stato indotto sia in mLN che nella milza dopo l'infezione da virus influenzale(Figura 4a), che è coerente con la differenziazione Tfh indotta nei topi infetti da virus PRB. Inoltre, la colorazione immunofluorescenza con IgD e PNA fornisce immagini visualizzabili che indicano la reazione GC indotta (aree verdi) nei topi infetti da virus PR8 (Figura 4d). Le cellule plasmatiche, identificate come cellule IgDlowCD138+ (Figura 2d), sono state generate anche nei topi infetti da virus PR8 (Figura 4b). Studi precedenti hanno identificato che IFNƳ e IL21 potrebbero essere secreti sia dalle cellule Th1 che Tfh nell'infezione da virus e indurre la commutazione di classe IgG2 e IgG1,rispettivamente 20. La figura 4c descrive la generazione di anticorpi specifici del virus influenzale mediante test ELISA di IgM specifico per HA, IgG totale, IgG1, IgG2b e IgG2C. Insieme, tutti questi test riflettono le risposte delle cellule B associate a Tfh nell'infezione da virus influenzale.
Figura 1: Caratterizzazione della morbilità del topo. Topi maschi di 8 settimane sono stati infettati da 40 PFU del virus dell'influenza PR8 per inoculazione intranasale. I topi sono stati pesati giornalmente per 10 giorni (a) e i mLN sono stati isolati su d.p.i 10 (b). Le barre di errore in (a) rappresentano la ± SD. n = 4 topi per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia di Gating delle cellule Tfh e GC B. (a) I linfociti sono definiti da FSC-A e SSC-A e i singoletti cellulari sono gated con FSC-A, FSC-H e SSC-A, SSC-W. (b) Dopo la gating nelle celle CD4+ T, i marcatori di superficie CD62L e CD44 vengono utilizzati per distinguere le ingenue celle T (CD44loCD62Lhi) e le celle T attivate (CD44hiCD62Llo). Le cellule Tfh policlonali possono essere gated da cellule T attivate come PD-1hi CXCR5hi di popolazione, al contrario, cellule non Tfh come PD-1bassoCXCR5basso. Le cellule Tfh specifiche del virus PR8 sono definite come cellule CD4+CD44+ NP311-325 tetramero+PD-1hi CXCR5hi. (e,e) Cinetica della frequenza Tfh nelle cellule attivate (c) e frequenza GC B in B220+ celle (e). (d) Le cellule GC B sono gated come cellule B220+ PNA+FAS+ e le cellule plasmatiche sono IgD-CD138+ cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi della differenziazione Tfh nei topi infetti da virus PR8. I topi sono stati sacrificati su d.p.i 10 e mLN e milza sono stati isolati per l'analisi della differenziazione Tfh. (a) Percentuale di Tfh in mLN e milza nei topi infetti da virus PR8 e nei topi trattati con PBS (pannello superiore). Le statistiche delle cellule Tfh (pannello inferiore). (b) La colorazione intracellulare di Bcl6 nelle celle CD4+CD44hi T (pannello superiore). Le statistiche di Bcl6+CXCR5+ celle (pannello inferiore). (c) Espressione ICOS Bcl6 e( d) nelle celle Tfh (rosso linea) e non Tfh (grigio-solido). ( e ) Gating di cellule CD4+ T specifiche di NP311-325in mLN e milza di topi infetti da virus PR8etrattati con PBS (pannello sinistro). Percentuale di cellule Tfh specifiche del virus PR8 in mLN e milza (pannello centrale). "Isotipo" indica colorazione con controllo tetramero irrilevante. Le statistiche delle celle CD4+ T specifichedi NP 311-325(pannello destro). (f) Colorazione intracellulare di IL-21 in cellule CD4+ T spleniche da topi infetti da virus PR8 e trattati con PBS, l'impretimazione mostrata come controllo (a sinistra). Le statistiche della colorazione IL-21 (a destra). **P < 0,01, ***P < 0,001 e **** P < 0,0001 (test t dello studente a due code). Le barre di errore rappresentano la ± SD. n = 3 topi per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi della risposta associata alle cellule GC B nei topi infetti da virus PR8. I topi sono stati sacrificati su d.p.i 10 e i mLN e le milza sono stati isolati per l'analisi. (a) Percentuale di celle GC B (pannello superiore). Le statistiche delle celle GC B (pannello inferiore). (b) La percentuale di cellule plasmatiche (pannello superiore). Le statistiche delle cellule plasmatiche (pannello inferiore). cQuantificazionedei virus PR8 IgG, IgM, IgG1, IgG2b e IgG2c nel siero (d.p.i 14) dei topi infetti da virus PR8 e dei topi trattati con PBS. ( d) Microscopia confocale di follicoli cellulari B (IgD+, Rosso) e COV (PNA+, Verde) nei campioni di milza di topi infetti da virus PR8 e topi trattati con PBS (d.p.i 10). *P < 0,5, **P < 0,01 e ***P < 0,001 (test t dello studente a due code). Le barre di errore rappresentano la ± SD. n = 3 topi per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| marcatore di superficie | fluorocromo | clone | volume per campione(ul) |
| Cd4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| Cd44 | EVolve 605 | Messaggistica istantanea7 | 0.2 |
| CD62L | Fitc | Mel-14 | 0.2 |
| ICOS | BV421 | 7E.17G9 | 0.2 |
| Pd1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidina | Pe | 0.2 |
Tabella 1: Pannello anticorpi marcatore superficiale (ad eccezione di CXCR5) per la colorazione delle cellule Tfh (PD-1hiCXCR5hi).
| marcatore di superficie | fluorocromo | clone | volume per campione(ul) |
| Cd4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| Cd44 | Fitc | Messaggistica istantanea7 | 0.2 |
| Pd1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidina | BV421 | 0.5 |
Tabella 2: Pannello di anticorpi marcatori superficiali (ad eccezione del CXCR5) per la colorazione del Bcl6 nelle cellule Tfh.
| marcatore di superficie | fluorocromo | clone | volume per campione(ul) |
| Cd4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| Cd44 | Fitc | Messaggistica istantanea7 | 0.2 |
Tabella 3: Pannello anticorpi marcatore superficiale per colorazione intracellulare di IL21.
| marcatore di superficie | fluorocromo | clone | volume per campione(ul) |
| B220 B220 | Apc | RA3-6B2 | 0.2 |
| IgD | eFluor 450 | 11-26c | 0.2 |
| Cd95 | PE/Cy7 | Jo2 | 0.3 |
| Pna | Fitc | 0.3 | |
| Cd138 | Pe | 281-2 | 0.2 |
Tabella 4: Pannello anticorpi marcatore superficiale per la colorazione delle cellule GC B e plasma B.
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Discussion
A causa di ruoli specializzati nel fornire aiuto alle cellule B per generare anticorpi ad alta affinità, le cellule Tfh sono state ampiamente studiate nei meccanismi di differenziazione e manipolazione per fornire nuove strategie per la progettazione dei vaccini. L'infezione da virus influenzale induce vigorose risposte alle cellule Tfh e GC B, essendo così un modello appropriato per questo campo di ricerca. In questo documento, abbiamo descritto i protocolli di infezione da virus influenzale per inoculazione intranasale, valutazione della risposta associata a Tfh per citometria del flusso, immunofluorescenza ed ELISA. Questi test faciliteranno il rilevamento della differenziazione Tfh, dello sviluppo GC B e degli anticorpi specifici del virus influenzale e aiuteranno i ricercatori a esplorare e identificare nuove molecole cruciali nella risposta immunitaria.
Negli studi con modelli di topi infetti da virus influenzali, la perdita di peso è un indicatore comunemente usato della morbilità del topo. La cinetica di variazione di peso prevista nei topi infetti da virus influenzale è come descritto nella figura 1a, che riflette l'appropriata risposta immunitaria indotta nei topi. Tuttavia, si verificherebbero regolarmente casi anomali, in cui i topi perdono peso o non mostrano alcun calo di peso durante tutto il periodo di osservazione. Secondo le nostre esperienze, questi topi avrebbero per lo più una risposta immunitaria anormale inferiore o superiore, interrompendo così i risultati dell'esperimento. Per evitare tali variazioni, in primo luogo i topi utilizzati nell'esperimento dovrebbero essere abbinati al sesso e all'età per garantire la capacità reattiva simile al virus. Anche il titer antivirus coerente per ogni mouse è importante21. Il titer del virus utilizzato in questo protocollo è 40 PFU. Tuttavia, il titer del virus per indurre un'appropriata cinetica del cambiamento di peso in ogni laboratorio potrebbe essere variabile a causa dell'incoerenza nella procedura di valutazione del formicolio del virus e nei ceppi di topo utilizzati nell'esperimento. Quindi consigliamo la titolazione del tintore virale per l'infezione è necessaria prima dello studio pertinente alla risposta immunitaria.
In questo protocollo, abbiamo identificato le cellule Tfh con marcatori usati di frequente PD-1, CXCR5 e il fattore di trascrizione essenziale Bcl6. Sebbene entrambe le cellule PD-1hiCXCR5hi e Bcl6+CXCR5+ possano essere denota come cellule Tfh, rappresentano una popolazione diversa e non hanno la relazione precursore-progenie basata sul fatto che non tutte le cellule PD-1hiCXCR5hi sono Bcl6+ e non tutte le cellule Bcl6+CXCR5hi sono PD-1hiCXCR5hi. Questo fenotipo potrebbe essere spiegato dall'eterogeneità dell'espressione Bcl6 nelle celle Tfh22. ICOS, una molecola critica sia per la differenziazione che per la migrazione di Tfh, dovrebbe essere inclusa nell'analisi della differenziazione Tfh. Inoltre, dovrebbero essere rilevate anche altre molecole co-stimolanti associate alla funzione, come OX40 e CD40L per il loro livello di espressione, anche se non incluse in questo protocollo. IL21 e IL4 sono entrambe citochine secrete da Tfh che svolgono un ruolo nell'indurre il cambio di classe IgG1. Il protocollo di rilevamento dell'espressione IL21 è descritto in questo documento. Tuttavia, a causa della difficoltà nel rilevamento dell'IL4 nelle cellule Tfh, i topi reporter IL4-GFP sono stati utilizzati in studiprecedenti 23. In questo protocollo, abbiamo anche usato tetrameri NP con etichetta fluorocromo per rilevare cellule Tfh specifiche di NP311-325. Tuttavia, il limite nella quantità di celluleTfh specifiche di NP 311-325conferisce la difficoltà di ulteriori analisi. Pertanto, l'esperimento di trasferimento adottivo di cellule T transgeniche TCR specifiche dell'influenza emagglutinina (Tg) CD4+ (TS-1), che potrebbero essere isolate dai topi TS-1, è una strategia alternativa per risolvere questo problema24.
Qui abbiamo identificato GC B come cellule B220+PNA+Fas+ nella colorazione citometrica del flusso. Una strategia alternativa di combinazione di marcatori per definire GC B come cellule GL7hiFashi viene utilizzata anche in altridocumenti 14,16. Utilizziamo anche l'immunofluorescenza per visualizzare i TC con la combinazione di anti-IgD e PNA. In questo caso l'aggiunta di anticorpi CD3 può aiutare a visualizzare le cellule Tfh, consentendo così lo studio dell'interazione tra questi due tipi dicellule 10.
Data la differenziazione delle cellule Tfh è un processo multistagio e multifattoriale, è necessario un ulteriore dosaggio di altre molecole significative in più punti di tempo per chiarire un meccanismo più dettagliato nella differenziazione di Tfh. Inoltre, i parametri rilevati qui sono comunemente utilizzati anche in altri modelli18. Pertanto, oltre all'infezione da virus influenzale, i protocolli descritti qui, in particolare la parte immunostaining, possono anche fornire istruzioni nello studio associato a Tfh con altri modelli.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il personale della struttura di citometria a flusso, della struttura ABSL2 e della struttura per animali SPF dell'Institut Pasteur di Shanghai per il loro aiuto tecnico e consulenza. Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: Strategic Priority Research Program della Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key R&D Program of China (2016YFA0502202), National Natural Science Foundation of China (31570886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
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