Bewertung von T Follicular Helper Cells und Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Follikuläre T-Helferzellen sind neu identifizierte CD4-T-Zellen-Untergruppen, die B-Zellen in der tierischen Produktion mit hoher Affinität unterstützen. Der Nachweis der Identifizierung von Tfh-Zellen bei einer Influenzavirusinfektion wird neuen Forschern helfen zu verstehen, wie die notwendigen Techniken für Tfh-assoziierte Studien durchgeführt werden können. Da ein ungeeigneter Virustiter zum Tod oder zu einer zu schwachen Immunantwort führen kann, empfehlen wir, den Titer vor der Durchführung eines Experiments zu bestimmen.

Für die PR8-Virus-Inokulation von acht Wochen alten männlichen männlichen C57-schwarzen 6 Mäusen. Tauen Sie unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 einen bei minus 80 Grad Celsius gelagerten PR8-Virusbestand auf Eis auf. Wirbeln Sie das Virus vor, um eine homogene Lösung zu erhalten.

Verdünnen Sie das Virus in einem vorgekühlten 1,5-Milliliter-Röhrchen auf zwei Plattformeinheiten pro Mikroliter PBS und bestätigen Sie, dass bei den anästhesierten Tieren keine Reaktion auf das Zehenkneifen auftritt. Wirbeln Sie das Virus erneut ein. Laden Sie eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze mit 10 Mikrolitern Virus.

Geben Sie vorsichtig Tropfen des Virus in eine Naris von bis zu drei sedierten Tieren, bevor Sie die Impfung auf der anderen Seite wiederholen. Setzen Sie dann alle Mäuse in sternale Lagen in warme Käfige mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung und wiegen Sie jede Maus 10 Tage lang täglich. Setzen Sie die Mäuse am Ende des Versuchs in eine Laminar-Flow-Haube der Biosicherheitsstufe 2 und befestigen Sie das erste Tier auf einem saugfähigen, mit Papier überzogenen Schaumstoff-Sezierbrett.

Schneide die Haut mit einer Präparierschere entlang der Bauchmittellinie, dehne die Haut mit einer Pinzette und stecke sie an das Sezierbrett. Öffnen Sie das Peritoneum, um die Milz zu sammeln, und legen Sie die Milz in einen 70-Mikrometer-Filter mit einer 6-Zentimeter-Schale, die 5 Milliliter DMEM enthält, ergänzt mit 1 % FBS. Teilen Sie das Zwerchfell und die Rippen bis zum Thymus und befestigen Sie die Rippe zur Seite, um die Brusthöhle freizulegen.

Bewegen Sie die Lunge und das Herz, um den mediastinalen Lymphknoten in der Nähe der ventralen Seite der Luftröhre zu lokalisieren. Legen Sie dann den Lymphknoten in ein eigenes Sieb in eine zweite 6-Zentimeter-Schale mit 5 Millilitern Medium und drücken Sie beide Gewebe mit 3-Milliliter-Spritzenkolben vorsichtig durch das Netz beider Siebe. Spülen Sie jedes Sieb mit 1 Milliliter frischem DMEM plus FBS und geben Sie die Zellsuspensionen in einzelne 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets gründlich in 1 Milliliter frischem DMEM plus FBS pro Röhrchen. Geben Sie dann vier weitere Milliliter Medium in die Milzzellsuspension und legen Sie beide Röhrchen auf Eis. Um die Zellen für die CXCR5-Expression zu färben, drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um es zu mischen, und übertragen Sie es 2 mal 10 auf die 6 Zellen pro Probe in einzelne FACS-Röhrchen.

Geben Sie 2 Milliliter Färbepuffer in jedes Röhrchen und mischen Sie die Zellen durch Vortexen. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und die Überstände werden entsorgt. Klopfen Sie jedes Röhrchen zweimal vorsichtig auf saugfähiges Papier und schnippen Sie vorsichtig mit den beiden Böden, um die Zellen im Restüberstand wieder zu suspendieren.

Blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 0,2 Mikrolitern Fc-Rezeptorblock pro Röhrchen und schnippen Sie das Röhrchen vorsichtig zum Mischen, bevor Sie die Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis legen. Am Ende der Inkubation 0,3 Mikroliter Biotin Anti-Maus CXCR5 in jedes Röhrchen geben und durch leichtes Schnippen mischen. Legen Sie die Röhren eine Stunde lang auf Eis und schnippen Sie sie nach 30 Minuten leicht.

Geben Sie am Ende der Inkubation 2 Milliliter Färbepuffer in die Röhrchen und den Wirbel, um sie zu mischen, bevor Sie die Zellen durch Zentrifugation sedimentieren. Entsorgen Sie den Überstand und schnippen Sie, um die Zellen im Restpuffer wieder zu suspendieren. Legen Sie dann die Röhrchen auf Eis und markieren Sie die Zellen mit Antikörpern gegen den interessierenden Oberflächenmarker, wie in der gerade gezeigten Tabelle dargestellt.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit 2 Millilitern Färbepuffer und resuspendieren Sie jedes Pellet in 400 Mikrolitern frischem Färbepuffer zur Analyse durch Durchflusszytometrie. Mit dem PR8-Virus infizierte Mäuse beginnen am sechsten Tag abzunehmen, erreichen am achten Tag den höchsten Verlust und kehren am 10. Tag zum Ausgangsgewicht zurück. Wie erwartet wird bei PBS-behandelten Kontrollmäusen kein Gewichtsverlust beobachtet.

Virusinfektion führt auch zu einer robusten Lymphozytenexpansion innerhalb des drainierenden Lymphknotens. Wie in der durchflusszytometrischen Analyse beobachtet, initialisiert sich die Differenzierung der follikulären T-Helferzellen am fünften Tag und erreicht am Tag 10 nach der Infektion ihren Höhepunkt mit einer robusten Anzahl von follikulären T-Helferzellen, die bei mit Influenzaviren infizierten Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren induziert werden. Darüber hinaus ist sowohl in den mediastinalen Lymphknoten als auch in der Milz die Anzahl der Influenzaantigen-spezifischen CD4-positiven T-Zellen signifikant induziert im Vergleich zu denen, die bei Kontrollmäusen mit erhöhten Populationen von PD-1-positiven CXCR5-positiven Zellen bei PR8-Tieren beobachtet wurden.

Darüber hinaus zeigt die intrazelluläre Färbung von IL-21, dass eine PR8-Infektion eine signifikant höhere Produktion dieses Zytokins als Reaktion auf eine Virusinfektion induziert. Die Immunfluoreszenzfärbung weist auf das Vorhandensein einer induzierten Keimzentrumsreaktion bei PR8-infizierten Mäusen hin, und der ELISA zeigt die Bildung von Influenzavirus-spezifischen Antikörpern bei virusinfizierten Tieren. Es ist wichtig, die CXCR5-Färbung eine Stunde lang auf Eis durchzuführen, da die Qualität der Färbung durch die Färbetemperatur und die Zeit beeinflusst wird.

Obwohl wir CXR5- und IL-21-Färbungen nachweisen konnten, können andere Oberflächenmarker, Transkriptionsfaktoren und Zytokine mit dieser Methode bewertet werden, um eine Vielzahl von Informationen über die Tfh-Differenzierung und -Funktion zu liefern.