Name: Bewertung von T Follicular Helper Cells und Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung von T-follikulären Helferzellen und Keimzentrumsreaktionen bei Influenza-A-Virus-Infektionen in C57BL/6-Mäusen. Diese Protokolle ermöglichen die Analyse immunologischer Mechanismen.

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Wir danken den Mitarbeitern der Durchflusszytometrieanlage, ABSL2-Anlage und SPF-Tieranlage des Institut Pasteur in Shanghai für ihre technische Hilfe und Beratung. Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key R&D Program of China (2016YFA0502202), the National Natural Science Foundation of China (31570886).

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
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<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
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<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Aufgrund der spezialisierten Rolle bei der Bereitstellung von B-Zell-Hilfe bei der Erzeugung von Hochaffinitätsantikörpern wurden Tfh-Zellen ausgiebig in den Mechanismen der Differenzierung und Manipulation untersucht, um neue Strategien für das Impfstoffdesign zu liefern. Influenza-Virus-Infektion induziert kräftige Tfh und GC B Zellen Reaktionen, so dass ein geeignetes Modell für dieses Forschungsfeld. In diesem Beitrag beschrieben wir Protokolle der Influenza-Virus-Infektion durch intranasale Inokulation, Bewertung de...

In den letzten zehn Jahren konzentrierten sich zahlreiche Studien auf die neu identifizierte CD4+ T-Zell-Untermenge, Tfh-Zell-Submenge, für ihre wesentliche Rolle in der Entwicklung des Keimzentrums (GC) B. B-Zell-Lymphom 6 (Bcl6), das hauptsächlich als Genrepressor betrachtet wird, ist der Liniendefinierende Faktor von Tfh-Zellen für den Beweis, dass die ektopische Expression von Bcl6 ausreicht, um die Tfh-Differenzierung anzutreiben, während ein Mangel an Bcl6 zu einer verschwundenen Tfh-Differenzierung1,2,3führt. Im Gegensatz zu anderen CD4+ T-Helfer-Untergruppen, die ihre Effektorfunktion durch Migration zu den Entzündungsstellen ausführen, bieten Tfh-Zellen die B-Zellhilfe hauptsächlich in der B-Zell-Follikelzone von Milz und Lymphknoten. Die kostimulierenden Moleküle ICOS und CD40L spielen eine wichtige Rolle in der Interaktion zwischen Tfh- und GC-B-Zellen. Während der Tfh-Differenzierung überträgt ICOS notwendige Signale von kognaaten B-Zellen und fungiert auch als Rezeptor, der Migrationssignale von Bystander-B-Zellen für die B-Zellzonenlokalisierung4,5empfängt. CD40L ist ein Mediator von Signalen von Tfh-Zellen für B-Zellen Proliferation und Überleben6. Ein weiterer Faktor, der die ähnliche Rolle wie CD40L spielt, ist das Zytokin IL21, das hauptsächlich von Tfh-Zellen abgesondert wird. IL21 reguliert direkt die Entwicklung und Produktion von Gc B-Zellen entwicklung und Produktion von hochaffinen Antikörpern, aber seine Rolle bei der Tfh-Differenzierung ist immer noch umstritten7,8. PD-1 und CXCR5, die heute am häufigsten bei der Identifizierung von Tfh-Zellen in der Durchflusszytometrie-Analyse verwendet werden, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Differenzierung und Funktion dieser Teilmenge. CXCR5 ist der Rezeptor für B-Zell-Follikuläres Chemokin und vermittelt die Lokalisierung von Tfh-Zellen in B-Zellfollikel9. PD-1 ist nun nicht nur identifiziert, um die follikuläre Führungsfunktion zu haben, sondern auch kritische Signale im Prozess der GC B-Zellen Affinitätsreifung10zu übertragen. Basierend auf diesen Erkenntnissen könnte die Bewertung der Expression dieser Moleküle im Wesentlichen die Reifung und Funktion von Tfh-Zellen widerspiegeln.
GC ist eine induzierte transiente mikroanatomische Struktur in sekundären Lymphorganen und stark von Tfh-Zellen abhängig, was eine perfekte Auslesung zur Bewertung der Tfh-Antwort ist. In GC unterliegen B-Zellen nach dem Empfang von Signalen, die durch Zytokine und kostimulierende Moleküle vermittelt werden, Klassenumschaltungen und somatischer Hypermutation, um hochaffine Antikörper zu erzeugen11. Differential-Antikörper-Klassen-Switching tritt in Differential-Zytokin-Nische, in der IL4 und IL21 induzieren IgG1-Klasse Schalten, während IFN induziert IgG2-Klasse Switching12. Plasmazellen sind die Produzenten von abgesonderten Antikörpern und endlos differenzierte Zellen. Wie Tfh-Zellen ist die Entwicklung von B-Zellen in GC mit der dynamischen Expression vieler signifikanter Moleküle verbunden. Basierend auf der aktuellen Studie können GC B-Zellen als B220+PNA+Fas+ oder B220+GL7+Fas+ Zellen und Plasmazellen identifiziert werden, im Vergleich zu ihren Vorläufern, Downregulate Expression von B220 und upregulate CD138 Expression13. Darüber hinaus können beide Eigenschaften in der Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzanalyse nachgewiesen werden, was eine angemessene Bewertung der GC-Reaktion ist.
Robuste zelluläre und humorale Reaktionen werden bei Influenza-Virus-Infektionen induziert, wobei Tfh- und Th1-Zellen die CD4+ T-Zellreaktion14dominieren, was sie zu einem perfekten Modell für die Tfh-Zelldifferenzierungsstudie macht. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), ein häufig verwendeter mausangepasster Stamm, wird häufig in dieser Studie verwendet14,15,16. Hier beschreiben wir einige grundlegende Protokolle des Tfh-Studien-relevanten Assays bei Influenza-Virusinfektionen: 1) intranasale Impfung des PR8-Virus; 2) antigenspezifische Tfh-Zellen, GC B- und Plasmazellen und IL21-Nachweis mit Durchflusszytometrie; 3) histologische Visualisierung von GC; 4) Nachweis von antigenspezifischem Antikörpertiter im Serum mit ELISA. Diese Protokolle liefern die notwendigen Techniken für neue Forscher in Tfh-assoziierten Studien.

<table><tbody><tr><td><stark>Immunfärbung von Tfh-Zellen, NP-spezifischen Tfh-Zellen und Bcl-6</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 Maus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC-konjugiert-IAbNP311-325 MHC Klasse II Tetramer</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bcl-6 PE</td><td>Biolegend</td><td>358504</td><td>Klon:7D1</td></tr><tr><td>Biotin-CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>Klon: SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>Klon: GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>Klon: IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>Klon: IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>Klon:MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>Klon:7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>Klon:29F.1A12</td></tr><tr><td>Streptavidin BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td>Intrazelluäre Färbung von IL21</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>humaner FCc IL-21-Rezeptor</td><td>R& D System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Lebend/tot fixierbares Aqua Totzellen-Färbeset</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>MP</td><td>102855</td><td></td></tr><tr><td>GC B- und Plasmazellen Färbekit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0452-81</td><td>Klon:RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>Klon:281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE/Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557653</td><td>Klon:Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5993-82</td><td>Klon:11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>Assay des HA-spezifischen Antikörpertiters mit ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Sino Biological</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti Maus Ig (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti Maus IgM (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>TMB Substrat-Reagenzien-Set</td><td>BD Pharmingen</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Histologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-Ziegen-Anti-Ratte</td><td>IgG Life Technology</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus IgD</td><td>Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>biotinylierte PNA</td><td>Vector Laboratorien</td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>verdünnt Alexa Fluor 488-Streptavidin</td><td>Life Technology</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>normales Ziegenserum</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>Pro-long Gold-Antifading-Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>STREPTAVIDIN/BIOTIN Blockierungskit</td><td>Vector laboratories</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung von t follicular helper cells und germinal center response during influenza a virus infection in mice

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) Zellen sind eine unabhängige CD4+ T-Zell-Untergruppe, die auf die Unterstützung bei der Entwicklung von Keimzentren (GC) und der Erzeugung von Antikörpern mit hoher Affinität spezialisiert ist. Bei einer Influenza-Virusinfektion werden robuste Tfh- und GC-B-Zellreaktionen induziert, um eine effektive Virusausrottung zu erleichtern, die ein qualifiziertes Mausmodell für Tfh-assoziierte Studien ermöglicht. In diesem Beitrag haben wir Protokolle zum Nachweis der grundlegenden Tfh-assoziierten Immunantwort während einer Influenzavirusinfektion bei Mäusen beschrieben. Zu diesen Protokollen gehören: intranasale Impfung des Influenzavirus; Durchflusszytometrie Färbung und Analyse von polyklonalen und antigenspezifischen Tfh-Zellen, GC-B-Zellen und Plasmazellen; Immunfluoreszenznachweis von GCs; enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) von Influenza-virusspezifischen Antikörpern im Serum. Diese Assays quantifizieren grundsätzlich die Differenzierung und Funktion von Tfh-Zellen bei Influenza-Virusinfektionen und helfen so bei Studien zur Aufklärung von Differenzierungsmechanismus und Manipulationsstrategie.

Charakterisierung der Morbidität der Maus bei Influenza-Virusinfektionen Nach einer Influenza-Virusinfektion sind Mäuse aufgrund einer Krankheit weniger aktiv und anorexisch, was sich in einem schweren Gewichtsverlust widerspiegelt, einem häufig verwendeten Symptom zur Überwachung der Morbidität der Maus19. Wie in Abbildung 1agezeigt, begannen PR8-Virus-infizierte Mäuse an Tag 6 abzunehmen, erreichten am 8. Tag die höchste Verlust...

Dieses Papier beschreibt Protokolle zur Bewertung der Tfh- und GC-B-Antwort im Mausmodell einer Influenza-Virusinfektion.

Bewertung von T Follicular Helper Cells und Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

Follikuläre T-Helferzellen sind neu identifizierte CD4-T-Zellen-Untergruppen, die B-Zellen in der tierischen Produktion mit hoher Affinität unterstützen. Der Nachweis der Identifizierung von Tfh-Zellen bei einer Influenzavirusinfektion wird neuen Forschern helfen zu verstehen, wie die notwendigen Techniken für Tfh-assoziierte Studien durchgeführt werden können. Da ein ungeeigneter Virustiter zum Tod oder zu einer zu schwachen Immunantwort führen kann, empfehlen wir, den Titer vor der Durchführung eines Experiments zu bestimmen.Für die PR8-Virus-Inokulation von acht Wochen alten männlichen männlichen C57-schwarzen 6 Mäusen. Tauen Sie unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 einen bei minus 80 Grad Celsius gelagerten PR8-Virusbestand auf Eis auf. Wirbeln Sie das Virus vor, um eine homogene Lösung zu erhalten.Verdünnen Sie das Virus in einem vorgekühlten 1,5-Milliliter-Röhrchen auf zwei Plattformeinheiten pro Mikroliter PBS und bestätigen Sie, dass bei den anästhesierten Tieren keine Reaktion auf das Zehenkneifen auftritt. Wirbeln Sie das Virus erneut ein. Laden Sie eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze mit 10 Mikrolitern Virus.Geben Sie vorsichtig Tropfen des Virus in eine Naris von bis zu drei sedierten Tieren, bevor Sie die Impfung auf der anderen Seite wiederholen. Setzen Sie dann alle Mäuse in sternale Lagen in warme Käfige mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung und wiegen Sie jede Maus 10 Tage lang täglich. Setzen Sie die Mäuse am Ende des Versuchs in eine Laminar-Flow-Haube der Biosicherheitsstufe 2 und befestigen Sie das erste Tier auf einem saugfähigen, mit Papier überzogenen Schaumstoff-Sezierbrett.Schneide die Haut mit einer Präparierschere entlang der Bauchmittellinie, dehne die Haut mit einer Pinzette und stecke sie an das Sezierbrett. Öffnen Sie das Peritoneum, um die Milz zu sammeln, und legen Sie die Milz in einen 70-Mikrometer-Filter mit einer 6-Zentimeter-Schale, die 5 Milliliter DMEM enthält, ergänzt mit 1 % FBS. Teilen Sie das Zwerchfell und die Rippen bis zum Thymus und befestigen Sie die Rippe zur Seite, um die Brusthöhle freizulegen.Bewegen Sie die Lunge und das Herz, um den mediastinalen Lymphknoten in der Nähe der ventralen Seite der Luftröhre zu lokalisieren. Legen Sie dann den Lymphknoten in ein eigenes Sieb in eine zweite 6-Zentimeter-Schale mit 5 Millilitern Medium und drücken Sie beide Gewebe mit 3-Milliliter-Spritzenkolben vorsichtig durch das Netz beider Siebe. Spülen Sie jedes Sieb mit 1 Milliliter frischem DMEM plus FBS und geben Sie die Zellsuspensionen in einzelne 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets gründlich in 1 Milliliter frischem DMEM plus FBS pro Röhrchen. Geben Sie dann vier weitere Milliliter Medium in die Milzzellsuspension und legen Sie beide Röhrchen auf Eis. Um die Zellen für die CXCR5-Expression zu färben, drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um es zu mischen, und übertragen Sie es 2 mal 10 auf die 6 Zellen pro Probe in einzelne FACS-Röhrchen.Geben Sie 2 Milliliter Färbepuffer in jedes Röhrchen und mischen Sie die Zellen durch Vortexen. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und die Überstände werden entsorgt. Klopfen Sie jedes Röhrchen zweimal vorsichtig auf saugfähiges Papier und schnippen Sie vorsichtig mit den beiden Böden, um die Zellen im Restüberstand wieder zu suspendieren.Blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 0,2 Mikrolitern Fc-Rezeptorblock pro Röhrchen und schnippen Sie das Röhrchen vorsichtig zum Mischen, bevor Sie die Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis legen. Am Ende der Inkubation 0,3 Mikroliter Biotin Anti-Maus CXCR5 in jedes Röhrchen geben und durch leichtes Schnippen mischen. Legen Sie die Röhren eine Stunde lang auf Eis und schnippen Sie sie nach 30 Minuten leicht.Geben Sie am Ende der Inkubation 2 Milliliter Färbepuffer in die Röhrchen und den Wirbel, um sie zu mischen, bevor Sie die Zellen durch Zentrifugation sedimentieren. Entsorgen Sie den Überstand und schnippen Sie, um die Zellen im Restpuffer wieder zu suspendieren. Legen Sie dann die Röhrchen auf Eis und markieren Sie die Zellen mit Antikörpern gegen den interessierenden Oberflächenmarker, wie in der gerade gezeigten Tabelle dargestellt.Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit 2 Millilitern Färbepuffer und resuspendieren Sie jedes Pellet in 400 Mikrolitern frischem Färbepuffer zur Analyse durch Durchflusszytometrie. Mit dem PR8-Virus infizierte Mäuse beginnen am sechsten Tag abzunehmen, erreichen am achten Tag den höchsten Verlust und kehren am 10. Tag zum Ausgangsgewicht zurück. Wie erwartet wird bei PBS-behandelten Kontrollmäusen kein Gewichtsverlust beobachtet.Eine Virusinfektion führt auch zu einer robusten Lymphozytenexpansion innerhalb des drainierenden Lymphknotens. Wie in der durchflusszytometrischen Analyse beobachtet, initialisiert sich die Differenzierung der follikulären T-Helferzellen am fünften Tag und erreicht am Tag 10 nach der Infektion ihren Höhepunkt mit einer robusten Anzahl von follikulären T-Helferzellen, die bei mit Influenzaviren infizierten Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren induziert werden. Darüber hinaus ist sowohl in den mediastinalen Lymphknoten als auch in der Milz die Anzahl der Influenzaantigen-spezifischen CD4-positiven T-Zellen signifikant induziert im Vergleich zu denen, die bei Kontrollmäusen mit erhöhten Populationen von PD-1-positiven CXCR5-positiven Zellen bei PR8-Tieren beobachtet wurden.Darüber hinaus zeigt die intrazelluläre Färbung von IL-21, dass eine PR8-Infektion eine signifikant höhere Produktion dieses Zytokins als Reaktion auf eine Virusinfektion induziert. Die Immunfluoreszenzfärbung weist auf das Vorhandensein einer induzierten Keimzentrumsreaktion bei PR8-infizierten Mäusen hin, und der ELISA zeigt die Bildung von Influenzavirus-spezifischen Antikörpern bei virusinfizierten Tieren. Es ist wichtig, die CXCR5-Färbung eine Stunde lang auf Eis durchzuführen, da die Qualität der Färbung durch die Färbetemperatur und die Zeit beeinflusst wird.Obwohl wir CXR5- und IL-21-Färbungen nachweisen konnten, können andere Oberflächenmarker, Transkriptionsfaktoren und Zytokine mit dieser Methode bewertet werden, um eine Vielzahl von Informationen über die Tfh-Differenzierung und -Funktion zu liefern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Zwei auf Durchflusszytometrie basierende Methoden – ein in vitro T-Zell-Priming-Assay und intrazelluläre Zytokinfärbung – wurden verwendet, um die Antigenpräsentationskapazität von dendritischen Zellen und antigenspezifische T-Zell-Antworten auf eine West-Nil-Virus-mutierte Infektion bei Mäusen zu messen.

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Es besteht ein allgemeiner Mangel an Wissen darüber, wie Impfstoffe wirken. Hier schlagen wir die kombinierte Verwendung von reverser Genetik und chimären Knochenmarkmäusen vor, um Einblicke in die frühen Immunantworten des Wirts auf Impfstoffe zu erhalten, mit besonderem Fokus auf dendritische Zellen und T-Zell-Immunität.

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