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Methodenartikel

Generierung transgener Ratten mit einem Lentiviral Vector Ansatz

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DOI:

10.3791/60570

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17. Mai 2020

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1Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel zielt darauf ab, die Methodik für die lentivirale Transgenese bei Rattenembryonen unter Verwendung mehrerer Injektionen einer Virussuspension in den zygoten Perivitelline-Raum bereitzustellen. Weibliche Ratten, die mit einem fruchtbaren männlichen Stamm mit einer anderen dominanten Fellfarbe gepaart werden, werden verwendet, um pseudoschwangere Pflegemütter zu erzeugen.

Zusammenfassung

Transgene Tiermodelle sind für die moderne biomedizinische Forschung von grundlegender Bedeutung. Die Einbindung fremder Gene in frühe Maus- oder Rattenembryonen ist ein unschätzbares Werkzeug für die Genfunktionsanalyse in lebenden Organismen. Die Standard-Transgenese-Methode basiert auf der Mikroinjektion fremder DNA-Fragmente in einen Pronukle einer befruchteten Oozyte. Diese Technik ist bei Mäusen weit verbreitet, bleibt aber bei anderen Tierarten relativ ineffizient und technisch anspruchsvoll. Das Transgen kann auch über eine Lentiviralinfektion in einzellige Embryonen eingebracht werden, was eine wirksame Alternative zu standardpronuklearen Injektionen darstellt, insbesondere bei Arten oder Stämmen mit einer anspruchsvolleren Embryostruktur. Bei diesem Ansatz wird eine Suspension, die lentivirale Vektoren enthält, in den Perivitelinraum eines befruchteten Rattenembryons injiziert, der technisch weniger anspruchsvoll ist und eine höhere Erfolgsrate hat. Es wurde gezeigt, dass Lentivirale Vektoren das Transgen effizient in das Genom integrieren, um die Erzeugung stabiler transgener Linien zu bestimmen. Trotz einiger Einschränkungen (z. B. Anforderungen an die Biosicherheitsstufe 2, Grenzwerte für die Größe von DNA-Fragmenten) ist die lentivirale Transgenese eine schnelle und effiziente Transgenesemethode. Zusätzlich wird die Verwendung weiblicher Ratten, die mit einem fruchtbaren männlichen Stamm mit einer anderen dominanten Fellfarbe gepaart sind, als Alternative zur Erzeugung pseudoschwangerer Pflegemütter dargestellt.

Einleitung

Seit vielen Jahren werden Labornagetiere wie Ratten und Mäuse verwendet, um menschliche physiologische und pathologische Bedingungen zu modellieren. Tierforschung hat zu Entdeckungen geführt, die auf andere Weise unerreichbar waren. Zunächst konzentrierten sich genetische Studien auf die Analyse spontan auftretender Störungen und Phänotypen, die den menschlichenZustandeng nachahmen 1 . Die Entwicklung gentechnischer Methoden ermöglichte die Ein- oder Löschung bestimmter Gene, um einen gewünschten Phänotyp zu erhalten. Daher wird die Erzeugung transgener Tiere als eine grundlegende Technik in der modernen Forschung anerkannt, die Studien über die Genfunktion in lebenden Organismen ermöglicht.

Die transgene Tiertechnologie ist durch eine Kombination von Errungenschaften in der experimentellen Embryologie und Molekularbiologie möglich geworden. In den 1960er Jahren veröffentlichte der polnische Embryologe A. K. Tarkowski die ersten Arbeiten zur Manipulation von Mausembryonen in den frühen Stadien der Entwicklung2. Zusätzlich entwickelten Molekularbiologen Techniken zur Erzeugung von DNA-Vektoren (d.h. Trägern) für die Unterweise der Einschleppung fremder DNA in das Genom des Tieres. Diese Vektoren ermöglichen die Ausbreitung ausgewählter Gene und deren entsprechende Modifikation, abhängig von der Art der Forschung, die durchgeführt wird. Der Begriff "transgenes Tier" wurde von Gordon und Ruddle3eingeführt.

Die erste weithin akzeptierte Art, die in der Neurobiologie, Physiologie, Pharmakologie, Toxikologie und vielen anderen Bereichen der biologischen und medizinischen Wissenschaften verwendet wurde, war die Norwegische Ratte, Rattus norvegicus4. Aufgrund der Schwierigkeit, Rattenembryonen zu manipulieren, ist die Hausmaus Mus musculus jedoch die dominierende Tierart in der Genforschung geworden5. Ein weiterer Grund für den Vorrang der Maus in solchen Forschungen war die Verfügbarkeit embryonaler Stammzelltechnologie, um Knockout-Tiere für diese Art zu erzeugen. Die am häufigsten verwendete Technik der Transgenese (2–10% der transgenen Nachkommen im Vergleich zu allen geborenen Tieren) ist die Mikroinjektion von DNA-Fragmenten in einen Pronukle einer befruchteten Oozyte. 1990 wurde dieser Ansatz, der erstmals bei Mäusen eingeführt wurde, für Ratten6,7angepasst. Rattentransgenese durch pronukleare Injektion ist durch eine geringere Effizienz8 im Vergleich zu Mäusen gekennzeichnet, die eng mit dem Vorhandensein von elastischem Plasma und pronukleären Membranen 9 zusammenhängt.9 Obwohl das Überleben von Embryonen nach Dermanipulation um 40–50 % niedriger ist als bei Mäusen, gilt diese Technik als Standard bei der Erzeugung genetisch veränderter Ratten10. Es wurden alternative Ansätze untersucht, die eine effiziente Transgenintegration und höhere Überlebensraten von injizierten Zygoten gewährleisten können.

Der Schlüsselfaktor für eine stabile Transgenexpression und Übertragung auf Nachkommen ist seine Integration in das Wirtszellgenom. Lentiviren (LVs) haben das Unterscheidungsmerkmal, dass sie sowohl teilende als auch nicht trennende Zellen infizieren können. Ihre Verwendung als Werkzeug für die Aufnahme heterologer Gene in Embryonen erwies sich als hocheffizient11, und transgene Individuen zeichnen sich durch eine stabile Expression des eingebauten DNA-Fragments aus. Die Wirksamkeit von lentiviralen Vektoren wurde für die genetische Veränderung von Mäusen12,13, Ratten12,14und anderen Arten11bestätigt. Bei dieser Methode wird die LV-Suspension im Stadium von zwei Vorkernen unter die Zona pellucida des Embryos injiziert. Diese Technik garantiert im Wesentlichen ein 100%-Überleben der Embryonen, da das Oolemma nicht betroffen bleibt. Entscheidend ist die Herstellung hochwertiger und relativ hochkonzentrierter LV-Aufhängungen. Niedrigere Konzentrationen von LV-Suspensionen können jedoch durch wiederholte Injektionen überwunden werden11, was die Menge an Viruspartikeln an der Eioberfläche erhöht, ohne die Membranintegration zu beeinträchtigen. Embryonen, die wiederholten Injektionen in den Perivitelline-Raum ausgesetzt sind, entwickeln sich weiter, und transgene Nachkommen können das Transgen durch die Keimbahn übertragen. Die Effizienz der transgenen Rattenerzeugung durch lentivirale Transgenese kann bis zu 80%12betragen.

Hier beschreiben wir die Produktion von HIV-1-abgeleitetem rekombinantem Lentivirus, das pseudotypisiert mit vesikulärem Stomatitisvirus (VSV) G-Hüllprotein war. Der Einsatz des Verpackungssystems VSV-Pseudotyp der zweiten Generation bestimmt die große Infektiosität von Viruspartikeln und ermöglicht die Produktion hochstabiler Vektoren, die durch Ultrazentrifugation und Kryopreservede konzentriert werden können. Nach der Titer-Verifizierung sind die Vektoren bereit, als Vehikel für die Transgenabgabe in Albino Wistar Rattenzygoten verwendet zu werden. Nach einer Reihe von Injektionen können die Embryonen über Nacht kultiviert und im Zwei-Zellen-Stadium an Pflegemütter übertragen werden. An dieser Stelle kann einer von zwei alternativen Ansätzen in Betracht gezogen werden. Das Standardverfahren verwendet pseudoschwangere Weibchen als Embryo-Empfänger. Wenn die Schwangerschaftsrate nach der Paarung mit vasectomisierten Männchen niedrig ist, können die Embryonen jedoch in schwangere Wistar/Sprague-Dawley (SD) Weibchen implantiert werden, die mit fruchtbaren männlichen Ratten mit einer dunklen Fellfarbe gepaart sind (z. B. Brown Norway [BN] Ratten). Die Farbe des Fells ermöglicht die Unterscheidung von Nachkommen von natürlicher Schwangerschaft von Nachkommen, die aus den übertragenen manipulierten Embryonen stammen.

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Protokoll

Die Herstellung und Anwendung von Virusvektoren entsprach den Richtlinien der Biosicherheitsstufe 2 und wurde vom polnischen Umweltministerium genehmigt. Alle versuchsweisen Tierverfahren, die unten beschrieben werden, wurden von der Lokalen Ethikkommission genehmigt. Die Tiere wurden in individuell belüfteten Käfigen bei stabiler Temperatur (21–23 °C) und Luftfeuchtigkeit (50–60%) untergebracht. mit ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung unter einem 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklus.

1. Lentivirale Vektorproduktion

  1. Transfektion von HEK 293T-Zellen
    HINWEIS: Das hier vorgestellte Protokoll ist für die Transfektion von zwanzig bis 10 cm großen Kulturgerichten konzipiert, die etwa 200 ml rohen Vektorüberstand esen lassen.
    1. Kultur HEK 293T-Zellen in DMEM-Medium, das mit fetalem Rinderserum (10%,2 v/v) in einem befeuchteten CO2-Inkubator bei 37 °C ergänzt wird. Für die Transfektion 20 10 cm Durchmesser Platten vorbereiten, und Samen 1,5–2 x 106 HEK 293T Zellen pro Schale.
    2. Wenn der Zusammenfluss 70 % erreicht, transfeken Sie die Zellen mit Polyethylenimin (PEI)-Reagenz, pH 7,0, im Verhältnis von 3 g PEI pro 1 g DNA.
      1. Bereiten Sie die Transfektionsmischung für fünf Teller vor (bereiten Sie die Anzahl der Wiederholungen entsprechend der Gesamtzahl der Gerichte). Fügen Sie die Mischung aus drei Plasmiden auf 1 ml des Modifizierten Eagle Mediums (DMEM; ohne Serum) von Dulbecco hinzu, so dass sie eine Endmenge von 25 g VSVg-Plasmid, 50 g Delta R8.2 und 50 g kodierender Plasmid erreichen.
      2. Pipette nach oben und unten, und fügen Sie 125 l PEI in einer Konzentration von 3 g / l. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min, invertieren sie das Rohr dreimal während der Inkubation. Fügen Sie 200 l des Transfektionsgemisches pro Platte hinzu. Als nächstes inkubieren Sie die2 Platten in einem befeuchteten CO2-Inkubator bei 37 °C.
  2. Konzentration von lentiviralen Vektoren
    1. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion ernten Sie das Medium, das LV-Partikel enthält. Verwenden Sie 50 ml konische Rohre.
      HINWEIS: Bei Verwendung eines Plasmids mit einem fluoreszierenden Tag können Zellen an dieser Stelle visualisiert werden, um die Transfektionseffizienz zu überprüfen. Ein neuer Teil des DMEM-Mediums kann hinzugefügt werden, und Zellen können für weitere 24 h inkubiert werden. Die LV-Ausbeute ist vergleichbar, wenn sie bei den 48 und 72 h-Zeitpunkten nach der Transfektion gesammelt wird.
    2. Zentrifugieren Sie das Medium bei 3.000 x g für 5 min und Raumtemperatur, um abgetrennte Zellen zu entfernen.
    3. Filtern Sie den Überstand (0,45 m) und gießen Sie ihn in neue Schläuche.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann weggelassen werden.
    4. DNase I (RNase-frei, 1 g/ml) und MgCl2 (1 mM) hinzufügen und in einem Wasserbad bei 37 °C für 15 min inkubieren.
    5. Übertragen Sie die mittleren zu Einweg-Polyethylen-Rohre und Ultrazentrifuge in einem schwingenden Rotor bei 115.000 x g und 4 °C für 1,5 h.
    6. Nach dem Zentrieren die Wände der Rohre vorsichtig von den mediumRückständen abtropfen lassen.
    7. Das Pellet mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS; 70–80 l pro Tube) einweichen.
    8. 2 h bei 4–8 °C inkubieren.
    9. Setzen Sie die viralen Vektoren in PBS durch sanftepipettierende Übertragung endiel.
      VORSICHT: Vermeiden Sie Schaumbildung.
    10. Auf ein 1,5 ml Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 7.000 x g und 4 °C für 30 s übertragen. Überleitung des Überstandes auf ein neues Rohr übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis kein zelluläres Schmutzpellet sichtbar ist.
    11. Aliquot und einfrieren bei -80 °C. Vermeiden Sie das erneute Einfrieren des LV aliquot.
  3. Bestimmung des Virustiters mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion
    HINWEIS: Die Titration viraler Vektoren erfolgt mit quantitativer PCR (qPCR). Diese Methode basiert auf der Verstärkung eines doppelsträngigen 84 bp langen DNA-Fragments innerhalb des langen terminalen Repeat-Bereichs des viralen Genoms15.
    1. Bereiten Sie die Standardkurve vor, indem Sie serielle Verdünnungen des LV-Kodierungsplasmids erstellen: 1:500, 1:1.000, 1:5.000, 1:10.000, 1:100.000 und 1:1.000.000. Bestimmen Sie die Anzahl der Kopien des Plasmids, die für die Standardkurve verwendet werden. Verwenden Sie die folgende Formel: Anzahl der Kopien/ L = (Konzentration [g/l] x 6,02 x 1023 [Zahl/mol]) / (660 [g/mol] x Plasmidgröße [bp]), wobei 6,02 x 1023 Zahl/Mol die Zahl von Avogadro und 660 g/mol das bp-Gewicht ist.
      HINWEIS: Online-Kopiernummernrechner können verwendet werden.
    2. Vorbereiten von Verdünnungen der lentiviralen Suspension: 1:100, 1:500 und 1:1.000.
    3. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch (Volumen pro Bohrung): 10 l qPCR Mastermix, 1 l von 10 'M Vorwärtsprimer, 1 l von 10 'M Reverse Primer und 7 'L von H2O. Pipette das Gemisch in die Bohrungen von 96-Well-Platten.
      HINWEIS: Vorwärtsgrundierung: 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA. Reverse Primer: 5'-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA.
    4. Fügen Sie 1 l jeder Standardverdünnung und lentiviralen Suspension in Dreifachersäure hinzu.
    5. Führen Sie die qPCR nach folgenden Parametern aus: 50 °C für 2 min, 96 °C für 5 min und 35 Zyklen von 96 °C für 20 s, 60 °C für 40 s und 70 °C für 1 min, gefolgt von Schmelzkurvenstufe: 95 °C für 1 min und 60 °C bei 30 s.
    6. Analysieren Sie die Ergebnisse, indem Sie die Anzahl der Moleküle, die für jede Verdünnung empfangen werden, mit der Standardkurve vergleichen. Bestimmen Sie die Konzentration von Vektormolekülen als Durchschnitt von drei Replikationen für jede Verdünnung.
      HINWEIS: Die vorgestellte Quantifizierung gibt die physikalische Konzentration der virusischen Partikel an. Es sollte nicht als funktioneller Titer behandelt werden.

2. Erzeugung von transgenen Ratten

  1. Superovulation und Sammlung befruchteter Embryonen
    1. Gonadotropine verabreichen.
      HINWEIS: Um die Anzahl der gesammelten Embryonen (ca. 30 pro Weibchen) zu erhöhen, verwenden Sie unreife 5 Wochen alte Wistar-Weibchen zur hormonellen Stimulation.
      1. Am 1. Tag (12–13 Uhr) injizieren sie das Serum gonadotropin der trächtigen Stute (PMSG; 25 I.E. pro Weibchen). Bereiten Sie 1 ml Aliquots der Arbeitslösung in einer Konzentration von 125 I.E./ml vor, indem Sie Hormonpulver in 0,9% NaCl auflösen. Bei -20 °C bis zu 1 Monat oder -80 °C für bis zu 6 Monate lagern.
      2. Am 3. Tag (12.00–10.00 Uhr) wird das menschliche Choriongonadotrophin (hCG; 30 I.E. pro Weibchen) intraperitoneal injiziert. Bereiten Sie 1 ml Aliquots der Arbeitslösung (150 I.E./ml) durch Auflösen von Hormonpulver in 0,9% NaCl vor. Bei -20 °C bis zu 1 Monat oder -80 °C für bis zu 6 Monate lagern.
    2. Nach hCG-Verabreichung paaren Weibchen 1:1 mit sexuell fruchtbaren Männchen (3-10 Monate alt).
    3. Am nächsten Morgen (Tag 4 um 8–10 Uhr) überprüfen Sie die Weibchen auf das Vorhandensein eines Vaginalsteckers. Überprüfen Sie die vaginale Öffnung auf das Vorhandensein eines weißlichen Steckkerzes, der für die beste Visualisierung am frühen Morgen nach der Paarungsnacht überprüft werden sollte. Für die Embryo-Sammlung verwenden Sie nur Weibchen mit einem sichtbaren Stecker.
    4. Sammeln Sie Embryonen um 10 Uhr. Opfern Sie die Tiere, um die Eileiter zu verbrauchen, und sammeln Sie die Eileiter in einer Schüssel mit vorgewärmten M2 Medium.
      1. Übertragen Sie die Eileiter auf eine 35-mm-Schale, die vorgewärmtes M2-Medium mit Hyaluronidase aus Rinderhoden in einer Konzentration von 0,5 mg/ml enthält.
      2. Öffnen Sie die Wände des Eileiters mit feiner Zange unter einem Stereomikroskop und drücken Sie die Ampulla (d.h. den geschwollenen Teil des Eileiters, der befruchtete Embryonen enthält, die von Cumuluszellen umgeben sind), bis die Embryonen befreit sind.
        HINWEIS: Hyaluronidase verdaut Zellvon- und Zellerzellen enzymatisch und setzt Embryonen frei.
        VORSICHT: Eine längere Exposition gegenüber Hyaluronidase ist schädlich für Embryonen; Daher sollte dieser Schritt nicht länger als 5 min dauern.
      3. Um die Freisetzung von Embryonen aus Cumuluszellen zu erleichtern, pipetten Sie sie vorsichtig mit einer Glastransferpipette, die mit einem mundbetätigten Saugrohr verbunden ist.
        1. Um die Transferpipette zu produzieren, ziehen Sie eine glasige Pasteurpipette über eine Flamme, um eine gerade Spitze von 5-10 cm zu erzeugen. Brechen Sie die Pipette und hinterlassen Sie eine Spitze von 4 cm.
      4. Waschen Sie die Embryonen ein paar Mal in M2 Medium, um Hyaluronidase und zelluläre Ablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie die Embryonen in eine 60-mm-Schale, die Tropfen vorädglichem M16-Medium, bedeckt mit flüssigem Paraffin oder Mineralöl, in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einerCO2-Atmosphäre von 5 % enthält.
  2. Mikroinjektion von lentiviralen Vektoren in einzelligen Embryo unter der Zona pellucida
    HINWEIS: Verwenden Sie einzellige Embryonen mit zwei sichtbaren Vorkernen für die Mikroinjektion (Abbildung 1).
    1. Das LV aliquot bei Raumtemperatur und Zentrifuge bei 10.000 x g und RT für 2 min auftauen, um restliche Zellreste zu pellet.
    2. Microinjection-Setup
      1. Bereiten Sie Glashaltepipetten (Borosilikatglaskapillare) mit einer Mikroschmiede vor. Ziehen Sie die Glaskapillare über eine Flamme, um eine 5–10 cm Spitze zu erzeugen. Brechen Sie die Pipette und hinterlassen Sie eine Spitze von 4 cm. Der Außendurchmesser sollte 80–120 m betragen.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze perfekt gerade und glatt ist.
      2. Montieren Sie die gezogene Pipette in einer Mikroschmiede mit der Spitze vor dem Heizfilament. Erhitzen Sie das Filament sehr nahe an der Pipettenspitze und lassen Sie es auf einen Durchmesser von 15 m schrumpfen (ca. 20% der Embryogröße). Positionieren Sie die Pipette senkrecht zum Heizfilament, 2–3 mm von der Pipettenspitze entfernt, und beginnen Sie zu erwärmen. Das Glas wird weicher. Erhitzen, bis es einen 15°-Winkel erreicht.
      3. Bereiten Sie Mikroinjektion Borosilikat Glas kapillaren mit einem Filament mit einem Pipettenzieher. Setzen Sie die Kapillare in die Zugkammer ein. Führen Sie einen Rampentest durch (erstmals für neues Glas und jedes Mal nach dem Wechseln des Filaments). Stellen Sie die Hitze auf den Rampenwert -10, Ziehen sie auf 100, die Geschwindigkeit auf 150 und die Zeit auf 100.
        HINWEIS: Ändern Sie die Parameter, um eine optimale Injektionskapillare zu erhalten.
      4. Unter einer biosafety laminaren Durchflusshaube laden Sie ca. 2 l der virusfreien Lösung mit einer Mikroladerspitze in die Mikroinjektionspipette.
      5. Bereiten Sie eine Mikroinjektionsschale (Deckel von 60 mm Petrischale) mit einem 100 l Tropfen M2 Medium (in der Mitte), bedeckt mit flüssigem Paraffin oder Mineralöl.
      6. Montieren Sie die Haltepipette und Die Mikroinjektionskapillare, die mit viraler Lösung beladen ist, unter einem invertierten Mikroskop mit einer Mikromanipulator- und Mikroinjektionsschale.
    3. Führen Sie die Mikroinjektion durch.
      1. Übertragen Sie 15–20 einzellige Embryonen auf den M2-Tropfen auf der Mikroinjektionsschale. Halten Sie den Embryo mit einer Haltepipette.
      2. Mit 400-facher Vergrößerung injizieren Sie die LV-Lösung unter der Zona pellucida mit der Glaskapillare, die mit einem automatischen Injektor verbunden ist, in den Perivitelline-Raum. Halten Sie die Kapillare unter der Zona pellucida für einen Moment.
        HINWEIS: Mit sanftem Gegendruck fließt die virusvirale Lösung kontinuierlich aus der Injektionskapillare, aber das Volumen der suspension, die geliefert wird, kann nicht kontrolliert werden.
      3. Mit einer feinen Pipette die Embryonen bei 37 °C in einer 5%-CO2-Atmosphäre in die Kulturschale im Brutkasten zurückbringen.2 Die Anzahl der Injektionen einer Zygote kann variieren und kann basierend auf der viralen Vektorkonzentration angepasst werden.
        HINWEIS: Die injizierten Embryonen können im Einzellstadium oder inkubiertem O/N in M16-Medium an Pflegemütter übertragen werden, bevor sie im Zweizellstadium übertragen werden. Längere In-vitro-Kultur von Rattenembryonen sollte vermieden werden.
  3. Transfer von injizierten Embryonen an Pflegemütter
    1. Bereiten Sie Pflegemütter vor, indem Sie geschlechtsreife SD-Weibchen mit fruchtbaren BN-Männchen oder mit vasectomisierten SD-Männchen (das Vasektomie-Verfahren wird in Abschnitt 3 unten beschrieben) am Tag 3 (für die Übertragung von Embryonen im Einzellstadium) oder Tag 4 (für die Übertragung von Embryonen im Zwei-Zell-Stadium) paaren.
      HINWEIS: Für die Oviduct-Übertragung verwenden Sie 0,5 Tage nach coitum (dpc) Weibchen.
    2. Überprüfen Sie am nächsten Morgen SD-Weibchen auf einen Vaginalstecker, und verwenden Sie nur solche mit einem sichtbaren Stecker.
    3. Embryotransfer durchführen.
      HINWEIS: Führen Sie den chirurgischen Eingriff mit sterilen Instrumenten unter einem Stereomikroskop durch. Vor dem Tag der Operation, AutoklavSchere, feine Zange, Nadelhalter und Skalpellhalter.
      1. Anästhetisieren Sie ein Weibchen mit i.p. Verabreichung von Ketamin (50 mg/kg) und Medetomidin (0,5 mg/kg) Lösung. Testen Sie auf Reflexe, um die Anästhesie zu bestätigen, bevor Sie mit dem chirurgischen Eingriff beginnen.
      2. Injizieren Sie das Tier subkutan mit Tolefenaminsäure (2 mg/kg), Butorphanoltartrat (1 mg/kg) und Enrofloksacin (5–10 mg/kg), um Entzündungen, Schmerzen und Infektionen zu verhindern.
      3. Tragen Sie die ophthalmologische Salbeschmierung auf beide Augen auf, um eine Hornhauttrocknung zu verhindern. Rasieren Sie das Fell von der Rückseite, und sterilisieren Sie die Haut mit chirurgischem Peeling gefolgt von 70% Alkohol mit sterilen nicht haftenden Pads. Lassen Sie die Haut trocknen.
      4. Injizieren Sie das Tier subkutan mit 100 l 0,25% Bupivacain (Lokalanästhetikum) an der Einschnittstelle. Übertragen Sie das Tier in einer anfälligen Position auf eine saubere Oberfläche auf einem Heizkissen unter dem Ziel eines chirurgischen Mikroskops. Bedecken Sie die Ratte mit einem sterilen Vorhang mit einem kleinen Loch, das über den unteren Rücken geschnitten wird.
      5. Führen Sie einen ca. 2 cm langen Hautschnitt parallel zur Lendenwirbelsäule durch.
      6. Mit einer scharfen Schere, machen Sie einen Schnitt in der Bauchwand. Schnappen Sie sich ein Eierstockfettpad mit Zangen, ziehen Sie den Eierstock und das Eileiter heraus und legen Sie sie auf Gaze, die mit 0,9% NaCl benetzt wird.
      7. Aspirieren Sie M2 medium, drei Luftblasen und die Embryonen in die Transferkapillare. Empfohlene Gesamtzahl der zu übertragenden Embryonen (einseitig oder bilateral): schwangere Weibchen (ca. 15–16 Embryonen), pseudoschwangere Weibchen (ca. 30 Embryonen).
      8. Machen Sie einen kleinen Schnitt im Eileiter (zwischen infundibulum und ampulla) mit Mikroschere, und legen Sie die Transferpipette in das Eileiter.
      9. Tragen Sie Embryonen und Luftblasen vorsichtig von der Pipette zum Eileiter. Mit stumpfer Zange, legen Sie den Fortpflanzungstrakt wieder in die Bauchhöhle.
      10. Die Bauchwand mit polyglykolsäureabsorbierbaren Nähten bedecken und den Hautschnitt mit Wundclips schließen. Abhängig von der Anzahl der verfügbaren Embryonen, wiederholen Sie dieses Verfahren für das andere Eileiter.
      11. Injizieren Sie das Tier intraperitoneal mit Atipamezol (0,5 mg/kg), um die Wirkung der Anästhesie umzukehren.
      12. Übertragen Sie das Tier in einen sauberen Käfig und halten Sie es auf einer wärmenden Platte, um sich vollständig von der Anästhesie zu erholen. Die Lieferung bei Ratten erfolgt nach 21 Tagen.
        HINWEIS: Wenn männliche BN-Ratten zur Paarung verwendet werden, sind nur weiße Welpen potenziell transgen; braune Welpen stammen aus natürlicher Schwangerschaft.
      13. Sammeln Sie Gewebefragmente (vorzugsweise vom Ohr) zu Genotyp 3 Wochen alten Welpen.

3. Vasektomie

HINWEIS: Vor dem Tag der Operation, AutoklavSchere, feine Zange und Nadelhalter.

  1. Anästhetisieren Sie eine 5 Wochen alte männliche SD-Ratte mit i.p. Verabreichung von Ketamin (50 mg/kg) und Medetomidin (0,5 mg/kg) Lösung. Testen Sie auf Reflexe, um die Anästhesie zu bestätigen, bevor Sie mit dem chirurgischen Eingriff beginnen.
  2. Tolfenamsäure (2 mg/kg), Butorphanoltartrat (1 mg/kg) und Enrofloksacin (5–10 mg/kg) subkutan verabreichen, um Entzündungen, Schmerzen bzw. Infektionen zu verhindern.
  3. Tragen Sie die ophthalmologische Salbeschmierung auf beide Augen auf, um eine Hornhauttrocknung zu verhindern. Legen Sie die Ratte auf eine saubere Oberfläche auf einem Heizpad, und sterilisieren Sie die Haut auf den Hoden mit chirurgischem Peeling gefolgt von 70% Alkohol mit sterilen nicht haftenden Pads. Lassen Sie die Haut trocknen. Bedecken Sie die Ratte mit einem sterilen Vorhang mit einem kleinen Loch, das über die Hoden geschnitten wird. Drücken Sie vorsichtig den Bauch, um die Hoden im Skrotalsack freizulegen.
  4. Mit einer chirurgischen Schere, machen Sie einen Schnitt von 0,5 cm in der Mitte des Skrotalsacks. Suchen Sie die Mittellinie (weißliche Linie) zwischen den Hoden.
  5. Machen Sie einen 5 mm Schnitt in der Hodenmembran in der Nähe der linken Seite der Mittellinie Wand.
  6. Schieben Sie den Hoden vorsichtig nach links und lokalisieren Sie Vas deferens (zwischen Hoden und Mittellinie) als weißen Kanal mit einem einzigen Blutgefäß.
  7. Ziehen Sie die Vasen vorsichtig mit der Zange eines Uhrmachers aus dem Skrotalsack. Halten Sie die Vas deferens mit einem Paar Zangen, und schneiden Sie es mit feiner Schere (oder kauterisieren mit rot-heißen Spitzen eines zweiten Paares von Zangen). Entfernen Sie ein 1 cm großes Fragment des Kanals.
    HINWEIS: Wenn eine Kauterisierung durchgeführt wird, halten Sie die Spitze des zweiten Zangenpaares in der Flamme.
  8. Wiederholen Sie das obige Verfahren für die anderen Hoden. Die Haut mit polyglykolsäureregetisierbaren Nähten bedecken und das Tier intraperitoneal mit Atipamezol (0,5 mg/kg) injizieren.
  9. Legen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig auf eine wärmende Platte, bis sich das Tier von der Anästhesie erholt.
    HINWEIS: Männchen können in den Testpaarungen nach einer 2-wöchigen Erholungsphase verwendet werden. Nachdem die Sterilität bestätigt wurde, können sie für die Pseudoschwangerschaftsinduktion verwendet werden.

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Ergebnisse

Unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls wurden lentivirale Vektoren hergestellt, die das Syn-TDP-43-eGFP-Konstrukt trugen (physikalischer LV-Titer = 3,4 x 108/L) und konnten dann für subzonale Injektionen im Einzellstadium des Embryos verwendet werden. Nur Embryonen mit zwei sichtbaren Vorkernen wurden dem Verfahren unterzogen. Die Anzahl der Injektionen von viralen Suspensionen wurde experimentell bestimmt. Eine hohe Implantationseffizienz und ein gleichzeitiger Mangel an transgenen Nachkommen wurd...

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Diskussion

Fortschritte in den transgenen Technologien haben Nagetiermodelle zu einem unschätzbaren Werkzeug in der biomedizinischen Forschung gemacht. Sie bieten die Möglichkeit, Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir eine weit verbreitete Alternative zur konventionellen Transgenese durch pronukleäre Injektionen vor. Die Verwendung von lentiviraler Gentransduktion umgeht die Notwendigkeit anspruchsvoller Mikroinjektionen, da virale Vektoren unter der Zona pellucida injiziert werden können. Dieser Ans...

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Offenlegungen

Der Autor (W.K.) hat Rechte an dem Patent "Methode zur Herstellung eines transgenen Tieres" des Patentamts der Republik Polen (Nr. P 355353; 21.03.2008).

Danksagungen

Diese Studie wurde durch das ANIMOD-Projekt im Rahmen des Team Tech Core Facility Plus-Programms der Stiftung für polnische Wissenschaft unterstützt, das von der Europäischen Union aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung an die WK kofinanziert wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
7500 Real Time PCR SystemApplied Biosystems
Aerrane (Isofluran)BaxterFDG9623
Aspirator-Röhrchenbaugruppen für kalibrierte MikrokapillarpipettenSigmaA5177-5EA
Atipam 5 mg/mlEurovet Animal Health BVN/A0,5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (Enrofloksacin)BayerN/A5-10 mg/kg
Borosilikatglas Kapillaren mit Filament GC100TF-15Harvard Apparatus Limited30-0039Injektionskapillare
Bupivacain 25 mg/mlAdvanz PharmaN/A0,25 % in  0,9 % NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorphanol  Tartrat)Orion PharmaN/A1 mg/kg
CELLSTAR Gewebe-Zellkulturschale 35 mmGreiner Bio-One627160
CELLSTAR Gewebe Zellkulturschale 60 mmGreiner Bio-One628160
CellTram ÖlEppendorf5176 000.025
Cepetor (Medetomidin) 1 mg/mlcp-pharmaN/A0,5 mg/kg
Chorulon, Humanes Choriongonadotropin IntervetN/A150 IE/ ml ml 0,9 % NaCl
DMEM niedriger GlukosegehaltSigma AldrichD6048
DNase, RNase-freiA& A Biotechnologie1009-100
EmbryoMax gefiltertes leichtes MineralölSigmaES-005-C
Hüllprotein-kodierendes Plasmid für lentivirale Vektoren (VSVg-Plasmid) ADDGENE14888
FemtoJetEppendorf4i /5252 000.013
Fötales RinderserumSigma AldrichF9665-500ML
Folligon, trächtige Stute s Serum Gonadotropin IntervetN/A125 I.E./ml in .9% NaCl
HEK 293T Zellen ATCCATCC CRL-3216
Hyaluronidase aus RinderhodenSigmaH4272-30MG0,5 mg/ml in M2 Medium
Inverses Mikroskop ZeissAxiovert 200
Ketamin 100mg/mlBiowet PulawyN/A50 mg/kg
Flüssiges ParaffinMerck Millipore8042-47-5
M16 Medium EmbryoMaxSigmaMR-016-D
M2 MediumSigmaM7167
Magnesiumchlorid 1MSigma Aldrich63069-100ML
MicroforgeNarishigeMF-900
MineralölSigmaM8410-500ML
NaCl 0,9%POLPHARMA OTCN/Asteril, 5ml Ampullen
Operationsmikroskop Inami Ophthalmic InstrumentsDeca-21
Verpackungssystem zur Kodierung von Plasmiden für lentivirale Vektoren  (delta R8.2 Plasmid)ADDGENE12263
PEI Reagenz (Polyethylenimin, Mw ~ 25.000,),Polysciences, Inc23966-1
Penicilin-StreptomycinSigma AldrichP0781-100ML
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für ZellkulturSigma Aldrich806552-500ML
Abzieher Sutter Instrument Co.P-97
Reflex Clip Applier/Reflex ClipsWorld Precision Instruments500345/500346
Safil, Polyglykolsäure, geflochten, beschichtet, resorbierbare FädenB.Braun Chirurgisches1048029
StereomikroskopOlympusSZX16
Chirurgisches NähgarnB.Braun 
SYBR Green PCR Master MixAngewandtes Biosystem4334973
Tolfedin 4% (Tolfenaminsäure)VetoquinolN/A2 mg/kg
TransferMan NK2EppendorfN/A
Trypsin EDTA-LösungSigma AldrichT3924-500ML
UltrazentrifugeBeckman CoulterOptima L-100 XP 
VacuTipEppendorf5175108.000Halter Kapillare
Vita-POSUrsapharmN/AAugensalbe
WarmhalteplatteSemicN/A
UhrmacherzangeVWR470018-868
C1048040

Referenzen

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