Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Prozess zur Herstellung hochtiter infektiöser viraler pseudotypisierter Partikel (pp) mit Hüllglykoproteinen aus zwei Influenza-A-Stämmen und wie ihre Infektiosität bestimmt werden kann. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig, um pps von jeder anderen Art von umhüllten Viren mit verschiedenen Hüll-Glykoproteinen zu entwickeln.
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Methodenartikel
Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die gelegentliche direkte Übertragung des hoch pathogenen Aviären Influenza-A-Virus H5N1 (HPAI H5N1) und H7N9 auf den Menschen und ihre Letalität sind ernste Probleme der öffentlichen Gesundheit und deuten auf die Möglichkeit einer Epidemie hin. Unser molekulares Verständnis des Virus ist jedoch rudimentär, und es ist notwendig, die biologischen Eigenschaften seiner Hüllproteine als therapeutische Ziele zu untersuchen und Strategien zur Bekämpfung von Infektionen zu entwickeln. Wir entwickelten eine solide virale pseudotypisierte Partikel-(pp)-Plattform zur Untersuchung des Aviären Influenzavirus, einschließlich der funktionellen Analyse seiner Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) Hüllproteine, die Neusortierungseigenschaften der HAs und NAs, Rezeptoren, Tropismen, neutralisierende Antikörper, Diagnose, Infektiosität, für die Zwecke der Arzneimittelentwicklung und Impfstoffentwicklung. Hier beschreiben wir ein experimentelles Verfahren zur Ermittlung von pps mit den Hüllproteinen (HA, NA) aus zwei Influenza-A-Stämmen (HAPI H5N1 und 2013 avian H7N9). Ihre Erzeugung basiert auf der Fähigkeit einiger Viren, wie dem murinen Leukämievirus (MLV), Hüllglykoproteine in ein pp zu integrieren. Darüber hinaus beschreiben wir auch, wie diese pps mit RT-qPCR quantifiziert werden, und die Infektiositätserkennung von nativen und nicht übereinstimmenden Virus-Pps, abhängig vom Ursprung der HAs und NAs. Dieses System ist hochflexibel und anpassungsfähig und kann verwendet werden, um virale pps mit Hüll-Glykoproteinen herzustellen, die in jede andere Art von umhüllten Viren eingearbeitet werden können. So kann diese virale Partikelplattform verwendet werden, um Wildviren in vielen Forschungsuntersuchungen zu untersuchen.
Einleitung
Die Mission eines viralen Teilchens besteht darin, sein Genom von einer infizierten Wirtszelle in eine nicht infizierte Wirtszelle zu transportieren und in einer replikationskompetenten Form1in das Zytoplasma oder den Zellkern zu liefern. Dieser Prozess wird zunächst durch Bindung an Wirtzellrezeptoren ausgelöst, gefolgt von der Fusion von Virion und Zellmembranen. Für umhüllte Viren, wie Influenzaviren, sind die Spike-Glykoproteine für die Rezeptorbindung und Fusion1,2verantwortlich. Virale Hüllkinkoproteine (z.B. Pyrogene, Antigene) sind an vielen wichtigen Eigenschaften und Ereignissen beteiligt,....
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Protokoll
1. Tag 1: Zellkultur und Seeding
- Kultivieren Sie menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T/17 Zellen in 60 mm Schalen mit Dulbeccos modifiziertem essentiellen Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (DMEM Complete Medium, DCM) in einem 37 °C, 5% Kohlendioxid (CO2) Inkubator bis ca. 80% Confluent.
HINWEIS: HEK 293T/17 Arme-Durchgangszellen werden empfohlen. - Waschen Sie die Zellen sorgfältig mit 5 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) 1x.
HINWEIS: Die manuelle Handhabung der HEK 293T/17-Zellen muss sehr schonend sein, da sie sich leicht lösen. - Entfernen Sie PBS und dissozii....
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Ergebnisse
Abhängig von dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren haben wir 10 Arten von pps erzeugt, die zwei Gruppen-HAs/NAs oder VSV-G-Glykoprotein oder No-Envelope-Glykoproteine kombinieren (siehe Tabelle 1). Sieben von ihnen sind ansteckend. Die pps, die no-envelope Glycoprotein oder nur Hafen NA beherbergen, zeigten hier keine Infektiosität. Das Herstellungsverfahren für Influenza pp ist in Abbildung 1dargestellt. Transmissionselektronenmikroskopie von pps (z.B. H5N1pp) ist in.......
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Diskussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Pseudotyppartikeln (pp) des Influenzavirus in einer BSL-2-Einstellung. Das Reporter-Plasmid pcDNA-GFP ist in die pps integriert und kann verwendet werden, um pps von FACS in einem Infektiositätstest zu quantifizieren. Wir haben uns für zwei Arten von anfälligen Zelllinien entschieden, weil sie in der Grippeforschung weit verbreitet sind. MDCK-Zellen würden eine gute Kontrolle für die variablen verewigten menschlichen Zellen bieten, die in diesen Studien.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Stipendien von Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science and Technologieschlüsselprojekt (Grant Numbers, 2014Z11) und Kommunales autonomes Anwendungsprojekt hangzhou für soziale Entwicklung und wissenschaftliche Forschung (Grant Numbers, 20191203B134).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Benzonase-Nuklease | Millipore | 70664 | Effektive Viskositätsreduzierung und Entfernung von Nukleinsäuren aus Proteinlösungen |
| Durchsichtige Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit flachem Boden (96 Well) | Corning | 3599 | Behandelt für optimale Zelladhäsion Sterilisiert durch Gammastrahlung und zertifiziert pyrogen Individuelle alphanumerische Codes zur Identifizierung |
| von VertiefungenKlare, TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten (6 Wells) | Costar | 3516 | Individuelle alphanumerische Codes für die Well-Identifizierung Behandelt für eine optimale Zelladhäsion Sterilisiert durch Gammabestrahlung |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | Ein weit verbreitetes Basalmedium zur Unterstützung des Wachstums vieler verschiedener Säugetierzellen |
| Fötales Rinderserum | Excell | FND500 | fötale Rinderseren, die ein hervorragendes Preis-Leistungs-Verhältnis für grundlegende Zellkulturen, Spezialforschung und spezifische Assays bieten |
| Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) | Beckman-Schar-Cytoflex | Humanes | |
| Alveolär-Adenokarzinom A549-Zellen | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Humane embryonale Niere (HEK) HEK-293T/17-Zellen | ATCC | CRL-11268 | Ein vielseitiges Transfektionsreagenz, das nachweislich die unterschiedlichsten adhärenten und suspensionsgebundenen Zelllinien effektiv transfiziert |
| Inverses fluoreszierendes biologisches Mikroskop | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverses Lichtmikroskop | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz | Invitrogen | 11668019 | Schneller, sensitiver und präziser sondenbasierter qPCR-Nachweis und Quantifizierung von Ziel-RNA-Zielen. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Hält bis zu 14.000 RCF RNase-/DNase-freien nichtpyrogenen |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen | stand ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gammasterilisierte |
| Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45 & Mikro; m, PVDF | Millipore | SLHV033RS | ein verbessertes Minimal Essential Medium (MEM), das eine Reduzierung der Supplementierung mit fötalem Rinderserum um mindestens 50% ermöglicht, ohne dass sich die Zellwachstumsrate oder -morphologie ändert. Opti-MEM I medium wird auch für die Verwendung mit kationischen Lipidtransfektionsreagenzien, wie z. B. Lipofectamine Reagenz, empfohlen. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | Die Antibiotika Penicillin und Streptomycin werden aufgrund ihrer wirksamen kombinierten Wirkung gegen grampositive und gramnegative Bakterien eingesetzt, um eine bakterielle Kontamination von Zellkulturen zu verhindern. |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximale RZB beträgt 12.500 xg Temperaturbereich von -80 &de; C bis 120 &Grad; C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP-Zentrifugenröhrchen (15 mL) | Corning | 430791 | eine stabile und hochreaktive Serinprotease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Behandelt für eine optimale Zelladhäsion Sterilisiert durch Gammastrahlung und zertifiziert pyrogenfreie |
| TC-behandelte Kulturschale (60 mm) | Corning | 430166 | Trypsin aus der Rinderpankreas TPCK-behandeltes, im Wesentlichen salzfreies, lyophilisiertes Pulver, ≥ 10.000 BAEE-Einheiten/mg Protein |
| TPCK-Trypsin | Sigma | T1426 | Diese flüssige Formulierung von Trypsin enthält EDTA und Phenolrot. Gibco Trypsin-EDTA wird aus Trypsinpulver hergestellt, einer bestrahlten Mischung von Proteasen, die aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins gewonnen werden. Aufgrund seiner verdauungsfördernden Kraft wird Trypsin häufig für die Zelldissoziation, die routinemäßige Zellkulturpassage und die Dissoziation des primären Gewebes verwendet. Die für die Dissoziation erforderliche Trypsinkonzentration variiert je nach Zelltyp und experimentellen Anforderungen. |
| Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot | Gibco | 25200056 |
Referenzen
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.....
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Nachdrucke und Genehmigungen
