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Methodenartikel

Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren

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DOI:

10.3791/60663

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15. Januar 2020

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1Central Laboratory, Hang Zhou Red Cross Hospital, 2Clinical Laboratory, Yuhang District Maternity and Child Health Care Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Prozess zur Herstellung hochtiter infektiöser viraler pseudotypisierter Partikel (pp) mit Hüllglykoproteinen aus zwei Influenza-A-Stämmen und wie ihre Infektiosität bestimmt werden kann. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig, um pps von jeder anderen Art von umhüllten Viren mit verschiedenen Hüll-Glykoproteinen zu entwickeln.

Zusammenfassung

Die gelegentliche direkte Übertragung des hoch pathogenen Aviären Influenza-A-Virus H5N1 (HPAI H5N1) und H7N9 auf den Menschen und ihre Letalität sind ernste Probleme der öffentlichen Gesundheit und deuten auf die Möglichkeit einer Epidemie hin. Unser molekulares Verständnis des Virus ist jedoch rudimentär, und es ist notwendig, die biologischen Eigenschaften seiner Hüllproteine als therapeutische Ziele zu untersuchen und Strategien zur Bekämpfung von Infektionen zu entwickeln. Wir entwickelten eine solide virale pseudotypisierte Partikel-(pp)-Plattform zur Untersuchung des Aviären Influenzavirus, einschließlich der funktionellen Analyse seiner Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) Hüllproteine, die Neusortierungseigenschaften der HAs und NAs, Rezeptoren, Tropismen, neutralisierende Antikörper, Diagnose, Infektiosität, für die Zwecke der Arzneimittelentwicklung und Impfstoffentwicklung. Hier beschreiben wir ein experimentelles Verfahren zur Ermittlung von pps mit den Hüllproteinen (HA, NA) aus zwei Influenza-A-Stämmen (HAPI H5N1 und 2013 avian H7N9). Ihre Erzeugung basiert auf der Fähigkeit einiger Viren, wie dem murinen Leukämievirus (MLV), Hüllglykoproteine in ein pp zu integrieren. Darüber hinaus beschreiben wir auch, wie diese pps mit RT-qPCR quantifiziert werden, und die Infektiositätserkennung von nativen und nicht übereinstimmenden Virus-Pps, abhängig vom Ursprung der HAs und NAs. Dieses System ist hochflexibel und anpassungsfähig und kann verwendet werden, um virale pps mit Hüll-Glykoproteinen herzustellen, die in jede andere Art von umhüllten Viren eingearbeitet werden können. So kann diese virale Partikelplattform verwendet werden, um Wildviren in vielen Forschungsuntersuchungen zu untersuchen.

Einleitung

Die Mission eines viralen Teilchens besteht darin, sein Genom von einer infizierten Wirtszelle in eine nicht infizierte Wirtszelle zu transportieren und in einer replikationskompetenten Form1in das Zytoplasma oder den Zellkern zu liefern. Dieser Prozess wird zunächst durch Bindung an Wirtzellrezeptoren ausgelöst, gefolgt von der Fusion von Virion und Zellmembranen. Für umhüllte Viren, wie Influenzaviren, sind die Spike-Glykoproteine für die Rezeptorbindung und Fusion1,2verantwortlich. Virale Hüllkinkoproteine (z.B. Pyrogene, Antigene) sind an vielen wichtigen Eigenschaften und Ereignissen beteiligt, wie z. B. Viruslebenszyklusinitiierung (Bindung und Fusion), virale Pathogenese, Immunogenität, Wirtszellapoptose und zellulärer Tropismus, der zelluläre endozytische Weg, sowie die Übertragung und Neusortierung zwischen Denspezies1,3,4,5,6,7. Die Forschung an viralen Hüllproteinen wird uns helfen, viele Aspekte des Virusinfektionsprozesses zu verstehen. Pseudotypisierte Viruspartikel (pp), auch Pseudovirions oder Pseudopartikel bezeichnet, können durch eine Pseudotypisierungstechnik8,9,10erzeugt werden. Diese Technologie wurde verwendet, um pseudotypisierte Partikel vieler Viren zu entwickeln, einschließlich Hepatitis C11,12, Hepatitis B13, vesikuläre Stomatitis Virus (VSV)14,15, und Influenza-Virus16,17,18,19. Diese Technologie basiert auf dem Gag-Pol-Protein von Lentiviren oder anderen Retroviren.

Pseudotypisierte Viruspartikel können mit einem Drei-Plasmid-System gewonnen werden, indem ein virales Hüllprotein-Expressionsplasmid, ein retrovirales Verpackungsplasmid, das das Hüllen-Env-Gen fehlt, und ein separates Reporter-Plasmid in pp-Produzentenzellen kotransfiziert werden. Das Retrovirus wird durch sein Gag-Protein zusammengesetzt, und es knospen aus einer infizierten Zellmembran, die das Virus Hülle Protein1ausdrückt. Daher ist es möglich, mit dem Retrovirus Gag-Protein mit hilfe des Retrovirus Gag-Proteins grippereiche Pnospen auf einer Zellmembran zu erhalten, die Influenza HA und NA exekliniert. In unseren früheren Studien waren HAs/NAs in allen Kombinationen funktional und in der Lage, ihre entsprechenden Funktionen im viralen Lebenszyklus16,17,18,20,21auszuführen. Diese pps werden verwendet, um biologische Influenza-Eigenschaften zu untersuchen, einschließlich Hämagglutination, Neuraminidase-Aktivität, HA-Rezeptor-Bindung Tropismus, und Infektiosität. Da HA und NA wichtige oberflächenfunktionelle Proteine im viralen Lebenszyklus sind, können nicht übereinstimmende HAs und NAs, die aus verschiedenen Grippestämmen abgeleitet sind, teilweise eine Neusortierung zwischen ihnen nachweisen. Hier erzeugen wir acht Arten von Influenza-Pps, indem wir zwei HAs und zwei NAs (abgeleitet vom HPAI H5N1-Stamm und dem H7N9-Fleck) mit einem Drei-Plasmid-Pseudotypisierungssystem kombinieren. Diese acht Arten von pps umfassen zwei native pps, H5N1pp, H7N9pp; zwei nicht übereinstimmende pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; und vier Pps, die nur ein einzelnes Glykoprotein (HA oder NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp beherbergen. Studien zum Influenzavirus, wie H5N1 und H7N9, sind durch Biosicherheitsanforderungen begrenzt. Alle Untersuchungen der Wildinfluenza-Virusstämme sollten in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) durchgeführt werden. Die pseudotypisierte virale Partikeltechnologie kann verwendet werden, um ein künstliches Virion in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) zu verpacken. Daher stellen pps ein sichereres und nützliches Werkzeug dar, um die Influenza-Virusprozesse in Abhängigkeit von seinen beiden wichtigsten Glykoproteinen zu untersuchen: Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA).

Dieses Protokoll beschreibt die Generierung dieser pps mit einer Drei-Plasmid-Kotransfektionsstrategie (im Überblick in Abbildung 1), wie pps zu quantifizieren und Infektiositätsnachweis. Die pp-Produktion umfasst drei Arten von Plasmiden (Abbildung 1). Das Gag-Pol-Gen, das das Retrovirus Gag-Pol-Protein kodiert, wurde aus einem Retrovirus-Verpackungskit geklont und in das pcDNA 3.1-Plasmid eingeführt und mit dem Namen pcDNA-Gag-Pol aufgenommen. Das verbesserte Grüne fluoreszierende Protein (eGFP) Gen, das grünes Fluoreszenzprotein kodiert, wurde aus dem pTRE-EGFP-Vektor geklont, in das pcDNA 3.1-Plasmid eingeführt und als pcDNA-GFP bezeichnet. Beim Klonen wurde über eine Grundierung eine Verpackungssignalsequenz hinzugefügt. Die HA- und NA-Gene wurden in ein pVRC-Plasmid namens pVRC-HA bzw. pVRC-NA geklont. Das letzte Plasmid kodiert das Fusionsprotein und kann durch jedes andere Fusionsprotein von Interesse ersetzt werden. Unsere Pseudotypisierungsplattform umfasst zwei Glykoproteinexpressionsplasmide: pVRC-HA und pVRC-NA. Dies kann die Forschung zur Neusortierung zwischen verschiedenen Virusstämmen in einer BSL-2-Einstellung vereinfachen.

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Protokoll

1. Tag 1: Zellkultur und Seeding

  1. Kultivieren Sie menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T/17 Zellen in 60 mm Schalen mit Dulbeccos modifiziertem essentiellen Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (DMEM Complete Medium, DCM) in einem 37 °C, 5% Kohlendioxid (CO2) Inkubator bis ca. 80% Confluent.
    HINWEIS: HEK 293T/17 Arme-Durchgangszellen werden empfohlen.
  2. Waschen Sie die Zellen sorgfältig mit 5 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) 1x.
    HINWEIS: Die manuelle Handhabung der HEK 293T/17-Zellen muss sehr schonend sein, da sie sich leicht lösen.
  3. Entfernen Sie PBS und dissoziieren Sie die Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin-Ethylendin-Tetraessigsäure (EDTA)-Lösung. Legen Sie die Schale in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für nicht mehr als 5 min, bis die Zellen dissoziiert sind.
  4. Deaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 5 ml DCM hinzufügen. Dispergieren Sie die Zellen in eine einzellige Suspension, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen.
  5. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein vorgechilltes 15 ml Zentrifugenrohr. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 250 x g für 5 min bei 4 °C.
  6. Dekant so viel von dem Überstand wie möglich. Setzen Sie das Zellpellet mit 6 ml DCM-Medium aus und zählen Sie die Zellen. Verdünnen Sie die Zellen auf 1 x 106 Zellen/ml mit DCM-Medium.
  7. Säen Sie die Zellen in eine 6 Brunnenplatte mit 1 ml Zellsuspension pro Brunnen. Klopfen Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Platte über Nacht (14-16 h) in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.

2. Tag 2: Vier-Plasmid-Cotransfektion durch Lipofection vermittelt

  1. Überprüfen Sie die Zellmorphologie und -dichte unter einem invertierten Lichtmikroskop. Idealerweise sollten Zellen bei Transfektion etwa 85 % konfluent sein. Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml serumfreies DMEM-Medium pro Brunnen, und legen Sie die Platte dann wieder in den Inkubator.
    HINWEIS: Die manuelle Handhabung der HEK 293T/17-Zellen muss sehr schonend sein, da sie sich leicht lösen.
  2. Für jeden Zutransfizierten Brunnen kultivierter Zellen 8 l des Transfektionsreageims auf ein Volumen von 150 l mit reduziertem Serummedium (Tube 1) verdünnen. Sanft mischen und 5 min bei Raumtemperatur (RT, ca. 20 °C) inkubieren.
    HINWEIS: Bereiten Sie für jede Transfektionsprobe zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre mit den Nummern 1 und 2 vor.
  3. In Tube 2 verdünnen Sie 2,5 g Plasmid-DNA in 150 l reduziertes Serummedium.
    HINWEIS: In Tube 2 jede Plasmid-DNA, wie in Tabelle 1dargestellt, verdünnen. A plasmid encoding vesicular stomatitis virus (VSV) G glycoprotein (plasmid pLP-VSVG) was used as a positive control, because VSV is able to infect a wide range of cells. Negative Kontrollpartikel ohne Influenza-Hüllkurven-Glykoproteine (env pps) wurden mit pcDNA-Gag-Pol und pcDNA-GFP-Plasmiden erzeugt.
  4. Kombinieren Sie nach einer Inkubation von 5 min die verdünnte DNA mit einem verdünnten Transfektionsreagenz. Mischen Sie sanft und brüten für weitere 15 min bei RT.
  5. Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex in den entsprechenden Brunnen, der die Zellen und das serumfreie Medium enthält. Mischen Sie sanft, indem Sie die Platte hin und her schaukeln.
  6. Nach der Inkubation für 4–6 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator, entfernen Sie das Medium, und ersetzen Sie durch 2 ml DMEM. Inkubieren Sie für weitere 36–48 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
    HINWEIS: Ersetzen Sie dies durch serum- und antikörperfreies DMEM. In diesem Protokoll können zwei HAs und zwei NAs verwendet werden, um acht Arten von pps zu generieren (siehe Tabelle 1).

3. Tag 3: Anfällige Zellen Seeding

  1. Für den Infektiositätstest säen Sie jede Art von anfälligen Zellen bei 1 x 104 Zellen pro Brunnen in einer 96-Well-Platte.
    HINWEIS: Verwenden Sie zwei Arten von Zielzellen, um den Infektiositätstest in diesem Artikel durchzuführen: eine alveolarabgeleitete menschliche Zelllinie (A549-Zellen) und die Madin-Darby-Canine Kidney(MDCK)-Zellen. MDCK-Zellen sind weit verbreitet in der Grippeforschung und können eine gute Kontrolle sein. Dieser Schritt ist flexibel. Alle anderen Zielzelllinien können je nach Forschungsbedarf verwendet werden.
  2. Inkubieren Sie die Platte über Nacht (14-16 h) in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.

4. Tag 4: Pseudotypisierte Virale Partikelsammlung, Quantifizierung und Infektiositätstest

  1. Pseudotypisierte virale Partikelsammlung
    1. Überprüfen Sie die Farbe des Mediums. Idealerweise sollte es hellrosa oder leicht orange sein. Untersuchen Sie die Zellen mit einem invertierten fluoreszierenden biologischen Mikroskop unter 440–460 nm.
    2. Bei 36–48 h Nachtransfektion ernten Sie die pps, indem Sie einen 0,45 m Polyvinylidenfluorid -Membranfilter (PVDF) passieren, um Zellablagerungen zu beseitigen.
    3. Teilen Sie die pps in kleine Volumen-Aliquots auf.
    4. Bewahren Sie die pps bei -80 °C auf.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Dies wird jedoch nicht gefördert, da die Infektiosität der pps nach dem Einfrieren und Auftauen stark abnehmen wird.
  2. Pseudotypisierte virale Partikelquantifizierung
    1. 20 l gereinigte pps auf ein 1,5 ml Ribonuklease (RNase)-freies Mikrozentrifugenrohr übertragen.
    2. Fügen Sie 1 l von 0,24 U/ml Benzonase-Nuklease hinzu. Bei 37 °C für 1 h inkubieren, um jegliche DNA- und RNA-Kontamination zu beseitigen.
      HINWEIS: Ziel-RNA, häufig downreguliertes Cytomegalievirus (CMV)-GFP-RNA, ist in den pps verpackt und kann vermeiden, durch Benzonase-Nuklease abgebaut zu werden.
    3. Die Probe bei -70 °C einfrieren, um die Benzonase-Nuklease zu inaktivieren.
    4. Fügen Sie 2 L Proteinase K. Inkubieren bei 50 °C für 30 min, um die Hüllhautproteine zu verdauen und die CMV-GFP-RNA freizusetzen. Die Proteinase K bei 100 °C für 3 min inaktivieren.
    5. Quantifizieren Sie die pps durch quantitative Reverse-Transkription (qRT)-PCR in Echtzeit mit einem Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit, mit dem Vorwärtsprimer 5'-AACAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', dem Reverse Primer 5'-GGGTCTCTTCAGAGTGATTGGATTGACTAC-3', und der Sonde 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', auf einem Echtzeit-PCR-Thermocycler. Normalisieren Sie die pps für RNA-Kopiernummer vor der Infektiosität.
  3. Infektiitätstest
    1. Verdünnen Sie jede Pps-Art in Bezug auf die qRT-PCR-Daten auf 4 x 105 Kopien/ml (pp Normalisierung).
    2. Fügen Sie Tosyl-Phenylalanin Chloromethyl-Keton (TPCK)-Trypsin zu einer Endkonzentration von 40 g/ml in pps hinzu, die H7N9 HA enthalten. Bei 37 °C für 1 h inkubieren, um seine funktionalen Untereinheiten HA1 und HA2 zu bilden.
      HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die pps, die H5 beherbergen, mit TPCK-Trypsin zu behandeln, da sie mehrere Arginin- und Lysinrückstände an der HA1-HA2-Spaltungsstelle haben. Diese multi-basic Spaltung Sekolleté-Site kann durch allgegenwärtige zelluläre Proteasen zerklaut taufen.
    3. Mischen Sie normalisierte pps mit DMEM medium (serumfrei) im Verhältnis 1:1 (Volumen/Volumen).
    4. Bringen Sie die Platte mit anfälligen Zellen in den Biosicherheitsschrank.
    5. Den Überstand ansaugen und die Zellen einmal mit 0,1 ml vorgewärmtem PBS waschen.
    6. 0,1 ml pps-DMEM-Mischung zu einem Brunnen geben. Dreifache Infektiitätstests jeder Pps-Typs auf eine anfällige Zelllinie (überblickt in Abbildung 2).
    7. Inkubieren Sie die 96-Wellplatte für 4–6 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
    8. Aspirieren Sie den Überstand und ersetzen Sie mit 0,1 ml DCM.
    9. Inkubieren Sie die 96-Wellplatte für weitere 24–36 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.

5. Tag 5 oder 6: Infektiositätserkennung

  1. Bringen Sie die 96 Well Platte in den Biosicherheitsschrank.
  2. Den Überstand ansaugen und die Zellen 1x mit 0,2 ml vorgewärmten PBS waschen.
  3. Entfernen Sie PBS und dissoziieren Sie die Zellen mit 0,1 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung.
  4. Legen Sie die Schale in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 3 min, bis die Zellen getrennt sind.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine Inkubation für mehr als 5 min, da dies zu Zellverklumpungen führt.
  5. Deaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 0,4 ml DCM hinzufügen.
  6. Dispergieren Sie die Zellen in einzellige Suspension, indem Sie mehrmals nach oben und unten pipetieren.
  7. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein gekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
  8. Bestimmen Sie die GFP-Reporter-positiven Zellen mit Fluoreszenz Activated Cell Sorting (FACS).
    ANMERKUNG: Um das Verhältnis der GFP-Reporter-positiven Zielzellen zu bestimmen, legen Sie die Durchflusszytometer-Gatter mithilfe der Kontrollproben (pps-unbehandelte A549-Zellen oder MDCK-Zellen) fest, und zählen Sie dann die GFP-Reporter-positiven Zellen von 10.000 Zellen pro Probe.

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Ergebnisse

Abhängig von dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren haben wir 10 Arten von pps erzeugt, die zwei Gruppen-HAs/NAs oder VSV-G-Glykoprotein oder No-Envelope-Glykoproteine kombinieren (siehe Tabelle 1). Sieben von ihnen sind ansteckend. Die pps, die no-envelope Glycoprotein oder nur Hafen NA beherbergen, zeigten hier keine Infektiosität. Das Herstellungsverfahren für Influenza pp ist in Abbildung 1dargestellt. Transmissionselektronenmikroskopie von pps (z.B. H5N1pp) ist in...

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Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Pseudotyppartikeln (pp) des Influenzavirus in einer BSL-2-Einstellung. Das Reporter-Plasmid pcDNA-GFP ist in die pps integriert und kann verwendet werden, um pps von FACS in einem Infektiositätstest zu quantifizieren. Wir haben uns für zwei Arten von anfälligen Zelllinien entschieden, weil sie in der Grippeforschung weit verbreitet sind. MDCK-Zellen würden eine gute Kontrolle für die variablen verewigten menschlichen Zellen bieten, die in diesen Studien...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Stipendien von Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science and Technologieschlüsselprojekt (Grant Numbers, 2014Z11) und Kommunales autonomes Anwendungsprojekt hangzhou für soziale Entwicklung und wissenschaftliche Forschung (Grant Numbers, 20191203B134).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Benzonase-NukleaseMillipore70664Effektive Viskositätsreduzierung und Entfernung von Nukleinsäuren aus Proteinlösungen
Durchsichtige Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit flachem Boden (96 Well)Corning3599Behandelt für optimale Zelladhäsion
Sterilisiert durch Gammastrahlung und zertifiziert pyrogen
Individuelle alphanumerische Codes zur Identifizierung
von VertiefungenKlare, TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten (6 Wells)Costar3516Individuelle alphanumerische Codes für die Well-Identifizierung
Behandelt für eine optimale Zelladhäsion
Sterilisiert durch Gammabestrahlung
Dulbecco's modified essential medium (DMEM)Gibco11965092Ein weit verbreitetes Basalmedium zur Unterstützung des Wachstums vieler verschiedener Säugetierzellen
Fötales RinderserumExcellFND500fötale Rinderseren, die ein hervorragendes Preis-Leistungs-Verhältnis für grundlegende Zellkulturen, Spezialforschung und spezifische Assays bieten
Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)Beckman-Schar-CytoflexHumanes
Alveolär-Adenokarzinom A549-ZellenATCCCRM-CCL-185
Humane embryonale Niere (HEK) HEK-293T/17-ZellenATCCCRL-11268Ein vielseitiges Transfektionsreagenz, das nachweislich die unterschiedlichsten adhärenten und suspensionsgebundenen Zelllinien effektiv transfiziert
Inverses fluoreszierendes biologisches MikroskopOlympusBX51-32P01-FLB3
Inverses LichtmikroskopOlympusCKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzInvitrogen11668019Schneller, sensitiver und präziser sondenbasierter qPCR-Nachweis und Quantifizierung von Ziel-RNA-Zielen.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR KitNEBE3006LHält bis zu 14.000 RCF
RNase-/DNase-freien nichtpyrogenen
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellenstand ATCCCCL-34
MaxyClear Snaplock Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)AxygenMCT-150-C33 mm, gammasterilisierte
Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45 & Mikro; m, PVDFMilliporeSLHV033RSein verbessertes Minimal Essential Medium (MEM), das eine Reduzierung der Supplementierung mit fötalem Rinderserum um mindestens 50% ermöglicht, ohne dass sich die Zellwachstumsrate oder -morphologie ändert. Opti-MEM I medium wird auch für die Verwendung mit kationischen Lipidtransfektionsreagenzien, wie z. B. Lipofectamine Reagenz, empfohlen.
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco11058021Die Antibiotika Penicillin und Streptomycin werden aufgrund ihrer wirksamen kombinierten Wirkung gegen grampositive und gramnegative Bakterien eingesetzt, um eine bakterielle Kontamination von Zellkulturen zu verhindern.
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Maximale RZB beträgt 12.500 xg
Temperaturbereich von -80 &de; C bis 120 &Grad; C
RNase-/DNase-free
Sterile
PP-Zentrifugenröhrchen (15 mL)Corning430791eine stabile und hochreaktive Serinprotease
Proteinase KBeyotimeST532Behandelt für eine optimale Zelladhäsion
Sterilisiert durch Gammastrahlung und zertifiziert pyrogenfreie
TC-behandelte Kulturschale (60 mm)Corning430166Trypsin aus der Rinderpankreas
TPCK-behandeltes, im Wesentlichen salzfreies, lyophilisiertes Pulver, ≥ 10.000 BAEE-Einheiten/mg Protein
TPCK-TrypsinSigmaT1426Diese flüssige Formulierung von Trypsin enthält EDTA und Phenolrot. Gibco Trypsin-EDTA wird aus Trypsinpulver hergestellt, einer bestrahlten Mischung von Proteasen, die aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins gewonnen werden. Aufgrund seiner verdauungsfördernden Kraft wird Trypsin häufig für die Zelldissoziation, die routinemäßige Zellkulturpassage und die Dissoziation des primären Gewebes verwendet. Die für die Dissoziation erforderliche Trypsinkonzentration variiert je nach Zelltyp und experimentellen Anforderungen.
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotGibco25200056
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Referenzen

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501(2008).
  4. Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629(2014).
  5. Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
  6. Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
  7. Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
  8. Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
  9. Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
  10. Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
  11. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  12. Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
  13. Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
  14. Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
  15. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  16. Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
  17. Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).
  18. Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825(2010).
  19. Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
  20. Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
  21. Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
  22. McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
  23. Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
  24. Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70(2006).
  25. Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
  26. Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
  27. Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
  28. Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
  29. Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
  30. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254(2016).
  31. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  32. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  33. Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).
  34. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  35. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  36. Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
  37. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  38. Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).
  39. Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).

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