Method Article

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impeddance-Based GPCR Assays

DOI:

10.3791/60686

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February 21st, 2020

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1Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, 2Institute of Pharmacy, University of Regensburg, 3Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuernberg, 4Fraunhofer Research Institution for Microsystems and Solid State Technologies EMFT

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll zeigt die Echtzeitaufzeichnung von volldosierten Reaktionsbeziehungen für die agonistisch-induzierte GPCR-Aktivierung von einer einzelnen Zellschicht, die auf einer einzelnen Mikroelektrode mit etikettenfreien Impedanzmessungen angebaut wird. Das neue Dosierschema erhöht den Durchsatz deutlich, ohne dass die Zeitauflösung verloren geht.

Abstract

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Etikettenfreie Impedanz-basierte Assays werden zunehmend zur nicht-invasiven Untersuchung der ligaandinduzierten GPCR-Aktivierung in Zellkulturexperimenten eingesetzt. Der Ansatz bietet Echtzeit-Zellüberwachung mit einer geräteabhängigen Zeitauflösung bis zu mehreren Dutzend Millisekunden und ist hochautomatisiert. Wenn jedoch die Probenzahlen hoch werden (z. B. Dosis-Wirkungs-Studien für verschiedene Liganden), können die Kosten für die Einweg-Elektroden-Arrays sowie die verfügbare Zeitauflösung für sequenzielle Well-by-Well-Aufnahmen begrenzt werden. Daher stellen wir hier ein serielles Agonisten-Zusatzprotokoll vor, das das Potenzial hat, die Leistung von etikettenfreien GPCR-Assays deutlich zu erhöhen. Mit Hilfe des seriellen Agonisten-Additionsprotokolls wird ein GPCR-Agonist sequenziell bei der Erhöhung der Konzentrationen zu einer einzelnen Zellschicht hinzugefügt, während die Impedanz der Probe kontinuierlich überwacht wird (Agonistenmodus). Mit diesem seriellen Ansatz ist es nun möglich, eine vollständige Dosis-Wirkungs-Kurve für einen GPCR-Agonisten aus nur einer einzigen Zellschicht zu etablieren. Das serielle Agonisten-Zusatzprotokoll ist auf verschiedene GPCR-Kopplungstypen, Gq Gi/0 oder Gs, anwendbar und mit rekombinanten und endogene Expressionsniveaus des untersuchten Rezeptors kompatibel. Die Rezeptorblockierung durch GPCR-Antagonisten ist ebenfalls bewertbar (Antagonistenmodus).

Introduction

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Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung eines seriellen Additionsprotokolls, das zur Quantifizierung der Liganden-induzierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoraktivierung (GPCR) in anhaftend angebauten Zellen durch etikettenfreie Impedanzmessungen entwickelt wurde. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind an einer Vielzahl physiologischer Funktionen und menschlicher Krankheiten beteiligt1. Aufgrund dieser und ihrer guten Zugänglichkeit an der Zelloberfläche sind GPCRs eines der wichtigsten Wirkstoffziele. Diese Bewertung spiegelt sich in einer geschätzten Zahl von 700 zugelassenen Arzneimitteln wider, die auf DIE GPCR abzielen, w....

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Protocol

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1. Zellaussaat auf Elektroden-Arrays

HINWEIS: Die Auswahl des Elektrodenlayouts ist ein Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und Anzahl der untersuchten Zellen. Je kleiner die Elektrode, desto empfindlicher ist die Messung, aber je kleiner die Anzahl der untersuchten Zellen ist. Bei Zellen, die unter Basisbedingungen starke Impedanzschwankungen im Zeitverlauf aufweisen, sind größere oder interdigitierte Elektroden vorzuziehen.

  1. Vorwärmung aller Lösungen für Standard-Zellpassaging und -saatierung in einem 37 °C-Wasserbad. Für Assays mit menschlichen U-373 MG-Zellen braucht es: Phosphat gepufferte Saline (PBS) ohne Calcium und Magnesi....

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Results

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Ein typisches Schema zur Vorbereitung der verschiedenen agonistischen Lösungen wird für ein Experiment mit 8-Well-Elektroden-Arrays mit Histamin als Agonist in den Tabellen 1-4gezeigt. Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen Volumen und Konzentrationen für ein Experiment mit Additionsmodus 1 (vgl. Abbildung 1), während Tabelle 3 und Tabelle 4 Volumen und Konzentrationen für ein Experiment nach

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Discussion

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Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für etikettenfreie Impedanzmessungen, um die Dosis-Wirkungs-Beziehung der agonistisch-induzierten GPCR-Aktivierung in Abwesenheit oder das Vorhandensein spezifischer Antagonisten für denselben Rezeptor zu bestimmen. Der Konzeptbeweis dieser Methode wurde kürzlich in einer Veröffentlichungvorgestellt 12. Unserer Kenntnis nach ist es die erste Studie, die die Etablierung einer vollständigen Dosis-Wirkungs-Kurve der agonistisch vermittelten GPCR-Aktivierung m.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Wir danken Barbara Goricnick und Nadja Hinterreiter für ihre Hilfe bei der Zellkultivierung und der Vorbereitung experimenteller Lösungen. Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch das von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderte Graduiertenkolleg 1910 "Medizinische Chemie selektiver GPCR-Liganden" unter der Fördernummer 222125149. Besonders dankbar ist JAS für ein Stipendium des Bayerischen Gleichstellungsprogramms.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bü Die ZählkammerMarienfeld (Lauda-Kö nigshofen, Deutschland)640210
Zellkulturflaschen 25 cm2Greiner bio-one (Frickenhausen, Deutschland)690175
Zellinkubator (Heraeus Function Line BB15)Thermo Scientific (Darmstadt, Deutschland)\
Zentrifuge (Heraeus 1S-R)Thermo Scientific (Darmstadt, Deutschland)\
DiphenhydraminhydrochloridSigma Aldrich (Taufkirchen, Deutschland)D3630
Eagle's Minimum Essential Medium mit 4,5 g/L D-Glucose und 2,2 g/L NaHCO3Sigma Aldrich (Taufkirchen, Deutschland)D5671
Impedanzmessgerät (ECIS Zθ)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)\
8-Well-Elektrodenarrays (8W1E PET)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)\PET-Basis mit 0,049 mm2 Arbeitselektrode und ~50 mm2 Gegenelektrode (Gold)
96-Well-Elektrodenarrays (96W1E+ PET)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)\PET-Basis mit zwei Elektroden (gold) mit 0,256 mm2 Gesamtelektrodenfläche
Fötales Kälberserum (FCS)Biochrom (Berlin, Deutschland)S0615
HistamindihydrochloridCarl Roth (Karlsruhe, Deutschland)4017.1
Laminar-Flow-Haube (Herasafe, KS 12)Thermo Scientific (Darmstadt, Deutschland)51022515Sicherheitswerkbank Klasse II
Leibovitz' L-15 mediumThermo Scientific (Darmstadt, Deutschland)21083-027
L-GlutaminSigma Aldrich (Taufkirchen, Deutschland)G7513
Mikropipette groß (100 - 1000 &; Mikro; L)Brandt (Wertheim, Deutschland)704780
Mikropipette groß (20 - 200 & Mikro; L)Brandt (Wertheim, Deutschland)704778
Mikroskop (Phasenkontrast, Nikon Diaphot)Nikon (Dü Düsseldorf, Deutschland)
Penicillin/StreptomycinSigma Aldrich (Taufkirchen, Deutschland)P0781
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma Aldrich (Taufkirchen, Deutschland)D8537
Pipette, serologischeGreiner bio-one (Frickenhausen, Deutschland)607 180
Pipette (accu-jet pro)Brandt (Wertheim, Deutschland)26300
TrypsinSigma Aldrich (Taufkirchen, Deutschland)T4174in PBS mit 1 mM EDTA-Röhrchen
, 15 mLGreiner bio-on (Frickenhausen, Deutschland)188 271
Röhrchen, 50 mLGreiner bio-on (Frickenhausen, Deutschland)210 261
U-373 MG ZellenATCC (Rockville, MD, USA)ATCC HTB-17
Wasserbad (TW21)Julabo (Seelbach, Deutschland)\

References

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  1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
  2. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.<....

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Label Free Impedance AssaysGPCR AssaysSerial Agonist AdditionDose Response CurveImpedance MonitoringHistamine ConcentrationFour Parameter Logistic ModelReceptor BlockingGPCR AntagonistsCell Seeding

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