Analyse des Sauerstoffverbrauchs der nichtmenschlichen Primaten-Pankreas-Islet

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die genaue und reproduzierbare Messung des Sauerstoffverbrauchs in nichtmenschlichen Pankreasinseln. Die Beladetechniken der Isleten und die Beschichtung der Mikroplatte bieten einen Rahmen für eine effiziente Messung der Atmung in anderen Arten von kultivierten Sphäroiden.

Zusammenfassung

Die Messung des Sauerstoffverbrauchs in Sphäroid-Clustern von Zellen, wie ex vivo Pankreasinseln, war historisch eine Herausforderung. Wir demonstrieren die Messung des Sauerstoffverbrauchs der Islet enmitieren mit einer 96-Well-Mikroplatte, die für die Messung des Sauerstoffverbrauchs in Sphäroiden entwickelt wurde. In diesem Test werden Sphäroid-Mikroplatten am Tag vor dem Test mit einem Zell- und Gewebekleber beschichtet. Wir verwenden ein kleines Volumen an Klebstofflösung, um die Befolgung der Leten nur an der Unterseite des Brunnens zu fördern. Am Tag des Assays werden 15 Inselchen mit einer Technik, die eine optimale Positionierung der Inselchen und eine genaue Messung des Sauerstoffverbrauchs gewährleistet, direkt in die Basis jedes Brunnens geladen. Verschiedene Aspekte der mitochondrialen Atmung werden pharmakologisch in nichtmenschlichen Primateninseln untersucht, einschließlich ATP-abhängiger Atmung, maximaler Atmung und Protonenleck. Diese Methode ermöglicht konsistente, reproduzierbare Ergebnisse mit nur einer kleinen Anzahl von Inselchen pro Bohrplatz. Es kann theoretisch auf alle kultivierten Sphäroide ähnlicher Größe angewendet werden.

Einleitung

Um den normalen Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten, muss die Pankreas-Zelle Erhöhungen in Glukose spüren und Insulin entsprechend absondern. Die Kopplung der Insulinsekretion mit dem Glukosespiegel ist direkt mit dem Glukosestoffwechsel und der Produktion von ATP durch mitochondriale oxidative Phosphorylierung verbunden. Daher spielen Mitochondrien eine entscheidende Rolle bei der Stimulus-Sekretionskopplung¹. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion der Zelle kann Defekte aufdecken, die zu einer beeinträchtigten Insulinsekretion führen. Die Sekretion von Glucagon durch Pankreaszellen ist ebenfalls eng mit der mitochondrialen Funktion

Protokoll

1. Vorbereitung von Mikroplatte und Sensorpatrone am Tag vor dem Ausführen des Assays

Inselchen wurden von dreijährigen japanischen Makaken isoliert, wie zuvor beschrieben¹³. Diese Methode ist sehr ähnlich der, die verwendet wird, um menschliche Inselchen von Kadaverspendern zu isolieren, unterscheidet sich aber von Mäusen, bei denen Pankreata oft mit Kollagenaselösung aufgeblasen werden, während das Tier unter Sedierung und vor der Organentfernung steht. Der Islet Retrieval wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Oregon National Primate Research Center (....

Ergebnisse

Um Inselchen in Mikroplatten zu laden, sollten 15 Inselchen in 15 l Medien angesaugt werden, wie in Abbildung 1Adargestellt. Inselchen werden sich natürlich innerhalb weniger Sekunden zur Unterseite der Pipettenspitze absetzen. Dann wird die Pipettenspitze auf den Boden des Brunnens abgesenkt. Die Spitze ist sehr leicht angehoben, und ein kleines Volumen (ca. 5 l) wird zusammen mit den Inselchen herausgepfetet. Diese Technik führt zu einer ko.......

Diskussion

Die Untersuchung des Sauerstoffverbrauchs der Insel wurde bisher durch die kugelförmige Form von Inselchen, deren mangelnde Haftung an Kulturoberflächen und die Anzahl der pro Brunnen benötigten Inselchen behindert. In diesem Protokoll unterstreichen wir die Wirksamkeit der 96-Well-Sphäroid-Mikroplatte zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von Inselchen auf einer kleinen Anzahl von Inselchen und zeigen eine Technisch machbare und konsistente Technik zum Um- und Laden von Inselchen Ergebnisse.

D.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkulturschale, 60 mm x 15 mm Ausführung	Corning	430166
Cell-Tak Zell- und Gewebekleber	Corning	354240
Konisches Röhrchen, 50 mL	Falcon	352070
wasserfreie Dextrose	Fisher Scientific	BP350-1	Für Glukoselösung, 200 mg/ml, steril fileteriert
Einweg-Reservoire (steril), 25 ML	Vistalab	3054-1033	zum Beladen von Mehrkanalpipetten
EZFlow Sterile 0,45 μ m PES Spritzenvorsatzfilter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-Glutamin	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Mehrkanal-Pipettenspitzen	ThermoFisher Scientific	94410810
Mehrkanalpipette, 15-1250 μ L	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Empfohlene
P20-, P200- und P1000-Pipetten	Eppendorf	2231000602
pH-Sonde	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipettenspitzen, 20 & mu; L, 200 μ L, 1000 μ L	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Enthält Oligomycin, FCCP und Rotenon/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Inklusive Vorbereitungsstation mit 37 > C Nicht-CO2-Inkubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Enthält Sensorpatrone, Sphäroid-Mikrotiterplatte und Kalibrant
Natriumbicarbonat	Fisher Scientific	BP328-500
Natriumpyruvat	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereomikroskop	Olympus	SZX9
Spritze (steril), 5 mL	BD	309603	Für die Sterilfiltration
Wasser (steril)	Sigma	W3500-500mL