Methodenartikel

TurboID-basierte Näherungskennzeichnung für in Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

DOI:

10.3791/60728

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17. Mai 2020

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1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Beschrieben wird hier eine Näherungskennzeichnungsmethode zur Identifizierung von Interaktionspartnern der TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in Nicotiana benthamiana Blattgewebe. Ebenfalls zur Verfügung gestellt ist ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen von Interesse mit dieser Technik bei Nicotiana und anderen Pflanzenarten.

Zusammenfassung

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Näherungskennzeichnungstechniken (PL) mit hilfe von Ascorbatperoxidase (APEX) oder Escherichia coli biotin ligase BirA (bekannt als BioID) wurden erfolgreich zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) in Säugetierzellen eingesetzt. Der Bedarf an toxischem Wasserstoffperoxid (H2O2) in APEX-basierter PL, längere Inkubationszeit mit Biotin (16–24 h) und eine höhere Inkubationstemperatur (37 °C) in BioID-basierter PL schränken ihre Anwendungen in Pflanzen jedoch stark ein. Das kürzlich beschriebene TurboID-basierte PL behebt viele Einschränkungen von BioID und APEX. TurboID ermöglicht eine schnelle Näherungskennzeichnung von Proteinen in nur 10 min unter Raumtemperatur (RT). Obwohl der Nutzen von TurboID in Tiermodellen nachgewiesen wurde, haben wir kürzlich gezeigt, dass TurboID-basiertes PL in Pflanzen besser abschneidet als BioID bei der Kennzeichnung von Proteinen, die proximal für ein Protein von Interesse sind. Hier ist ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Identifizierung von Protein-Interaktionspartnern unter Verwendung der N-terminalen Toll/Interleukin-1-Rezeptor-Domäne (TIR) der Nukleotid-bindenden Leucin-rich repeat (NLR)-Proteinfamilie als Modell vorgesehen. Die Methode beschreibt die Vektorkonstruktion, die Agroinfiltration von Proteinexpressionskonstrukten, Biotinbehandlung, Proteinextraktion und -entsalzung, Quantifizierung und Anreicherung der biotinylierten Proteine durch Affinitätsreinigung. Das hier beschriebene Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere Proteine von Interesse in Nicotiana und anderen Pflanzenarten zu untersuchen.

Einleitung

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PPI sind die Grundlage verschiedener zellulärer Prozesse. Zu den traditionellen Methoden zur Identifizierung von PPI gehören Hefe-Zwei-Hybrid-Screening (Y2H) und Immunpräzipitation in Verbindung mit Massenspektrometrie (IP-MS)1. Beide haben jedoch einige Nachteile. Beispielsweise erfordert das Y2H-Screening die Verfügbarkeit einer Y2H-Bibliothek der Zielpflanze oder Tierart. Der Bau dieser Bibliotheken ist arbeitsintensiv und teuer. Darüber hinaus wird der Y2H-Ansatz in der heterologen einzelligen eukaryotischen Organismushefe durchgeführt, die möglicherweise nicht den zellulären Status höherer eukaryotischer Zellen darstellt.

Im Gegensatz dazu zeigt IP-MS eine geringe Effizienz bei der Erfassung vorübergehender oder schwacher PPI, und es ist auch ungeeignet für Proteine mit geringer Häufigkeit oder hoher Hydrophobie. Viele wichtige Proteine, die an den Signalwegen der Pflanze beteiligt sind, wie z. B. Rezeptor-ähnliche Kiinasen (RLKs) oder die NLR-Familie von Immunrezeptoren, werden auf niedrigem Niveau exprimiert und interagieren oft vorübergehend mit anderen Proteinen. Daher schränkt es das Verständnis der Mechanismen, die der Regulierung dieser Proteine zugrunde liegen, stark ein.

Kürzlich wurden näher markierte (PL) Methoden auf Basis von Ascorbatperoxidase (APEX) und einer mutierten Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (bekannt als BioID) für die Untersuchung von PPI2,3,4entwickelt und genutzt. Das Prinzip von PL ist, dass ein Zielprotein von Interesse mit einem Enzym verschmolzen wird, das die Bildung von labilem Biotinyl-AMP (Bio-AMP) katalysiert. Diese kostenlosen Bio-AMP werden von PL-Enzymen freigesetzt und diffundieren in die Nähe des Zielproteins, wodurch die Biotinylierung von proximalen Proteinen an den primären Aminen in einem geschätzten Radius von 10 nm5ermöglicht wird.

Dieser Ansatz hat erhebliche Vorteile gegenüber den herkömmlichen Y2H- und IP-MS-Ansätzen, wie z. B. der Fähigkeit, transiente oder schwache PPI zu erfassen. Darüber hinaus ermöglicht PL die Kennzeichnung von proximalen Proteinen des Zielproteins in ihrer nativen zellulären Umgebung. Verschiedene PL-Enzyme haben einzigartige Nachteile, wenn sie auf verschiedene Systeme angewendet werden. Obwohl APEX beispielsweise eine höhere Tagging-Kinetik im Vergleich zu BioID bietet und erfolgreich in Säugetiersystemen angewendet wird, macht die Anforderung an giftiges Wasserstoffperoxid (H2O2) in diesem Ansatz es für PL-Studien an Pflanzen ungeeignet.

Im Gegensatz dazu vermeidet BioID-basierte S-basierte S-basierte S-basierte Verwendung der toxischenH2O2, aber die Rate der Etikettierung ist langsam (erfordert 18–24 h, um die Biotinylierung abzuschließen), wodurch die Erfassung vorübergehender PPI weniger effizient ist. Darüber hinaus führt die höhere Inkubationstemperatur (37 °C), die für eine effiziente PL durch BioID erforderlich ist, zu äußerer Belastung für einige Organismen, wie Pflanzen4. Daher wurde berichtet, dassderbegrenzte Einsatz von BioID-basierter PL in Pflanzen (d. h. Reisprotoplasten, Arabidopsis und N. benthamiana) 6,7,8,9gemeldet wurde. Das kürzlich beschriebene TurboID-Enzym bewältigt die Mängel von APEX und BioID-basierter PL. TurboID zeigte eine hohe Aktivität, die die Ausführung von PL innerhalb von 10 min bei RT10ermöglicht. TurboID-basierte sePL wurde erfolgreich in Säugetierzellen, Fliegen und Würmern10eingesetzt. Kürzlich haben wir und andere Forschungsgruppen den Einsatz von TurboID-basiertem PL für die Untersuchung von PPI in verschiedenen Pflanzensystemen, einschließlich N. benthamiana und Arabidopsis Pflanzen und Tomatenhaarwurzeln11,12,13,14, optimiert und erweitert. Vergleichende Analysen ergaben, dass TurboID bei PL in Anlagen besser abschneidet als BioID11,14. Es hat auch die Robustheit der TurboID-basierten PL in Planta gezeigt, indem eine Reihe von neuartigen Wechselwirkungen mit einem NLR-Immunrezeptor11identifiziert wurde, einem Protein, dessen Interaktionspartner in der Regel mit traditionellen Methoden schwer zu erhalten sind.

Dieses Protokoll veranschaulicht die TurboID-basierte PL in planta, indem es die Identifizierung von Interaktionsproteinen der N-terminalen TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in N. benthamiana-Pflanzen beschreibt. Die Methode kann auf alle Proteine von Interesse in N. benthamianaerweitert werden. Noch wichtiger ist, es bietet eine wichtige Referenz für die Untersuchung von PPI in anderen Pflanzenarten wie Arabidopsis,Tomaten, und andere.

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Protokoll

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ANMERKUNG: Eine Übersicht über die Methode ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Pflanzenmaterialaufbereitung

  1. N. Benthamiana-Samen in nassen Böden mit hoher Dichte anbauen und in einer Klimakammer mit einem 16 h-Licht (ca. 75 x2s) und 8 h dunkler Photoperiode bei 23–25 °C halten.
  2. Etwa 1 Woche später jeden jungen Sämling vorsichtig in 4' x 4' Töpfe geben und die Sämlinge in derselben Kammer aufbewahren.
  3. Pflegen Sie die Pflanzen in der Kammer für etwa 4 Wochen, bis sie auf ein Blattstadium von 4-8 für die nachfolgende Agroinfiltration15wachsen.

2. Bau von TurboID-Fusionen

  1. Verwenden Sie die standardmäßige molekulare Klontechnik, um eine Fusion des Zielproteins mit TurboID (PCR TurboID von Addgene plasmid #107177) zu erzeugen. Hier verwendeten wir die N-terminale TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors als Zielprotein von Interesse und konstruierten TIR mit TurboID unter der Kontrolle des Cauliflower-Mosaikvirus 35S-Promotors (p35S::TIR-TurboID).
    HINWEIS: Die Fusion des TurboID-Enzyms zum Carboxylterminus oder Aminoterminus des Zielproteins hängt vom Protein ab. Normalerweise sollten für ein zytoplasmatisches Protein beide Termini akzeptabel sein, solange die TurboID-Fusion die Funktion des Zielproteins nicht beeinträchtigt. Bei einem membranlokalisierten Protein sollte die Proteintopologie jedoch im Voraus charakterisiert werden, bevor bestimmt wird, welcher Terminus für die TurboID-Fusion am besten ist.
  2. Konstruieren Sie ein TurboID-gebundenes Citrin unter demselben Promotor, um als Kontrolle für die nachfolgende quantitative proteomische Analyse zu dienen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine TurboID-Steuerung zu erstellen, um das Proteom proximal für das Zielprotein zu identifizieren. Die TurboID-Fusionssteuerung sollte einen Expressionsgrad aufweisen, der dem des TurboID-gebundenen Zielproteins ähnelt. Dies kann empirisch durch Anpassung der Agrobacterium-Konzentration während der Agroinfiltration bestimmt werden. Darüber hinaus ist es wichtig, dass das Kontrollprotein ein subzelluläres Lokalisationsmuster aufweist, das dem des Zielproteins von Interesse ähnelt.

3. Agroinfiltration

  1. Umwandlung der Plasmide in Agrobacterium
    1. Fügen Sie 0,5 g der Plasmide hinzu, die aus den Schritten 2.1 und 2.2 bis 50 'L des Agrobacterium tumefaciens-Stamms GV3101-fähigen Zellen erzeugt wurden, die wie zuvor beschrieben16hergestellt wurden.
      HINWEIS: Andere Agrobacterium-Stämme, wie z. B. GV2260, können ebenfalls verwendet werden.
    2. 30 min auf Eis bebrüten.
    3. Hitzeschock im Wasserbad bei 42 °C für 60 s.
    4. 400 l LB-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 10 g/L NaCl; pH = 7,0) in das Agrobacterium geben und 90 min bei 28 °C brüten.
    5. Den gesamten Gehalt in der Röhre auf LB-Agar mit geeigneten Antibiotika zur Auswahl des Plasmids sowie für das Agrobacterium (für GV3101: 50 mg/L Gentamicin und 50 mg/L Rifampicin) zu verspielen.
    6. Inkubieren Sie Platten bei 28 °C für 36–48 h, bis einzelne Kolonien sichtbar sind.
  2. Mehrere einzelne Kolonien mit Antibiotika auf eine frische LB-Agarplatte (siehe Schritt 3.1.5) pflücken und streifen und über Nacht bei 28 °C wachsen.
    HINWEIS: Es ist optimaler, die Kolonie PCR durchzuführen, um das Vorhandensein des spezifischen binären Konstrukts im Agrobacteriumzu bestätigen. Unserer Erfahrung nach enthalten über 95% der Kolonien die eingeführten binären Konstrukte.
  3. 3 ml LB-Medium plus geeignete Antibiotika (siehe Schritt 3.1.4) mit Agrobacterium-Kolonie, die das Konstrukt von Interesse beherbergt, impfen und durch Schütteln über Nacht bei 28 °C bebrüten, bis die OD600 der Agrobacterium-Kultur 2,0 erreicht.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 3.000 x g und setzen Sie sie im Agroinfiltrationspuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5.6], 250 'M Acetosyringon) auf OD600 = 1,0 zurück).
    HINWEIS: Obwohl es optimal ist, das Inokulum für 2 h bei RT vor der Agroinfiltration zu inkubieren, gab es nach unserer Erfahrung mit dem GV3101-Stamm keinen großen Unterschied zwischen der Zielproteinexpression mit vs. ohne Inkubation.
  5. Verwenden Sie eine 1 ml nadellose Spritze, um das Inokulum in die (abaxiale) Epidermis der vollreifen N. benthamiana Blätter zu infiltrieren.
    HINWEIS: Um eine ausreichende Menge an Blattmaterialien für drei biologische Replikationen vorzubereiten: Ein ganzes Blatt wird in der Regel infiltriert, drei Blätter werden pro Pflanze infiltriert, und für jedes Konstrukt werden drei bis vier Pflanzen verwendet. Für jedes Blatt reichen 1,5–2,0 ml resuspendierte Agrobakterien aus.
  6. Nach 36 h Nachinfiltration (hpi) 200 M Biotin (in 10 mM MgCl2 Lösung) in die mit TurboID-Konstrukten vorinfiltrierten Blätter infiltrieren.
  7. Bewahren Sie die Pflanze für zusätzliche 3–12 h auf, bevor Sie das Blattgewebe ernten, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
    HINWEIS: Der Grund für die Wahl der 36 PSi für die Biotin-Infiltration ist, dass die Zielproteinexpression zu diesem Zeitpunkt nach früheren Studien11ihren Höhepunkt erreicht. Es wird empfohlen, die Zeit zu bestimmen, die für die optimale Expression des Zielproteins von Interesse benötigt wird. Die Inkubationszeit nach der Biotininfiltration hängt vom experimentellen Design und dem untersuchten Zielprotein ab. In der Regel ermöglicht 3–12 h Biotinbehandlung die Kennzeichnung der meisten Proteine proximal zum Zielprotein durch die TurboID-Fusionen.

4. Blattprobensammlung

HINWEIS: Tragen Sie für die nachfolgende Verarbeitung der Blattproben sterile Handschuhe, um eine Keratinkontamination der Proben zu vermeiden. Alle Reagenzien sollten auch so keratinfrei wie möglich sein.

  1. Schneiden Sie die infiltrierten Blätter an der Basis der Petiole, entfernen Sie die Blattvene, dann blitzen Sie das Blattgewebe in flüssigem Stickstoff ein.
  2. Das Blattgewebe mit einem Stößel und Mörtel mahlen und das Blattpulver in 15 ml oder 50 ml Falkenröhren bei -80 °C für die nachfolgende Verwendung lagern.
    HINWEIS: Nehmen Sie drei bis vier Blätter für jede der drei biologischen Repliken aus verschiedenen Pflanzen. Das Protokoll kann hier angehalten werden. Vor den nachfolgenden Schritten wird empfohlen, die Proteinexpression und Diebiotinylierung des Zielproteins durch Immunoblot-Analysen zu bewerten. Typische westliche Flecken sind in Abbildung 2dargestellt.

5. Extraktion des Blatt-Gesamtproteins

  1. Ca. 0,35 g Blattpulver in ein 2 ml-Rohr geben. Bereiten Sie zwei Rohre für jede Probe vor.
    VORSICHT: Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie ein Objekt berühren, das durch flüssigen Stickstoff gekühlt wird.
  2. Fügen Sie 700 l RIPA-Lysepuffer hinzu (50 mM Tris-HCl [pH = 7.5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% Natriumdeoxycholat [w/v], 1 mM DTT, 1 Tablette Protease-Hemmer-Cocktail) bis 0,35 g Blattpulver.
  3. Wirbeln Sie die Rohre für 10 min.
  4. Lassen Sie die Proben 30 min auf Eis.
  5. Mischen Sie den Inhalt alle 4-5 min, indem Sie die Rohre mehrmals auf den Kopf stellen.

6. Entfernung von freiem Biotin durch Entsalzung

HINWEIS: Dieser Abschnitt dauert ca. 50 min.

  1. Equilibrate die Entalting-Spalte.
    1. Entfernen Sie die Versiegelung an der Unterseite der Entsalzungssäule und legen Sie die Säule in ein 50 ml-Rohr.
    2. Entfernen Sie die Lagerlösung durch Zentrifugation bei 1000 x g und 4 °C für 2 min und stellen Sie sicher, dass die Kappe gelockert wird.
    3. Legen Sie die Entsalzungssäule in ein 50 ml-Rohr. Die Säule 3x mit 5 ml RIPA-Lysepuffer ausdemieren, jedes Mal zentrifugieren bei 1000 x g und 4 °C für 2 min und den Durchfluss entsorgen.
    4. Die Entsalzungssäule in ein neues 50 ml-Rohr geben und vorübergehend bei 4 °C für die Nachverwendung lagern.
  2. Drehen Sie die Rohre ab Schritt 5.4 bei 16.500 x g und 4 °C für 10 min und übertragen Sie den Überstand aus den beiden Rohren in ein neues 2 ml Rohr.
  3. Fügen Sie 1.500 L Proteinextrakt an die Oberseite des Harzes der ausgeglichenen Entsalzungssäule (ab Schritt 6.1.4) hinzu. Wenn der Proteinextrakt in das Harz gelangt, fügen Sie weitere 100 L RIPA-Lysepuffer hinzu.
    HINWEIS: Obwohl 1.400 L RIPA-Lysepuffer für die Proteinextraktion aus den Blättern verwendet wurden, wurde das Gesamtvolumen nach Deriator-Extraktion und Entsalzung im Verhältnis zum ursprünglichen Volumen unweigerlich zueinem gewissen Grad erhöht. Daher kann eine Kombination der Proben aus jeder Gruppe, wie in den Schritten 5.1 und 5.4 beschrieben, zu mindestens 1.500 l Proteinextrakt pro Probe führen.
  4. Zentrifugieren Sie bei 1000 x g und 4 °C für 2 min und lassen Sie die entsalzten Proben vorübergehend auf Eis.

7. Quantifizierung der entsalzten Proteinextrakte mit einem Bradford-Assay

  1. Bereiten Sie 50 l jeder Gradienten-BSA-Lösung vor: 0 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml und 1 mg/ml.
  2. Verdünnen Sie den entsalzten Proteinextrakt, indem Sie eine 5-L-Probe mit 45 l ddH2O mischen.
  3. Bereiten Sie 1x Bradford Regent durch Verdünnung der 5x Bradford Regent (100 mg Coomassie brillant blau G250, 47 ml Methanol, 100 ml 85% Phosphorsäure, 53 ml ddH2O).
  4. Fügen Sie dem 2,5 ml 1x-Bradford-Regenten 50 l der bgradienten BSA-Lösung und 50 l verdünnten Proteinextrakt hinzu.
  5. Bei RT für 10 min inkubieren.
  6. Fügen Sie 200 L Lösung s jeder Probe zu einem Bohrwert einer ELISA-Platte hinzu (drei technische Replikationen pro Probe).
  7. Messen Sie den OD595 mit einem Mikroplattenleser.
  8. Zeichnen Sie die Standardkurve basierend auf dem Wert der Gradienten-BSA-Lösung und berechnen Sie die Konzentration der entsalzten Proteinproben. In der Regel liegt die Gesamtproteinkonzentration von 0,7 g Blättern zwischen 3–6 mg/ml.
  9. Bereiten Sie 6–8 mg entsalzter Proteinextrakt für die nachfolgende Affinitätsreinigung vor.

8. Anreicherung von biotinylierten Proteinen

  1. Nehmen Sie 200 L Streptavidn-C1-konjugierte Magnetperlen in ein 2 ml-Rohr.
  2. Equilibrate die streptavidn-C1-konjugierten magnetischen Perlen mit 1 ml RIPA-Lysepuffer für 1 min bei RT.
  3. Verwenden Sie nach jeder Wäsche das magnetische Rack, um die Perlen für 3 min zu adsorbieren und die Lösung vorsichtig durch Pipettieren zu entfernen.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 8.2 und 8.3.
  5. Übertragen Sie den entsalzten Proteinextrakt auf die äquilibierten Streptavidn-C1-konjugierten Magnetperlen.
  6. Inkubieren Sie das Rohr bei 4 °C für 12 h (oder über Nacht) auf einem Rotator, um die biotinylierten Proteine zu affinieren.
  7. Erfassen Sie die Perlen auf einem magnetischen Rack für 4 min bei RT, bis sich die Perlen an einer Seite des Rohres sammeln, und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand durch Pipette.
  8. 1,7 ml Waschpuffer I (2% SDS in Wasser) in das Rohr geben und 8 min am Rotator bei RT aufbewahren. Schritt 8.3 wiederholen.
  9. 1,7 ml Waschpuffer II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Desoxycholsäure [w/v], 1% Triton X-100) in das Rohr geben und 8 min am Rotator bei RT aufbewahren. Schritt 8.3 wiederholen.
  10. 1,7 ml Waschpuffer III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% Desoxycholsäure [w/v], 1% NP40 [v/v]) in das Rohr geben und 8 min am Rotator bei RT aufbewahren. Schritt 8.3 wiederholen.
  11. Fügen Sie 1,7 ml von 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5) hinzu, um das Reinigungsmittel zu entfernen, und wiederholen Sie dann Schritt 8.3.
  12. Übertragen Sie die Perlen in ein neues 1,5 ml Rohr, und wiederholen Sie die Schritte 8.11 und 8.3.
  13. Waschen Sie die Perlen 6x für je 5 min mit 50 mM Ammonium-Bicarbonat-Puffer bei RT.
  14. 1 ml 50 mM Ammoniumbicarbonatpuffer zu den Magnetperlen geben und gut mischen.
  15. Entfernen Sie 100 L Perlen für die Immunoblot-Analyse, um die Anreicherung von biotinylierten Proteinen zu bestätigen. Ein typischer westlicher Fleck ist in Abbildung 3dargestellt.
  16. Den Rest der Proteinproben einfrieren und bei -80 °C lagern oder sofort zur LC-MS/MS-Analyse auf Trockeneis senden.
    HINWEIS: Typische MS-Ergebnisse werden in einer früheren Publikation (Zhang et al. 2019; Abbildung 2, Zusatzdaten 1 und Zusatzdaten 2)11. Die gesamten Datensätze sind auf MassIVE (gefunden unter ) mit dem Bezeichner MSV000083018 und MSV000083019 verfügbar.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die repräsentativen Daten, die die erwarteten Ergebnisse auf der Grundlage des beschriebenen Protokolls veranschaulichen, werden von Zhang et al11adaptiert. Abbildung 1 fasst die Verfahren für die Durchführung von TurboID-basierter PL in N. benthamianazusammen. Abbildung 2 zeigt die Proteinexpression und Biotinylierung in den infiltrierten N. benthamiana Blättern. Abbildung 3 zeigt, dass die...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die TurboID Biotinligase wird durch Hefedisplay-basierte directed Evolution des BioID10erzeugt. Es hat viele Vorteile gegenüber anderen PL-Enzymen. TurboID ermöglicht die Anwendung von PL auf andere Modellsysteme, einschließlich Fliegen und Würmern, deren optimale Wachstumstemperatur bei ca. 25 °C10liegt. Obwohl der PL-Ansatz in Tiersystemen weit verbreitet ist, ist seine Anwendung in Pflanzen begrenzt. Das hier beschriebene Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zur ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 bis Y.Z.), der National Natural Science Foundation of China (31872637 to Y.Z.) und der Fundamental Research Funds for the Central Universities (2019TC028 bis Y.Z.) und der NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 und NIH-GM132582-01 bis S.P.D.K.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
721 SpektralphotometerMetash, hergestellt in ChinaQ / SXFZ6Für OD600 Messung
AmmoniumbicarbonatSigmaA6141-500G
BiotinSigmaB4639-1G50 mM
LagerzentrifugeEppendorfZentrifuge 5702
ZentrifugeEppendorfZentrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor CocktailRoche11697489001
DesoxycholsäureSigmaD2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001Für die Affinitätsreinigung
EDTASigmaE6758-500G
ELISA-PlatteCorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Salzsäure (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P PVDF-MembranMilliporeIPVH00010Für die Western-Blot-Analyse
Lithiumchloridlösung (LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Gekühlt mit niedriger Drehzahl ZentrifugeZonkia, hergestellt in ChinaKDC-2046Zum Entsalzen
von Magnesiumchlorid, Hexahydrat (MgCl2· 6H2O)SigmaM9272-500G
Magnetisches GestellInvitrogen123.21DFür die Bead-Adsorption
Multiskan FC Mikrotiterplatten-PhotometerThermo Fisher ScientificN07710Für OD595 Messung
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Ratte Anti-HARoche11867423001
RotationsmischerKylin-Bell Lab InstrumentWH-986für IP
Shock InkubatorLabotery, hergestellt in ChinaZQPZ-228
Natriumchlorid (NaCl)Fisher ScientificS271-3
NatriumdesoxycholatSigmaD2510-100G
Natriumdodecylsulfat (SDS)SigmaL4390-1KG
Streptavidin-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma baseSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Wassermantel-InkubatorBlauer Pard, hergestellt in ChinaGHP-9080Für die Inkubation
von AgrobacteriumZeba Spin EntsalzungssäuleThermo Fisher Scientific89893Zur Entfernung von Biotin

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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