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Methodenartikel

Herstellung von autologem plättchenreichem Plasma zur Förderung der In-vitro-Expansion humaner Fibroblasten

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DOI:

10.3791/60816

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24. Februar 2021

 ,  , 
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein Gerät vor, das PRP produziert, um die In-vitro-Expansion von Zellen in einem 100% autologen Fibroblastenkultursystem zu fördern.

Zusammenfassung

Derzeit besteht ein großes klinisches Interesse an der Verwendung von autologen Fibroblasten zur Hautreparatur. In den meisten Fällen ist eine In-vitro-Kultivierung von Hautzellen erforderlich. Die Zellkultur mit xenogenen oder allogenen Nährmedien hat jedoch einige Nachteile (z. B. das Risiko einer Übertragung von Infektionserregern oder einer langsamen Zellexpansion). Hier wird ein autologes Kultursystem zur Expansion von humanen Hautfibroblastenzellen in vitro unter Verwendung eines patienteneigenen plättchenreichen Plasmas (PRP) entwickelt. Humane dermale Fibroblasten werden während der Bauchdeckenstraffung aus dem Patienten isoliert. Die Kulturen werden bis zu 7 Tage lang mit einem Medium beobachtet, das entweder mit fötalem Kälberserum (FBS) oder PRP ergänzt wird. Der Blutzellgehalt in PRP-Präparaten, die Proliferation und die Differenzierung der Fibroblasten werden beurteilt. Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Erzielung eines standardisierten, nicht aktivierten PRP-Präparats unter Verwendung eines speziellen Medizinprodukts. Für die Zubereitung werden lediglich ein Medizinprodukt (CuteCell-PRP) und eine Zentrifuge benötigt. Dieses Gerät eignet sich unter ausreichenden medizinischen Praxisbedingungen und ist ein einstufiges, apyrogenes und steriles geschlossenes System, das eine einzelne, weiche Schleuderzentrifugation von 1.500 x g für 5 Minuten erfordert. Nach der Zentrifugation werden die Blutbestandteile getrennt und das plättchenreiche Plasma kann leicht gewonnen werden. Dieses Gerät ermöglicht eine schnelle, konsistente und standardisierte Herstellung von PRP, das als Zellkulturergänzung für die In-vitro-Expansion menschlicher Zellen verwendet werden kann. Das hier erhaltene PRP enthält eine 1,5-fache Thrombozytenkonzentration im Vergleich zu Vollblut zusammen, wobei rote und weiße Blutkörperchen bevorzugt entfernt werden. Es konnte gezeigt werden, dass PRP im Vergleich zu FBS (7,7x) einen verstärkenden Effekt bei der Zellproliferation aufweist und dass Fibroblasten nach PRP-Behandlung aktiviert werden.

Einleitung

Die regenerative Medizin zielt darauf ab, Gewebe und Organe, die durch Alter, Krankheit oder Trauma geschädigt wurden, zu heilen oder zu ersetzen sowie angeborene Defekte zu korrigieren. Bei der autologen Therapie werden einem Patienten Zellen oder Gewebe entnommen, expandiert oder modifiziert und dem Spender wieder zugeführt. Diese Form der Therapeutika hat ein breites Potenzial im Bereich der Dermatologie1. Bei der autologen Fibroblastentherapie werden die Fibroblasten eines Patienten kultiviert und erneut injiziert, um Falten, Rhytiden oder Aknenarben zu behandeln. Da Fibroblasten die wichtigsten funktionellen Zellen in der Dermis sind, kann die Injektion von autologen Fibroblasten bei der Gesichtsverjüngung vorteilhafter sein als andere Therapien2.

In der Haut sind Fibroblasten für die Synthese und Sekretion extrazellulärer Proteine (d. h. Kollagen, Elastin, Hyaluronsäure und Glykosaminoglykane) verantwortlich. Sie setzen auch Wachstumsfaktoren frei, die die Zellfunktion, die Migration und die Zell-Matrix-Zell-Zell-Interaktionen in der normalen Hauthomöostase und Wundheilung regulieren3. Dermale Fibroblasten wurden bereits als potenzielle klinische Zelltherapie für die Wundheilung der Haut4, die Geweberegeneration5 oder Hautfüller in ästhetischen und plastisch-chirurgischen Verfahren6 eingeführt. Einige Studien deuten sogar darauf hin, dass Fibroblasten im Kontext der regenerativen Medizin eine praktischere und wirksamere Zelltherapie sein könnten als mesenchymale Stammzellen7.

Um eine ausreichende Anzahl von Fibroblasten für klinische Anwendungen zu erhalten, ist in der Regel eine Zellexpansion erforderlich. Die Ex-vivo-/In-vitro-Zellkultur erfordert Basalmedium, das mit Wachstumsfaktoren, Proteinen und Enzymen ergänzt wird, um die Zelladhäsion und -proliferation zu unterstützen. Fetales Kälberserum (FBS) ist ein gängiges Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien, da fetales Blut 1) im Vergleich zu erwachsenem Blut reich an Wachstumsfaktoren ist und 2) einen niedrigen Antikörpergehalt aufweist8. Mit fortschreitender Zelltherapie gibt es Bedenken hinsichtlich der Sicherheit klassischer Zellkulturbedingungen, bei denen FBS dem Nährmedium zugesetzt wird. Darüber hinaus besteht nun die Tendenz, FBS durch Alternativen zu ersetzen9. Mehrere FBS-Ersatzprodukte haben vielversprechende Ergebnisse gezeigt10.

Hier wurde die Alternative zum plättchenreichen Plasma (PRP) ausgewählt, und wir haben ein Medizinprodukt entwickelt, um ein standardisiertes PRP-Präparat namens CuteCell-PRP herzustellen. Der Verwendungszweck dieser Vorrichtung ist die Herstellung von autologem PRP, das als Nährmedienergänzung für die In-vitro-Expansion autologer Zellen unter GMP-Bedingungen verwendet werden soll.

PRP ist definiert als eine konzentrierte Thrombozytensuspension im Plasma. Da es zahlreiche Zubereitungsprotokolle gibt, die sich in 1) der benötigten Blutmenge, 2) der Art der verwendeten Geräte und 3) dem Zentrifugationsprotokoll unterscheiden, variieren die resultierenden Thrombozytenkonzentrationen von etwas über bis zu mehr als dem 10-fachen des Blutausgangswerts. Darüber hinaus enthalten PRP-Präparate eine unterschiedliche Kontamination der roten und weißen Blutkörperchen. Der Begriff "PRP" wird daher verwendet, um Produkte zu beschreiben, die sich in ihrer biologischen Zusammensetzung und ihren potenziellen therapeutischen Wirkungen stark unterscheiden.

In den meisten Studien wird die FBS-Substitution durch unterschiedliche Konzentrationen von PRP erreicht, das aktiviert wird (durch Thrombin oder Kalzium). Diese künstliche Aktivierung provoziert eine sofortige und wichtige Freisetzung von Thrombozytenwachstumsfaktoren von 15 min bis zu 24 h11. Daher wird angenommen, dass die Aktivierung der Thrombozyten für Anwendungen in Zellkulturen, bei denen die langsame Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus der allmählichen Degranulation der Thrombozyten erforderlich ist, unerwünscht ist.

Die PRP-Therapie umfasst die Herstellung von autologen Thrombozyten in konzentriertem Plasma12. Die optimale Thrombozytenkonzentration ist unklar, und es gibt eine breite Palette kommerzieller Geräte zur Herstellung von PRP13. Dieser Mangel an Standardisierung resultiert aus der Inkonsistenz zwischen den Studien und hat zu einer Blackbox in Bezug auf die Dosierung und den Zeitpunkt der Injektion geführt. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von autologem PRP unter Verwendung dieses speziellen PRP-Geräts zur Expansion von Hautfibroblasten in einem 100% autologen Ex-vivo-Kulturmodell.

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Protokoll

Das Studienprotokoll entsprach der Deklaration von Helsinki, und alle Patienten gaben vor der Teilnahme an der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Hautproben stammen von gesunden Frauen, die sich in der Abteilung für Plastische, Rekonstruktive und Ästhetische Chirurgie des Universitätsspitals Genf einer Bauchdeckenstraffung unterziehen. Das Verfahren entspricht den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki und wurde von der lokalen institutionellen Ethikkommission genehmigt (Protokoll #3126).

1. Vorbereitung des PRP

HINWEIS: Die CuteCell-PRP-Röhrchen (Table of Materials) sind für die schnelle Herstellung von PRP aus einer kleinen Menge des Blutes des Patienten in einem geschlossenen Kreislaufsystem konzipiert.

  1. Entnahme von Vollblut
    HINWEIS: Eigenblut wird aus einer peripheren Armvene mit einer Schmetterlingsnadel entnommen, die direkt an den PRP-Schlauch angeschlossen ist, gemäß dem Entnahmeprotokoll des medizinischen Instituts. Das Blut kann direkt durch die Venenkanüle entnommen werden, wenn der Patient unter Narkose steht.
    1. Öffnen Sie die Blisterverpackung der Tube. Führen Sie die Venenpunktion durch und füllen Sie die gewünschte Anzahl von PRP-Röhrchen mit Vollblut. Das Vakuum in den Röhrchen ermöglicht die automatische Entnahme des erforderlichen Blutvolumens (~10 ml).
    2. Drehen Sie die Röhrchen mehrmals vorsichtig auf den Kopf, um das Blut mit dem Gerinnungshemmer zu vermischen.
    3. Entnehmen Sie in einer Biosicherheitswerkbank (Klasse 2) 100 μl Gesamtvollblut mit einer 1-ml-Spritze für weitere Blutkörperchenzählungen.
  2. Zentrifugation
    Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge richtig ausbalanciert ist, bevor Sie sie starten.
    1. Sobald das Blut in den PRP-Röhrchen gesammelt wurde, bereiten Sie bei Bedarf ein Gegengewichtsröhrchen (separat erhältlich) mit Wasser auf dem gleichen Niveau wie das Blut im PRP-Röhrchen vor. Legen Sie die gefüllten Röhrchen gegenüberliegend in die Zentrifuge und achten Sie darauf, dass die Maschine ausbalanciert ist.
    2. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1.500 x g für 5 min.
      Anmerkungen: Stellen Sie die entsprechende Drehzahl gemäß den Anweisungen des Zentrifugenherstellers ein. Nach der Zentrifugation wird das Blut fraktioniert. Die roten und weißen Blutkörperchen werden unter dem Gel eingeschlossen und die Blutplättchen setzen sich auf der Oberfläche des Gels ab (Abbildung 1).
  3. Drehen Sie das PRP-Röhrchen vorsichtig 20x um, um die Thrombozytenablagerung im Plasmaüberstand zu resuspendieren.
    Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass sich die Blutplättchen vollständig vom Gel gelöst haben. Das Plasma sollte von klar und transparent zu trüb wechseln. Wenn Thrombozytenaggregate vorhanden sind, sollten diese mit dem Plasma gesammelt werden.
  4. Um PRP zu sammeln, entnehmen Sie die Plasmalösung aus dem Röhrchen mit einem Spritzentransfergerät, das an eine 10-ml-Spritze angeschlossen ist.
    HINWEIS: Aus jedem Röhrchen werden etwa 5 ml PRP gewonnen. Die PRP-Lösung ist nun bereit, in die endgültige Mediumzubereitung gemischt zu werden. Die Lösung kann bei Raumtemperatur (RT) unter der Sicherheitswerkbank aufbewahrt werden, bis zu den zukünftigen Schritten, die das Hämatologie-Analysegerät und die Verwendung umfassen.
  5. Bestimmen Sie vor der Anwendung des PRP die Thrombozytenkonzentration, das mittlere Thrombozytenvolumen und die Anzahl der roten und weißen Blutkörperchen mit einem automatisierten Hämatologie-Analysegerät (Materialtabelle). Entnehmen Sie dazu vorsichtig 100 μl der Lösung und füllen Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen um.
    HINWEIS: PRP wird als autologes Kulturergänzungsmittel in einer Konzentration zwischen 5–20 % v/v verwendet. Die optimale Konzentration von PRP muss für jede Zelllinie bestimmt werden. Um die Bildung von Fibringerinnseln zu verhindern, sollte das endgültige Nährmedium mit 2 U/ml Heparin ergänzt werden.

2. Isolierung autologer Fibroblasten und Kultur in FBS- oder PRP-supplementierten Medien

  1. Waschen Sie die Hautproben in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch leichtes Schütteln in einem 50-ml-Polypropylenröhrchen.
  2. Wenn die Hautprobe relativ groß ist (>10 cm2), legen Sie die Probe auf den Deckel einer 150cm2 Gewebekulturschale (epidermale Seite nach unten). Entfernen Sie das Unterhautfettgewebe mit einer Pinzette und einer Schere. Um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern, spülen Sie das Gewebe alle paar Minuten in PBS aus.
    Anmerkungen: Verwenden Sie für kleinere Proben eine kleinere Gewebekulturschale.
  3. Wenn der Fettabbau abgeschlossen ist, schneiden Sie das Gewebe mit einem sterilen Skalpell in ca. 0,5 cm x 1,5 cm große Streifen.
  4. Geben Sie 5 ml Kollagenase-Dispase-Gemisch (Materialtabelle; 14 Wünsch-Einheiten/ml) in ein steriles 15-ml-Röhrchen.
  5. Übertragen Sie das geschnittene Gewebe in das Röhrchen und achten Sie darauf, dass die Gewebestücke in die Lösung eingetaucht sind. Verschließen Sie das Röhrchen sicher.
  6. Legen Sie die Röhrchen in einen Inkubator bei 37 °C mit orbitalem Schütteln für 150 min. Legen Sie nach der Inkubation das Röhrchen mit dem Gewebe in die Biosicherheitswerkbank.
  7. Stellen Sie den Deckel einer sterilen 100-mm-Kulturschale verkehrt herum in die Biosicherheitswerkbank. Übertragen Sie die aufgeschlossene Gewebelösung ohne Spritzer auf den Boden der 100-mm-Kulturschale. Wenn Gewebestücke im Röhrchen verbleiben, verwenden Sie eine sterile 1-ml-Pipette oder eine sterile Pinzette, um die Gewebestücke auf den Boden der 100-mm-Kulturschale zu übertragen.
  8. Trennen Sie mit dem Epidermisstreifen nach oben die intakte Epidermisfolie mit zwei Zangenpaaren von der Dermis. Halten Sie die Dermis des Gewebestreifens mit einer Pinzette und den Rand der Epidermis mit einer weiteren Pinzette. Schälen Sie die Dermis und die Epidermis in zwei Teile auseinander und lassen Sie die getrennten Stücke auf demselben Deckel. Versuchen Sie, diesen Schritt schnell durchzuführen und wiederholen Sie die Manipulation für jedes Stück Gewebe.
  9. Übertragen Sie die Hautstücke in eine neue 100-mm-Kulturschale, die PBS enthält.
  10. Legen Sie die Hautstücke mit einer Laborzange in ein 15-ml-Polypropylenröhrchen mit 3 ml 0,3 % Trypsin/PBS. 10-20 min im 37 °C warmen Wasserbad inkubieren und das Röhrchen alle 2−3 min mehrmals umdrehen.
  11. Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, fügen Sie 3−5 ml eiskaltes vollständiges Nährmedium hinzu (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] oder RPMI mit 10 % FBS). Wirbeln Sie das Rohr mehrmals kräftig vor. Filtern Sie die Fibroblastensuspension durch ein 85-μm-Nylonnetz (über einem 50-ml-Röhrchen), um Hautablagerungen zu entfernen.
  12. 10 min bei 150 x g bei 4 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 100−1.000 μl vollständigem Nährmedium.
  13. Zählen Sie unter Verwendung von Trypanblau (Verdünnungsfaktor von x2), das mit der Zellsuspension vermischt ist, die Anzahl der gesamten und lebensfähigen Zellen, indem Sie die Kammer des Hämozytometers füllen.
    HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen hängt von den Bedingungen ab, die für die enzymatische Verdauung verwendet werden. Um die Zellerholung und Zelllebensfähigkeit zu erhöhen, kann die Hautprobe in kleinere Stücke geschnitten werden.
  14. Platte 3−10 x 104 Zellen in 5 mL komplettem FBS-Nährmedium (DMEM, 10 % FBS hitzeinaktiviert für 60 min bei 56 °C, 1 % 1 M HEPES-Pufferlösung, 1 % 100x nicht-essentielle Aminosäuremischung, 1 % 100x L-Glutamin, 1 % 100x Penicillin/Streptomycin, 1 % 100x Natriumpyruvat) in einem 25cm 2 Gewebekulturkolben. Inkubieren bei 37 °C.
    HINWEIS: Lebensfähige Fibroblasten heften sich innerhalb von 24 Stunden an den Kolben und beginnen in 2−3 Tagen, die Spindelform zu zeigen.
  15. Aspirieren Sie an Tag 2 das Medium mit den nicht adhärenten Zellen und fügen Sie frisches Medium hinzu.
    Anmerkungen: Da tote Zellen im Nährmedium das Wachstum lebensfähiger Fibroblasten beeinflussen, müssen nicht adhärente, tote Zellen aus der Kultur entfernt werden.
  16. Wechsle das Medium alle 3−4 Tage, bis die Kultur eine Konfluenz von 70−80% erreicht hat.
  17. Um Fibroblasten zu ernten, waschen Sie sie mit PBS und inkubieren Sie sie mit Trypsin/EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C im Inkubator.
  18. Um die Reaktion zu stoppen, fügen Sie 3−5 ml warmes vollständiges Nährmedium hinzu (DMEM oder RPMI mit 10 % FBS). Nehmen Sie ein Aliquote der Zellsuspension, um die Zellen mit dem Hämozytometer zu zählen. Die Suspension wird 5 min bei 200 x g zentrifugiert und das Medium durch Aspiration entfernt.
  19. Kultivieren Sie den Fibroblasten in PRP-Medium (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M HEPES-Pufferlösung, 1% 100x nicht-essentielle Aminosäuremischung, 1% 100x L-Glutamin, 1% 100x Penicillin/Streptomycin, 1% 100x Natriumpyruvat, 2 U/mL Heparin) im Inkubator bei 37 °C.
    Anmerkungen: Die empfohlene Mindestzelldichte beträgt 4.000 lebensfähige Zellen/cm2.
  20. Um die Auswirkungen von PRP auf die Proliferation von Fibroblasten zu untersuchen, wurdenFibroblasten (Passage 2) in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 8 x 10 3 Zellen pro Well in PRP-Medium mit unterschiedlichen PRP-Konzentrationen (1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % und 50 %) und mit 2 U/ml Heparin oder unter klassischen Nährmedienbedingungen (10 % FBS) gekeimt. Nach 7 Tagen Kultur fügen Sie den Zellen einen lebenswichtigen Farbstoff (Zellproliferation violett) hinzu und beurteilen Sie die Proliferation mittels Durchflusszytometrie.
  21. Zur Untersuchung von Umlagerungen des Zytoskeletts wurden Keimzellen in 96 Well Black/Clear Flat Bottom Plates in einer Konzentration von 1 x 10 5 Zellen/ml in vollständigem FBS-Wachstum DMEM (siehe Schritt 2.14) mit0,5 % FBS für 24 h supplementiert. Behandeln Sie Zellen mit 10 % FBS oder unterschiedlichen PRP-Konzentrationen (1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % und 50 %) für 7 Tage.
    1. Fixieren Sie die Fibroblasten mit 4% Paraformaldehyd für 10 min und permeabilisieren Sie mit 0,1% Triton X-100 für 5 min bei RT. Färben Sie die Fibroblasten mit 50 mL 5 U/mL Phalloidin, waschen Sie sie 2x mit PBS und markieren Sie sie mit 50 mL 1 mg/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 min. Der Cytation 3 cell imaging multimode reader (BioTek) wurde zur Visualisierung der Phalloidinfärbung verwendet.

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Ergebnisse

Bei dieser patentierten Technologie handelt es sich um ein einfaches, schnelles und reproduzierbares Medizinprodukt, das zur Herstellung standardisierter PRP-Präparate verwendet wird. Es handelt sich um ein einstufiges, vollständig geschlossenes System, das die Herstellung von PRP aus venösem Vollblut nach 5 min Zentrifugation bei 1.500 x g (aufgrund der Trenngeltechnologie) ermöglicht. Das nach der Zentrifugation gewonnene PRP wird aus roten und weißen Blutkörperchen entfernt, die sich unter dem Gel befinden. N...

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Diskussion

Zu den Vorteilen der Verwendung autologer Fibroblasten als natürliche Alternative im Vergleich zu anderen Füllstoffen in der Wundzelltherapie gehören eine gute Biokompatibilität, minimale Nebenwirkungen sowie eine einfache Entnahme und Anwendung. Bevor diese Therapeutika jedoch in einer täglichen klinischen Umgebung eingesetzt werden, sind geeignete präklinische Studien erforderlich, um die Wachstumsmerkmale zu identifizieren und die biologische Funktion und Sicherheit isolierter Fibroblasten sowohl vor als auch nach der...

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Offenlegungen

Dieses Projekt wurde von Regen Lab SA finanziert. Sarah Berndt ist die leitende Projektleiterin für Zelltherapie bei Regen Lab und ist bei Regen Lab SA angestellt. Antoine Turzi ist der CEO von RegenLab.

Danksagungen

Wir danken Herrn Grégory Schneiter für die technische Unterstützung bei den durchflusszytometrischen Daten; Prof. Dr. Muriel Cuendet (Labor für Pharmakognosie, Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften und Universität Genf) für die Ermöglichung der Verwendung des Attune-Durchflusszytometers und des Hochdurchsatzmikroskops Cytation 3; Prof. Dr. Brigitte Pittet für wissenschaftliche Beratung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96 Well Schwarz Klarer FlachbodenBD Falcon35321932/Karton
Zellspur Violett FarbstoffThermo Fischer ScientificC34557180 Assays
CuteCell PRPRegen Lab SACC-PRP-3T3 Röhrchen pro Packung
DAPISigmaD95421 mg
DMEMGibco52400-025500 mL
FBSGibco10270106500 mL
Glutamin 200 mMGibco25030024100 mL
Hämatologie-ZählerSysmexKK-21N
Heparin 5000E LiqueminDrossapharm AG0,5 mL
HEPES Puffer Lösung 1MGibco15630-056100 mL
Liberase DHRoche54010540012x 5 mg pro Packung
MEM NEAA 100xGibco11140-035100 mL
Na Pyruvat 1mg/mLGibco11360-039100 mL
Penicillin StreptomycinGibco15140122100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488Molekulare SondenA12379300 Einheiten
RPMIGibco31966-021500 mL
Trypsin 1x 0,25%Gibco25050-014100 mL
Trypsin EDTA 0,25%Gibco25200056100 mL

Referenzen

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