Methodenartikel

Herstellung der Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in der Erwachsenenratte

DOI:

10.3791/60841

⸱

25. Februar 2020

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das folgende Manuskript beschreibt eine neuartige Methode zur Entwicklung eines biologischen, geschlossenen neuronalen Feedbacksystems, das als zusammengesetzte regenerative periphere Nervenschnittstelle (C-RPNI) bezeichnet wird. Dieses Konstrukt hat die Fähigkeit, mit peripheren Nerven zu integrieren, um effelösenmotorische Signale zu verstärken und gleichzeitig eine affete sensorische Rückmeldung zu liefern.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jüngste Fortschritte in der Neuroprothetik haben es Menschen mit Extremitätsverlust ermöglicht, viele Funktionen zu reproduzieren, die in der fehlenden Extremität heimisch sind, und dies wird oft durch die Integration mit dem peripheren Nervensystem erreicht. Leider sind derzeit angewandte Methoden oft mit erheblichen Gewebeschäden verbunden, die eine längere Anwendung verhindern. Darüber hinaus fehlt es diesen Geräten oft an einem aussagekräftigen Grad an sensorischem Feedback, da ihre komplexe Konstruktion Vibrationen oder andere Empfindungen dämpft, von denen ein Benutzer zuvor bei der Verwendung einfacherer Prothesen abhängig gewesen sein könnte. Die composite regenerative periphere Nervenschnittstelle (C-RPNI) wurde als stabiles, biologisches Konstrukt entwickelt, das effetierische motorische Nervensignale verstärken und gleichzeitig eine sensorische Rückmeldung liefern kann. Das C-RPNI besteht aus einem Segment von freiem dermalen und Muskeltransplantat, das um einen gezielten gemischten sensorimotorischen Nerv gesichert ist, mit bevorzugter motorischer Nervenreinnervation des Muskeltransplantats und sensorischer Nervenreinnervation des dermalen Transplantats. Bei Ratten hat dieses Konstrukt die Erzeugung von zusammengesetzten Muskelaktionspotentialen (CMAPs) demonstriert, die das Signal des Zielnervs vom Mikro- bis Millivolt-Niveau verstärken, mit Signal-Rausch-Verhältnissen von durchschnittlich etwa 30-50. Die Stimulation der dermalen Komponente des Konstrukts erzeugt zusammengesetzte sensorische Nervenaktionspotentiale (CSNAPs) am proximalen Nerv. Als solches hat dieses Konstrukt vielversprechende zukünftige Nützlichkeit für die Realisierung der idealen, intuitiven Prothese.

Einleitung

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Extremitätamputationen betreffen fast 1 von 190 Amerikanern1, und ihre Prävalenz wird voraussichtlich von 1,6 Millionen heute auf über 3,6 Millionen bis 20502 steigen. Trotz dokumentierter Verwendung seit über einem Jahrtausend muss die ideale Prothese noch realisiert werden3. Derzeit gibt es komplexe Prothesen, die mehrere Gelenkmanipulationen mit dem Potenzial haben, viele motorische Funktionen der nativen Extremität4,5zu reproduzieren. Diese Geräte werden jedoch nicht als intuitiv betrachtet, da die gewünschte prothetische Bewegung in der Regel funktional vom Eingangssteuersignal getrennt ist. Benutzer betrachten diese "fortgeschrittene Prothetik" in der Regel als schwer zu erlernen und daher nicht für den täglichen Gebrauchgeeignet 1,6. Darüber hinaus bieten komplexe Prothesen, die derzeit auf dem Markt sind, keinen nennenswerten Grad an subtilem sensorischem Feedback für eine angemessene Kontrolle. Der Tastsinn und propriozeption sind entscheidend für die Durchführung täglicher Aufgaben, und ohne diese, einfache Handlungen wie das Abholen einer Tasse Kaffee werden belastend, da es vollständig auf visuelle Hinweise7,8,9. Aus diesen Gründen sind fortgeschrittene Prothesen mit einem erheblichen Grad an geistiger Ermüdung verbunden und werden oft als belastend und unbefriedigend beschrieben5,10,11. Um dies zu beheben, haben einige Forschungslabore Prothesen entwickelt, die in der Lage sind, ein begrenztes Maß an sensorischem Feedback über direkte neuronale Interaktion12,13,14,15, aber Feedback ist oft auf kleine, verstreute Bereiche an Händen und Fingern beschränkt12,13, und Empfindungen wurden festgestellt, schmerzhaft und unnatürlich manchmal15. Viele dieser Studien mangelt es leider an nennenswerten Langzeit-Follow-up und Nervenhistologie, um lokale Gewebeeffekte abzuleiten, während Schnittstellenversagen auf der Skala von Wochen bis Monaten16.

Für diese Population würde das ideale Prothesengerät eine hochpräzise Motorsteuerung bieten und gleichzeitig sinnvolles somatosensorisches Feedback aus der Umgebung des Einzelnen während seines gesamten Lebens bieten. Entscheidend für das Design dieser idealen Prothese ist die Entwicklung einer stabilen, zuverlässigen Schnittstelle, die eine gleichzeitige Übertragung von afferent somatosensorischen Informationen mit efferentmotorischen Signalen ermöglichen würde. Die vielversprechendsten der aktuellen Mensch-Maschine-Schnittstellen sind diejenigen, die direkt mit dem peripheren Nervensystem interagieren, und die jüngsten Entwicklungen auf dem Gebiet der neurointegrierten Prothetik haben darauf hingearbeitet, die Lücke zwischen bioelektrischen und mechanischen Signalen zu überbrücken17. Zu den verwendeten Stromschnittstellen gehören: flexible Nervenplatten14,15,18, extraneurale Manschettenelektroden13,19,20,21,22,23, Gewebe durchdringende Elektroden24,25,31,32und intrafascicular elektroden26,27 ,28. Jedoch, jede dieser Methoden hat Einschränkungen in Bezug auf Nervenspezifität, Gewebeverletzung, axonale Degeneration, Myelin-Erschöpfung und/oder Narbengewebebildung im Zusammenhang mit chronischer Indwelling Fremdkörperreaktion16,17,18,19gezeigt. In jüngerer Zeit wurde postuliert, dass ein Treiber hinter einem eventuellen implantierten Elektrodenversagen der signifikante Unterschied in Youngs Moduli zwischen elektronischem Material und nativem Neuronusgewebe ist. Gehirngewebe unterliegt einer signifikanten Mikrobewegung auf einer täglichen Basis, und es wurde theoretisiert, dass die Scherspannung durch Unterschiede in Youngs Moduli induziert verursacht Entzündungen und schließlich dauerhafteNarbenbildung 30,31,32. Dieser Effekt wird oft in den Extremitäten verstärkt, wo periphere Nerven sowohl physiologischen Mikrobewegungen als auch absichtlicher Extremitätsmakrobewegung ausgesetzt sind. Aufgrund dieser konstanten Bewegung ist es vernünftig, zu dem Schluss zu kommen, dass die Nutzung einer vollständig abiotischen peripheren Nervenschnittstelle nicht ideal ist und eine Schnittstelle mit einer biologischen Komponente besser geeignet wäre.

Um diesem Bedarf an einer biologischen Komponente gerecht zu werden, entwickelte unser Labor eine biotische Nervenschnittstelle mit dem Begriff Regenerative Periphere Nervenschnittstelle (RPNI), um transsektierte periphere Nerven in eine Restgliedmaße mit einem Prothesengerät zu integrieren. Die RPNI-Fertigung beinhaltet die chirurgische Implantation eines peripheren Nervs in ein autologes freies Muskeltransplantat, das sich anschließend vaskularisiert und reinnervatiert. Unser Labor hat diese biologische Nervenschnittstelle in den letzten zehn Jahren entwickelt, mit Erfolg bei der Verstärkung und Übertragung von motorischen Signalen in Kombination mit implantierten Elektroden in Tier- und Humanversuchen, die eine geeignete prothetische Kontrolle mit mehreren Freiheitsgraden2,34ermöglichen. Darüber hinaus haben wir die sensorische Rückkopplung durch die Verwendung von peripheren Nerven, die in dermalen Transplantaten eingebettet sind, die als Dermal Sensory Interface (DSI)3,35bezeichnet. Bei distaleren Amputationen ist die gleichzeitige Verwendung dieser Konstrukte möglich, da motorische und sensorische Faszikel innerhalb des Zielperipherienervs operativ getrennt werden können. Bei proximaleren Amputationen ist dies jedoch aufgrund der Vermischung von Motor- und Sensorfasern nicht möglich. Die Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) wurde für proximale amputationen entwickelt und beinhaltet die Implantation eines gemischten sensorimotorischen Nervs in ein Konstrukt, das aus freiem Muskeltransplantat besteht, das an einem Segment des dermalen Transplantats befestigt ist (Abbildung 1). Periphere Nerven zeigen bevorzugte gezielte Reinnervation, so dass sensorische Fasern das dermale Transplantat und die Motorfasern, das Muskeltransplantat, wieder verinnerlichten. Dieses Konstrukt hat somit die Fähigkeit, motorische Signale gleichzeitig zu verstärken und gleichzeitig somatosensorisches Feedback36 (Abbildung 2) bereitzustellen, was die Realisierung der idealen, intuitiven, komplexen Prothese ermöglicht.

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Protokoll

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Alle Tierversuche werden mit Genehmigung des Committee on the Use and Care of Animals der University of Michigan durchgeführt.

HINWEIS: Spenderratten haben freien Zugang zu Nahrung und Wasser vor haut- und Muskelspendeverfahren. Euthanasie wird unter tiefer Anästhesie durchgeführt, gefolgt von einer intrakardialen Kaliumchlorid-Injektion mit einer sekundären Methode des bilateralen Pneumothorax. Jeder Rattenstamm kann theoretisch mit diesem Experiment verwendet werden; unser Labor hat jedoch im Alter von zwei bis vier Monaten konsistente Ergebnisse sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Fischer F344 Ratten (200-250 g) erzielt. Spenderratten müssen für die Versuchsratten isisersein.

1. Zubereitung des dermalen Transplantats

  1. Anästhetisieren Spenderratte in einer Induktionskammer unter Verwendung einer Lösung von 5% Isofluran in Sauerstoff bei 0,8-1 L/min. Sobald die Ratte anästhesiert wurde, aus der Induktionskammer entfernen und auf einen reatmenden Nasenkegel legen, das Isofluran auf 2-2,5% zur Aufrechterhaltung der Anästhesie senken.
  2. Eine Lösung von 0,02-0,03 ml Carprofen (50 mg/ml) in 0,2 ml steriler Saline subkutan zwischen den Schulterblättern für Analgesie.
  3. Tragen Sie künstliche Tränen Salbe auf beide Augen, um Hornhautgeschwüre zu verhindern.
  4. Rasieren Sie mit Clippers die gesamte untere Hinterbeine, den Knöchelbereich und die Seiten der Pfoten.
  5. Reinigen Sie die gewählte Hinterglieds- und Plantaroberfläche der Pfote mit Alkohol, gefolgt von iodopovidon Lösung, die mit einer endgültigen Reinigung mit Alkohol endet, um Rest-Iodopovidon zu entfernen.
  6. Mit einem handgehaltenen Mikromotor-Hochgeschwindigkeitsbohrer mit einem abnehmbaren runden Feinkorn-Polierstein (4000 Umdrehungen pro Minute) gratumten Sie die Plantaroberfläche der Pfote, um die Epidermis zu entfernen. Während des Grabens, tropfen der Wäsche, um nicht die Haut zu verbrennen. Die zugrunde liegende Dermis wird ein glänzendes Aussehen mit punktgenauen Blutungen haben.
  7. Tragen Sie ein Tourniquet auf die untere Extremität auf, um den Blutfluss zu verlangsamen.
  8. Entfernen Sie die Plantaderhaut scharf mit einem #15 Skalpell und legen Sie sie in salzsäurebefeuchtete Gaze, um austrocknung zu verhindern. Einige Sehnen- und Bindegewebe werden von Natur aus mit der Haut in diesem Schritt entfernt und später entfernt.
  9. Tragen Sie Gaze wrap auf den blutenden Fuß auf langsame Blutungen auf. Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.9, wenn Sie zwei Konstrukte ausführen.
  10. Entfernen Sie unter dem Mikroskop (20-fache Vergrößerung) das Pflegende und Bindegewebe mit einer Mikroschere aus der tiefen Schicht des Hauttransplantats. Achten Sie darauf, keine Löcher im Transplantat zu machen. Das verdünnte dermale Transplantat sollte leicht opak sein und nur Dermis enthalten und etwa 0,5 cm x 1,0 cm groß sein.
  11. In saline-befeuchteter Gaze geben, bis sie für die C-RPNI-Konstruktionsfertigung bereit sind. Grafts sollten innerhalb von 2 Stunden nach der Ernte verwendet werden.

2. Vorbereitung des Muskeltransplantats

  1. Machen Sie einen Längsschnitt entlang des vorderen Aspekts des unteren Hinterglieds von knapp über dem Knöchel bis knapp unterhalb des Knies mit einem #15 Skalpell. Sezieren Sie durch subkutanes Gewebe, um die zugrunde liegende Muskulatur zu entlarven.
  2. Am distalen Aspekt des Schnittes, entlarven Sie die tendenziösen Einfügungen der unteren Gliedmaßenmuskulatur. Tibialis anterior (TA) ist typischerweise der größte und vordere der Muskeln, und direkt unter und hinter diesem Muskel liegt der Extensor digitorum longus (EDL). Isolieren Sie die distale EDL-Sehne von den anderen Sehnen in der Gegend, wobei darauf geachtet wird, dass sie an dieser Stelle nicht in die Einfügung eingreift.
  3. Gewährleisten Sie die Isolierung der richtigen Sehne, indem Sie beide Dosen einer Zange unter die Sehne einsetzen und einen Aufwärtsdruck ausüben, indem Sie die Zange öffnen, um einen Sehnenausflug zu verursachen. Die Manipulation dieser Sehne sollte dazu führen, dass sich alle Zehen gleichzeitig ausdehnen.
  4. Führen Sie eine distale Tenotomie mit scharfer Irisschere durch und trennen Sie den Muskel von den umgebenden Geweben unverblümt mit Tenotomien (oder einer anderen stumpf-spitzen Schere), die proximal arbeiten, um den pflegenden Ursprung zu finden.
  5. Sobald die proximale Sehne visualisiert ist, führen Sie wieder eine Tenotomie mit scharfen Irisschere. Legen Sie das Muskeltransplantat in eine salzbefeuchtete Gaze, um Austrocknung zu verhindern.
  6. Sobald alle gewünschten Transplantate von einer Spenderratte entfernt wurden, werden Sie in erster Linie durch intrakardiale KCl-Injektion (1-2 mEq K+/kg) eingeschläfert, gefolgt von sekundärer Euthanasie mit bilateraler Punktionspneumothorax mit #15 Klinge.

3. Häufige peronesale Nervenisolierung und -zubereitung

  1. Anästhetisieren und analgesien der experimentellen Ratte gemäß Protokoll in den Schritten 1.1-1.3.
  2. Rasieren Sie den gewünschten Oberschenkel und reinigen Sie mit Alkohol, Betadin, Endmit Alkohol, um Spuren von Betadin zu entfernen.
  3. Bewegen Sie das Tier vom chirurgischen Vorbereitungstisch zum chirurgischen Mikroskoptisch und legen Sie es auf das Heizkissen mit Temperaturfühler für die Körpertemperaturerhaltung. Halten Sie Isofluran bei 2-2,5% und Sauerstoff bei 0,8-1 L/min.
  4. Markieren Sie den Schnitt, der sich von nur distaler bis ischitischer Kerbe bis zum unteren Teil des Knies erstreckt. Diese Markierung sollte dem Oberschenkelknochen unterlegen und abgewinkelt sein. Machen Sie den Schnitt mit einer #15 Klinge, die durch den zugrunde liegenden Bizeps femoris fascia einführt.
  5. Sezieren Sie vorsichtig durch den Bizeps femoris Muskel mit entweder einem Hämostat oder stumpf-kipped Mikroschere zu dem Raum zugrunde liegenden bizeps femoris.
    HINWEIS: Der Ischiasnerv bewegt sich ungefähr in die gleiche Richtung wie der ursprüngliche Schnitt, der gemacht wurde. Es gibt drei Zweige, in der Regel mit suralen Nerven posterior und gemeinsamen peronealen und tibialen Nerven reisen oberflächlich und tief zum Knie, bzw.
  6. Nach der Identifizierung des gemeinsamen peronealen (CP) Nervs, mit einem Paar mikro-, fein-tipped Zange und Mikroschere, sorgfältig isolieren den CP-Nerv von den anderen Ischiaszweigen und entfernen Sie alle verweilenden Bindegewebe distal.
  7. An der Stelle, an der der Nerv die Oberfläche des Knies kreuzt, schneiden Sie den Nerv mit einer Mikroschere scharf ab.
    HINWEIS: Die Verwendung einer scharfen Schere ist in diesem Schritt äußerst wichtig, da die Ursache eines signifikanten Traumas des Nervs das Risiko einer Neurombildung erhöhen könnte.
  8. Befreien Sie vorsichtig das verbleibende Bindegewebe vom CP-Nerv und arbeiten Sie proximal, um den Nerv auf eine Länge von ca. 2 cm zu befreien.

4. C-RPNI-Konstruktionsfertigung

  1. Entfernen Sie das Muskeltransplantat aus der saline-befeuchteten Gaze und entfernen Sie alle zentralen Sehnengewebe sowie ein kleines zentrales Segment von Epimysium. Lassen Sie die sehnenförmigen Enden intakt.
  2. Verwenden eines 8-0 Nylon-Nähte, sichern Sie das Epineurium des transectierten Endes des CP-Nerven in den Bereich des Muskeltransplantats ohne Epimysium mit zwei unterbrochenen Stichen auf beiden Seiten des Nervs.
  3. Sichern Sie das Muskeltransplantat an der Oberschenkelmur periosteum mit einem einzigen 6-0 Nylon unterbrochen Stich sowohl proximal und distally mit dem Nerven-Muskel-Kreuzung weg vom Oberschenkelknochen.
    HINWEIS: Sichern Sie den Muskel so, dass er in normaler entspannter Länge ist. Versuchen Sie nicht, den Muskel deutlich zu dehnen oder lassen Sie zu viel Laxheit bei der Sicherung.
  4. Platzieren Sie eine 8-0 Nylonstich am unteren, zentralen Rand des Muskeltransplantats Epimysium, Sicherung an das CP-Nervenepineurium in einer Weise, die Laxheit im Nerv innerhalb des Muskeltransplantats zu schaffen und helfen, zukünftige Spannungen zu lindern, die es mit späterer Ambulation ausgesetzt sein kann.
  5. Entfernen Sie das Hauttransplantat aus der saline-befeuchteten Gaze und ordnen Sie es auf dem Muskeltransplantat so an, dass der Nerv und die Mehrheit des Muskels vollständig abgedeckt werden. Stellen Sie sicher, dass der tiefe Rand der Dermis auf dem Muskel ruht. Trimmen Sie jede Dermis, die über die Grenze des Muskels hinausreicht.
  6. Sichern Sie das Hauttransplantat mit 8-0 umlaufend am Muskeltransplantat Nylon unterbrochene Nähte. In der Regel werden je nach Größe des Konstrukts insgesamt 4-8 Nähte verwendet.
  7. Schließen Sie den Bizeps femoris fascia über dem Konstrukt in laufender Weise mit 5-0 chromische Naht.
  8. Schließen Sie die darüber liegende Haut mit 4-0 chromischen Naht in Laufen.
  9. Den Operationsbereich mit einem Alkoholpad abwischen und Antibiotikum salbe auftragen.
  10. Beenden Sie das inhalative Anästhetikum und lassen Sie ratten sich mit Nahrung und Wasserquellen erholen, die von Käfigkameraden getrennt sind.

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Ergebnisse

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Konstruktherstellung gilt als erfolglos, wenn Ratten eine Infektion entwickeln oder die chirurgische Anästhesie nicht überleben. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass diese Konstrukte etwa drei Monate benötigen, um zu rekonveraskieren und reinnervate2,3,17,36. Nach ablaufder dreimonatiger Erholungsphase können Konstrukttests durchgeführt werden, um die Lebensf...

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Diskussion

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Das C-RPNI ist ein neuartiges Konstrukt, das eine gleichzeitige Verstärkung der motorischen Efferentsignale eines Zielnervs mit einer affekten sensorischen Rückkopplung ermöglicht. Insbesondere hat das C-RPNI einen einzigartigen Nutzen für diejenigen, die mit proximalen Amputationen leben, da ihre motorischen und sensorischen Faszikel während der Operation nicht einfach mechanisch getrennt werden können. Stattdessen nutzt das C-RPNI die inhärenten bevorzugten Reinnervationseigenschaften des Nervs selbst, um die sensorisc...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Angaben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren bedanken sich bei Jana Moon für die fachkundige technische Unterstützung. Die in diesem Beitrag vorgestellten Studien wurden durch ein R21-Stipendium (R21NS104584) an SK finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#15 ScalpelAspen Surgical, IncRef 371115Rippenrücken Chirurgische Klingen aus Kohlenstoffstahl (#15)
4-0 Chrom-Naht-EthiconSKU# 1654GP-3 Rückwärts-Schnittnadel
5-0 Chrom-Naht-EthiconSKU# 687GP-3 Rückwärts-Schnittnadel
6-0 Ethilon-Naht-EthiconSKU# 697GP-1 Rückwärts-Schnittnadel (Nylon-Naht)
8-0 Monofile NahtAROSurgicalT06A08N14-13Schwarzes monofiles Polyamid-Nahtmaterial auf einer konischen Nadel mit Gewinde
Experimentelle RattenEnvigoF344-NH-sdRatten sind Fischer F344 Stamm
Fluriso (Isofluoran)VetOne13985-528-40Inhalationsanästhetikum
Mikromotor Hochgeschwindigkeitsbohrer mit SteinMaster MechanicModell 151369Handgeführtes rotierendes Werkzeug; Das Kit enthält mehrere feine Körnungssteine
SauerstoffKryogene GaseUN1072Standard-Sauerstoffkanister in medizinischer Qualität
KaliumchloridAPP Pharmaceuticals63323-965-20Injizierbare Form, 2 mEq/ml
Povidon-Jod USPMediChoice65517-0009-110% topische Lösung, kann eine Flasche für mehrere chirurgische Vorbereitungen verwenden
Puralube Vet AugensalbeDechra17033-211-38Hornhaut-Schutzsalbe zur Anwendung während des Eingriffs
Rimadyl (Caprofen)Zoetis, Inc.NADA# 141-199Injizierbare Form, 50 mg/ml
StereomikroskopLeicaModell M60Der Benutzer kann die Vergrößerung nach seinen Wünschen anpassen
Chirurgische Instrumente FineScience ToolsVerschiedenesDer Benutzer kann Instrumente nach persönlichen Vorlieben oder aus dem auswählen, was derzeit in seinem Labor verfügbar ist
Dreifache antibiotische SalbeMediChoice39892-0830-2Die Salbe wird in sterilen Einwegpackungen geliefert
VaporStick 3SurgivetV7015Anästhesieturm mit Platz für Isofluoran- und Sauerstoffkanister
Webcol Alcohol PrepCovidenRef 6818Alkohol-Vorbereitungstücher; verwenden Sie für jede Zubereitung ein neues Tuch

Referenzen

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