Summary
在此协议中，我们描述了定性和定量分析与先天性心脏缺陷相关的小鼠发育表型的程序。
Abstract
先天性心脏缺陷（CHD）是人类最常见的先天缺陷类型，影响多达1%的活产。然而，CHD的根本原因仍然缺乏理解。发育中的小鼠是研究CHD的宝贵模型，因为小鼠和人类之间的心脏发育程序高度保守。该协议详细介绍了如何产生所需妊娠阶段的小鼠胚胎、分离和保存心脏的方法，以及通过组织学识别常见CHD类型的定量方法（例如心室隔膜）缺陷、心房隔膜缺陷、专利导管动脉、定量通体测量方法，以测量常见的肌肉压实现象类型。这些方法阐明了样品制备、收集和分析所涉及的所有步骤，使科学家能够正确和repad测量CHD。
Introduction
CHD是人类最常见的先天缺陷类型，是出生缺陷相关死亡的主要原因1、2、3、4、5、6。虽然约90%的新生儿在CHD存活下来，但多年来经常与重大的发病率和医疗干预有关，给病人的生活和医疗系统带来沉重的负担。除了纯遗传因素外，CHD的病因还知之甚少。根据美国心脏协会和其他来源2、3、4、11，不明原因占所有CHD病例的56-66%。众所周知的因素包括基因突变、CNV、诺诺单核苷酸变异和阿非普肽。人们怀疑环境和饮食因素也是导致CHD的重要来源，流行病学研究表明，将母亲的生活方式2、12、经济剥夺和种族13联系起来，并通过研究饮食因素，如叶酸11，14和生物活性脂视网膜酸15，16。研究CHD和其他心血管缺陷的机制和原因，对于制定预防策略和新颖的治疗选择（1、4、17、18、19）非常重要。
发育中的小鼠是研究哺乳动物CHD的基石模型。然而，一些方法和分析，如解剖保存心脏形态，分析发育阶段，以及识别CHD相关缺陷，对于对分析鼠心的新科学家来说，可能令人望而生畏。该协议中描述的方法的目标是为这些流程提供定性和定量指南。因此，在此协议中，我们解释如何进行定时交配以产生所需妊娠阶段的胚胎，解剖怀孕的雌性，以恢复完整的心脏（包括相关组织，如流出道），心脏固定和准备冷冻切片，基本组学方法，常见心脏缺陷的定量分析，以及心肌压实的定性分析，是某些类型的CHD的常见前体表型。
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Protocol
本文引用的实验中使用的所有动物都使用密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的动物护理指南进行处理。
1. C57BL6/J小鼠用于胚胎生产的时配交配
- 一旦小鼠达到繁殖年龄（6-8周），将它们以兔子繁殖的形式（即，每只雄性两只雌性）放在一起。把它们安排在下午或晚上的某个时候繁殖。
注：老鼠通常在1小时内繁殖后，灯已经关闭在他们的住房设施内。雌性应在6-8个月左右从繁殖期退役，雄性应不迟于12个月大。 - 如果使用称重方法确定受精，则将小鼠成群繁殖，因为称重方法会导致定时交配以比仅监测交配塞的方法慢的速度进行。
- 第二天早上，检查在上午 8 点到 12 点之间的某个时间进行插电塞，确保在正确的时间完成。如果插头测定早于上午 8 点进行，则存在塞子在阴道管中太深无法观察到的风险。如果插头测定在 12 PM 之后执行，则存在插头脱落的风险。
- 抓住尾巴底部的雌性，并使用微移液笔尖研究阴道管的开口。交配插头看起来像粘膜屏障（图1A），在某些情况下可能很难看到。结壳性也表示存在或存在压接塞。如果没有粘膜屏障（图1B），那么女性很可能没有交配，或者交配塞可能已经脱落了。
- 将交配的早晨称为 e0.5。
注：使用 C57BL6/J 小鼠时，难以识别交配插头。因此，有时小鼠交配，即使没有观察到插头。交配并不总是导致受孕。这在C57BL6/J小鼠中通常更可能。因此，监测体重进展以确认怀孕（参见步骤1.4）。称重可以帮助识别怀孕的女性，并确认插头导致受孕。连续夜晚交配雌性时要小心。如果观察到特定男性善于产生交配插头，则该男性可以信任与同一雌性连续夜晚交配。 - 请记住，怀孕的机会更高，小鼠被证明是饲养者，因为他们已经成功地繁殖了之前。为了增加有经过验证的饲养者的机会，所使用的雄性不应太老。
- 按照插头测定，称量女性。这种称重应在 7-10 天后跟进。如果体重增加超过1.73克，那么老鼠很可能怀孕20。如果体重增加低于1.73克，很可能与怀孕无关，应该将小鼠重新引入繁殖种群。
注：C57BL6/J小鼠产生小垃圾（平均5至6个胚胎）。对于大多数来说，确定怀孕的方法是准确的。使用这种方法提供12.8%的假阳性率，将排除3%的女性，实际上怀孕20。如果研究人员担心所需的妊娠时间较晚，请继续步骤 1.5 - 可选：解剖进行当天，确保通过身体检查怀孕。抓住雌性尾巴的底，伸展身体。这是最简单的方法是把鼠标放在手腕上，轻轻拉起尾巴的底座。如果女性怀孕，那么在下躯干中可能会有体重增加，并且会出现小肿块。
注：怀孕最早可以明显到e12.5，在大多数情况下，e14.5可以明显。C57BL6/J小鼠的垃圾大小较小，因此即使没有身体体征，雌性老鼠也可能怀孕。
2. 女性和胚胎的解剖，促进心脏恢复
- 在开始解剖之前，在室温下准备以下解决方案。
- 以0.5 mM浓度将乙酰胺四乙酸 （EDTA） 溶解到磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
注：一旦准备好，最好将溶液保存在冰上，并且只在4°C下使用。如果污染是一个问题，应在使用前进行自生灭。 - 以4%的浓度将副甲醛（PFA）溶解到PBS中。
注：一旦准备好，最好将溶液保存在冰上，并且只在4°C下使用。储存在 4°C 或更冷处，以便长期存放。PFA 溶液的浓度可能因组织样品的下游应用而异。此百分比用于血氧林和肌素染色、免疫组织化学和免疫荧光染色。
- 以0.5 mM浓度将乙酰胺四乙酸 （EDTA） 溶解到磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
- 一旦雌性达到所需的妊娠阶段，应根据动物使用指南，在正确的时间对小鼠进行安乐死。如果时间是半天（例如 e15.5），则应在下午 12 点附近牺牲。如果时间是整个天（例如 e15.0），则应在上午 12 点附近牺牲。
注：假设在老鼠配对的晚上接近午夜时分。然而，很难确定受孕的确切时间。因此，估计时间，而不是确切的时间。 - 将四肢固定下来后，小心地沿着躯干做一个I形切口，从尿道周围开始向胸骨。
- 子宫可能位于骨盆区域的正上方。小鼠子宫呈Y形;因此，它可能会很长，包裹在躯干。轻轻抬起它将其拆下。在铲举运动中，使用细钳的侧面执行此操作。当最初拉出子宫时，子宫的表面组织可以非常小心地被细钳的尖端抓住。用剪刀把子宫从体内切开。
注：请记住子宫的异常 Y 形，确保切除整个子宫。 - 将子宫浸泡在冰冷的PBS中。将子宫的一端固定下来，并将其拉伸成一条线。
- 将子宫切成部分，每个部分包含一个单独的胚胎。用细钳子轻轻剥去胚胎。这是最简单的做每只手的一对钳子。取出后，立即将胚胎放入一个新的培养皿中，在4°C下充满PBS-EDTA溶液。
注：也可以使用正常的PBS溶液，但EDTA可防止样品中的凝固。 - 使用Theiler舞台21来植入胚胎。由于分期在单个垃圾中的胚胎之间可能有所不同，因此每个单独的胚胎都分期。
注：这也可以提供胚胎中可能存在先天性心脏缺陷的先见之明。通常，先天性心脏缺陷的症状可以在胚胎形态中观察到。通常与某些心脏状况相关的其他主要缺陷可能存在。 - 心脏可能以各种方式被切除，这取决于胚胎的年龄。
注：如果不清楚流出道在切除过程中是否完好无损，要么去除比心脏更多的组织（保持流出道完好无损，尽量减少心脏和钳子之间的直接接触），要么分析整个胚胎。- 使用解剖范围和两对细钳，将胚胎放在其背部，稳定进入胸部。这可以通过用钳子固定手臂或取出手臂并将躯干固定到位来实现。
- 使用第二对细钳的尖点沿胚胎胸腔进行切口，并在锁骨之间延伸到肚脐。开始做非常精细和肤浅的切口，同时逐渐工作到胸腔内侧。心脏应该几乎不能显现出来。在这些表面切口期间，不要与钳子接触。
- 用第一对钳子剥开肋骨笼，轻轻挤压胚胎的躯干，稍微向肋骨笼倾斜。心脏应该弹出或变得明显。心脏可能需要一些温柔的哄骗出来。使用钳子的一侧，确保钳子的点永远不会与心脏接触。为了保持工作空间并强制操作干净，请在附近保持无绒擦拭。
- 用钳子的侧面轻轻抓住肺血管，确保不切断组织，并将心脏从胸腔中拉出。然后，清洁心脏。
注：对于胚胎e13.5和更年轻，心脏被心外卡覆盖。为了到达心脏，必须删除这一点。
- 使用立体镜，拍摄心脏照片供以后参考。
- 在 PBS-EDTA 溶液中冲洗心脏 1-2 分钟，然后将其放入 4% PFA 溶液中约 45-60 分钟以修复它们。如果需要对整个胚胎进行分析，浸泡过夜。PFA 溶液的体积应为被固定组织的体积的 5-6 倍。
注：此孵育时间可能因以后的研究而异。此孵育时间用于血氧林和奥辛染色、免疫组织化学和免疫荧光染色。 - 用PBS-甘氨酸3倍清洗5-10分钟，然后放回PBS中。也可以添加阿齐德钠或青霉素/链霉素，以尽量减少细菌生长和保存完整的组织。心脏现在可以短期储存在4°C。
3. 组织准备
注：可以使用 OCT（最佳切割温度）嵌入或石蜡嵌入来制备组织。两种方法都有优缺点，在决定应使用哪种嵌入方法时，应考虑分析的目标。
- OCT 嵌入
注：此方法可能比形式素/石蜡嵌入更可取，因为低温截面可保持抗原反应性，仍可用于血氧林和欧辛染色，并更快地生成切片。- 以 30% （w/v） 浓度准备溶解到 PBS 中的蔗糖溶液。
- 将组织转移到新的 15 mL 锥形管或包含 PBS-30% 蔗糖的 1.5 mL 微离心管。最初，组织会漂浮。
- 将其放在冰箱中的 4°C。当组织沉入管底时，通常为 24-40 小时，即可进行 OCT 嵌入。
注：肌肉组织在冻结/解冻周期期间显著受损，并失去其原生形态。蔗糖被组织吸收，并作为冷冻保存剂，可以改善形态的保存。确保管中有足够的溶液，以便对组织的浮动进行充分监控。PBS-蔗糖很容易被细菌污染，因此经常检查溶液的云性，这表明真菌或细菌过度生长。为了将污染风险降至最低，可以将青霉素/链霉素或阿齐德钠添加到PBS-蔗糖溶液中。 - 用巴斯德移液器取出心脏，确保移液器的开口足够宽，不会撕裂组织。如有必要，用剪刀切割移液器。如果使用整个胚胎，请使用钳子取回样本。
注：请轻轻执行此操作。即使移液器开口足够宽，可以取回心脏，移液器的边缘仍然可以撕裂组织。如果使用过于积极，钳子可以缩进组织样本。 - 在无绒抹布上短暂让组织空气干燥。将样品置于 OCT 模具中，处于切割所需的位置（即，下垂、横向、日冕）。加入OCT化合物，直到样品完全浸没，确保没有气泡与组织接触。
- 将模具置于 -20°C 过夜或数天，然后将模具移至-80°C。24 小时后，模具已准备好进行冷冻解剖。这种格式的组织可以长期存储。
- 石蜡嵌入
- 使用乙醇，在接续中脱水组织：50%乙醇10分钟，70%乙醇10分钟，80%乙醇10分钟，95%乙醇10分钟，100%乙醇10分钟（做这3倍）。
- 连续将组织浸泡在一系列乙醇/二甲苯溶液中：2：1 乙醇/二甲苯溶液，10-15 分钟，1：1 乙醇/二甲苯溶液 10-15 分钟，1：2 乙醇/二甲苯溶液 10-15 分钟，10-15 分钟（此 3 倍）的 100% 二甲苯溶液。
- 要用石蜡替换二甲苯， 将组织浸泡在真空烤箱中（设置在 54-58 °C 之间）依次为：2：1 二甲苯/石蜡溶液 30 分钟，1：1 二甲苯/石蜡溶液 30 分钟，1：2 二甲苯/石蜡溶液 30 分钟，100% 石蜡，1-2 小时或过夜。
注：长时间将组织加热到60°C以外会导致石蜡聚合物降解，组织变脆。 - 使用新鲜的石蜡，将组织嵌入到所需位置。
4. OCT 嵌入式组织的冷冻切片
- 在低温塔，如果样品以前存放在-80°C冰柜中，则将所有样品放入内部至少1小时。它们应保留在那里，直到收集所有章节。
- 确保低温器设置在正确的温度设置。冷冻室内的环境温度应在-20°C左右，冷冻室的手臂应在-24°C左右。
注： 此温度可能因块响应切片的方式而异。如果切片不一致是一个问题，则环境温度可能会降低。 - 通过在模具的开边边缘拉开，然后挤压紧闭端的块（模具变窄），将 OCT 块从模具上拆下。
- 要安装 OCT 块，请将室温 OCT 放在夹头上，从中间开始，一向边缘工作。整个夹头不需要覆盖。
- 将 OCT 块（参见步骤 3.1）放在模具上。与模具闭合侧的块边缘应朝上夹头。让夹头上的 OCT 冻结，直到它不透明的白色，大约 5-10 分钟。
- 将夹头放在手臂上再放置 5-10 分钟，使块进入臂温。要获得平行切片，请调整臂部，直到块的边缘与舞台平行，并且舞台与块的下边缘之间的距离与块的阶段和上边缘相同。
- 插入刀片并调整块与刀片的距离以进行切片。
- 以 10 μm 的厚度切片。保持切片，直到手动或使用修剪功能达到兴趣点。
- 要收集切片，请使用小型平面画笔和细节画笔。当模具开始切割时，使用平刷轻轻将切片拉靠在支架上。在切割样品时，移动必须是连续的，并且没有暂停，尽管速度取决于样品的牢固性。
- 切片时，使用平刷轻轻引导切片。此时，切片不需要与舞台齐平，因此允许其滚滚，以免引起眼泪或拉力，影响其学。
注：切片整个胚胎时，这部分可能特别困难，尤其是在改变组织类型时。确保切片没有暂停，并且画笔不会太用力地拉取切片。当组织类型发生变化时，切片会断裂，因此保持温度变冷是关键。如果断裂是一个问题，降低温度或增加样品的厚度。 - 一旦样本完全切开，暂停块的移动，但切片尚未从块中释放。在不从切片中移动平面画笔的情况下，使用细节画笔将切片拍下来，使其平放并冻结在平面上。
- 在删除细节画笔并完成切片之前，将切片保持 10 秒。使用两个画笔将切片轻轻平平，防止任何滚动，并将其与舞台固定，为 ±20-30 s。
- 翻转切片并再次与舞台平展。将静电带的幻灯片移得足够近，以便吸引切片并粘附在幻灯片上，而无需触摸幻灯片到舞台。用铅笔标记幻灯片。
- 将幻灯片存放在密封的包装盒中，以保护组织在储存过程中免受结冰的影响。对于短期存储，在染色前，幻灯片应存放在 -20°C。对于长期存储，请将其保持在 -80°C。
5. 石蜡嵌入式组织的微托姆切片
- 在切片前将块放在冰上，以便冷却样品。冷却时，石蜡片更容易，可以产生更薄的切片。
- 使用超纯水准备40-45°C水浴。
- 将刀片放入微缩内支架中。确保其安全，然后设置间隙角度。确保间隙角度正确。可以按照制造商的说明检查。
- 将石蜡块放入微缩体中。确保它的方向正确，以便刀片将直切穿过块。
- 通过制作几个切片，确保刀片与块正确定向。请仔细执行此操作，以便进行调整。
- 修剪块，直到达到兴趣点。
- 以所需的厚度制作切片。考虑到前几个切片可能会被丢弃。
- 拿起部分，用钳子将它们移到水浴中。这应该使节展平。根据需要使用钳子进行调整。
- 将静电带的幻灯片移得足够近，以便吸引切片并粘附在幻灯片上。用铅笔标记幻灯片。
- 将所有收集的幻灯片放入幻灯片架中。让幻灯片在 37 °C 下干燥过夜。
6. 组织去石蜡化
- 按以下顺序清洗幻灯片：20%分3分钟，1：1二甲苯/100%乙醇溶液3分钟，100%乙醇（2x）3分钟，95%乙醇3分钟，乙醇3分钟，乙醇3分钟。
7. 赫马托西林和欧辛染色
- 准备幻灯片进行染色。
- 如果使用 OCT 准备组织，浸泡在蒸馏水中约 4 分钟，直到 OCT 溶解并晾干。
- 如果使用石蜡嵌入组织，则必须去石蜡。请参阅步骤 6.1。
- 将滑块放入过滤后的 0.1% 血氧林中 10 分钟。将滑块放入蒸馏水中，立即更换水 1x，3 分钟后再次更换。
- 将幻灯片放入 0.5% eosin 中，10 s 或浸 12 倍。将滑道浸入蒸馏水中，直到 eosin 不再条纹，约 2-3 次下降。
- 通过浸泡在50%乙醇10s，75%乙醇10秒，95%乙醇30秒，100%乙醇1分钟脱水滑水。在二甲苯中滴，直到二甲苯顺利出来，±5-7下降。
- 允许二甲苯蒸发和安装与快速干燥安装介质，具有折射率接近玻璃。
8. 常见心脏缺陷的定性分析
- 使用倒置或立体显微镜及其相应的相机拍摄所有样品的图像。根据所分析的缺陷类型，拍摄宏观和微观图像。宏观图像的放大倍率低于 10 倍。显微图像的放大倍率应为 40 倍或更高。本文拍摄的照片采用立体显微镜和40倍空气目标（镜头N.A.0.55）使用倒置显微镜，放大5倍。
注：宏观图像是一个很好的起点，因为它们提供了整个心脏的视图（图3）。随着模式的确定，可以关注和进一步调查特定领域。 - 在计算机屏幕上并排排列所有图像。将控制样本的所有图像放在屏幕的一侧，并在屏幕的另一侧显示实验样本的所有图像。最好一次分析一个治疗组。
- 从发生常见心脏缺陷的关键区域开始，寻找治疗组之间表型的差异。这取决于图像是宏观的，它描绘了心脏的毛解剖学，还是微观的，它描绘了心脏组织的微观解剖。
- 开始寻找常见的宏观心脏缺陷，如心室隔膜缺陷（图2A）、心房隔膜缺陷（图2B）和专利导管动脉（图2C）。所有这些缺陷在心脏的横向视图中最容易看到。
- 要识别隔膜缺陷，请考虑查看多个切片，因为它们可能在组织的一个平面上观察到，而不是另一个平面中观察到。
注：有时缺陷不是缺少隔膜，而是隔膜上的一个洞。因此，注意不要误认为撕裂为隔膜缺陷。在特定区域中查找附近切片之间的一致性可以确认这实际上是一个缺陷还是切片产生的撕裂。 - 要识别流出道的缺陷，如专利导管动脉，使用多片跟随主要血管离开心脏。创建主要血管相对于彼此的图像。图 2C中包括一个示例。
注：一些不规则可能是由于胚胎的发育阶段（例如，早产的专利在出生后不久结束;心室隔膜直到[e14.5]才完全关闭）。其他一些常见的宏性心脏缺陷，不包括在数字中包括持续截流，这是最容易检测在e16.5和更高版本;双出口右心室（DORV），可在心脏进入流出道的切片中检测;和一个压倒一切的大田22。常见的显微心脏缺陷包括减少肌肉压实（图4）。
9. 使用血氧林和肌素染色组织对心肌压实的定量分析
- 使用染色组织样本的宏观视图（图 4A），以 40 倍的放大倍数标识图像感兴趣的区域（图 4B）。在本文中，使用了左心室的壁。以所需的格式保存图像。在本文中，图像被保存为 .tif 文件。
- 打开 ImageJ 软件中的图像。
- 将图像设置为 8 位。这允许图像在下一步23，24中利用阈值工具。为此，请选择"图像|类型 |8 位"
- 设置照片的阈值。此步骤的目的是仅选择表示背景的像素，不包括表示组织23、24的像素。
注： 稍后将减去此表面积。正确的阈值将选择研究人员希望从肌肉组织表面区域排除的像素。因此，结束结果应包括灰度组织，并选择背景。- 点击"ImageJ |图片 |调整 |阈值"移动顶部条形进行阈值调整。在选择所需节21后，关闭阈值调整窗口，无需进行任何任何其他更改。
- 使用"多边形选择"工具选择组织占用的空间。小心确保轮廓跟踪组织边界，因为松散的跟踪将提供错误的测量。
- 调整 ImageJ 上的测量设置，以便软件仅测量步骤 9.423中使用阈值工具选择的像素区域。"图片J |分析 |设置测量值 |区域和阈值限制"。仅选择"区域"和"阈值限制"。
- 测量突出显示的像素区域。"图片J |分析 |度量"此值表示负空格的面积。
- 测量整个感兴趣区域的区域。这是使用"多边形选择"工具选择的区域。"图片 J |分析 |设置测量值 |区域"选择"仅区域"并取消选择"阈值限制"。然后测量，选择"图像 J |分析 |度量"
- 计算实际肌肉组织在感兴趣区域内占用的区域。从整个感兴趣区域的面积中减去负空间的面积。此值是肌肉组织的区域。
- 计算肌肉压实指数 （MCI）。将肌肉组织区域除以感兴趣的区域。
MCI 值越大，肌肉越压实。然后，这些MCI值可用于统计分析，以测试治疗组之间的肌肉压实的显著变化（图4C）。
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Representative Results
肌肉压实指数在两种不同环境下发育的心脏（对照组和实验组）之间进行了比较。这些协议用于定量分析肌肉组织的压实，从而允许进行统计分析。与在非实验条件下发育的胚胎相比，实验心脏的肌肉压实作用显著减少。
如果观察时间似乎不准确，胚胎就被丢弃了。虽然胚胎发育迟缓可能是实验治疗的结果，而且发育进展也十分广泛，但育种空间已经足够，以确保胚胎发育的时机。胚胎的分期是使用Theiler分期21完成的。如果切片没有反映一致性，或者它们有明显的撕裂或褶皱，则样本被认为切片不良。染色提供了足够的对比度来辨认组织边缘，但不是那么暗，使细胞特征无法区分。然后用倒置显微镜成像幻灯片，目标为 40 倍。MCI 值是使用 ImageJ 软件和 Microsoft Excel 计算的。使用 T 检验对这些 MCI 值进行了分析。
图 1：在 C57BL6/J 小鼠中插入测定结果。（A） 带有易于识别的插拔插头的鼠标。（B） 没有插电塞的鼠标。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：常见的心脏缺陷。先天性心脏缺陷真实预期形态的原理图。（A） 心室隔膜缺陷的横向视图。（B） 心房隔膜缺陷的横向视图。（C） 专利导管动脉。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：e15.5心脏的赫马托西林和欧辛染色。（A） 在正常条件下发育的染色心脏.刻度杆 = 750 μm. （B） 在实验条件下发育的染色心脏.比例尺 = 750 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图4：在正常产妇饮食下发展起来的心脏之间的肌肉压实的定量分析，以及在必需脂肪酸缺乏的产妇饮食下发展的心脏。（A） 赫他西林和欧辛在宏观 （5x） 视图中染色了心脏。刻度杆 = 1，000 μm. （B） 血氧林和欧辛染色心脏在微观视图 （40x）。刻度柱 = 75 μm. （C） 肌肉压实指数测量的结果数据。使用 T 测试对值进行分析（每个治疗组 4 个）。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
该协议探讨了胚胎心脏发育分析所涉及的技术。这种方法的一些局限性是准备技术所需的物理灵巧性，这可能需要练习，以及显微镜成像技术。如果在低温塔获得的切片是凌乱的，血氧林和欧辛染色将不清楚，或者如果在显微镜上拍摄的图像照明不良，则与 ImageJ 一起使用的方法将不起作用。ImageJ 软件的阈值功能的一个限制是它选择位于阈值一端的像素，具体取决于像素值。因此，在计算中错误地包含或排除阈值错误一侧的任何像素。最终，故障排除对于采用用于研究的协议是必要的。
如果心脏提取太困难，请考虑跳至步骤 2.8。此外，考虑从胸腔中取出的不仅仅是心脏和肺。然后，目标变得更大，更容易操作，心脏和细钳之间的直接接触最小化。当冷冻切片时，实验样品将始终直接与对照样品进行比较。只要所有示例中的错误一致，就可以为用户错误留出一些空间。为了尽量减少用户错误并避免错误结果，请确保从两个治疗组获得可比的部分。例如，如果多个人员正在生成节，请确保一个人为控件和所有治疗组生成偶数节，而不仅仅是一个子组。最后，在 ImageJ 上为图像进行阈值时，使用阈值工具允许在选择表示不表示的组织和像素的像素时获得最大自由。如有必要，调整图像的对比度，以进一步强化背景的像素值，从组织的像素值。尽管存在故障排除选项，但这些技术仍需要高度的技能。然而，执行此协议提供了对数据的访问，这些数据通常在其他心脏发育研究中是未测量的。因此，利用本议定书的特点可能对科学调查作出重大贡献。
通过形态学评估，经常研究实验治疗在心脏病学研究中的影响。在发育生物学中尤其如此，胎盘使得发育心脏的生理特征难以被测量。因此，形态分析，允许洞察心脏的功能，戏剧性地改变了发育生物学研究的轨迹。虽然大多数论文分析心脏肌肉的厚度，以确定心脏的强度，直接测量肌肉压实可以提供进一步洞察发育中的哺乳动物心脏25，26，27的生理学。
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Disclosures
提交人没有披露报告。
Acknowledgments
阿吉雷实验室由美国国家卫生研究院国家心肺血液研究所支持，奖励编号为K01HL135464，美国心脏协会奖励编号为19IPLOI34660342。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
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