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Developmental Biology

गुणात्मक और मात्रात्मक हिस्टोलॉजिकल तरीकों का उपयोग कर माउस भ्रूण में जन्मजात हृदय दोषों का विश्लेषण

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60926
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Institute for Quantitative Health Sciences and Engineering, Michigan State University

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम जन्मजात हृदय दोषों से जुड़े चूहों में विकासात्मक फेनोटाइप का गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण करने की प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं।

Abstract

जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) मनुष्यों में जन्म दोष का सबसे आम प्रकार है, जो सभी जीवित जन्मों का 1% तक प्रभावित करता है। हालांकि, CHD के लिए अंतर्निहित कारणों को अभी भी खराब समझा जाता है । विकासशील माउस CHD के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल का गठन करता है, क्योंकि चूहों और मनुष्यों के बीच हृदय विकासात्मक कार्यक्रम अत्यधिक संरक्षित हैं। प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन करता है कि वांछित गर्भावधि चरण के माउस भ्रूण का उत्पादन कैसे करें, डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए दिल को अलग करने और संरक्षित करने के तरीके, हिस्टोलॉजी द्वारा सामान्य प्रकार के सीएचडी की पहचान करने के लिए मात्रात्मक तरीके (उदाहरण के लिए, वेंट्रिकुलर सेप्टल आम मांसपेशियों के कॉम्पैक्टेशन फेनोटाइप को मापने के लिए दोष, एट्रियल सेप्टल दोष, पेटेंट डक्टस आर्टेरियोसस), और मात्रात्मक हिस्टोमॉहोमी विधियां। ये तरीके नमूना तैयारी, संग्रह और विश्लेषण में शामिल सभी चरणों को स्पष्ट करते हैं, जिससे वैज्ञानिकों को सही ढंग से और पुन: उत्पादन करने की अनुमति मिलती है।

Introduction

सीएचडी मनुष्यों में जन्म दोष का सबसे आम प्रकार है और जन्म दोष से संबंधित मृत्यु का प्रमुख कारण1,2,3,4,5,6हैं । हालांकि नवजात बच्चों के बारे में ९०% CHD जीवित रहते हैं, यह अक्सर महत्वपूर्ण रुग्णता और पिछले कुछ वर्षों में चिकित्सा हस्तक्षेप के साथ जुड़ा हुआ है, रोगियों के जीवन और स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली7,8,9,10पर भारी बोझ थोप । विशुद्ध रूप से आनुवंशिक कारकों के बाहर, CHD के कारणों को खराब4समझा जाता है । अमेरिकन हार्टएसोसिएशन और अन्य स्रोतों2,3,4,11के अनुसार सभी सीएचडी मामलों के ~ 56-66% के लिए अज्ञात कारण खाते । प्रसिद्ध कारकों में आनुवंशिक उत्परिवर्तन, सीएनवी, डी नोवो एकल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट और एन्यूप्लाइडी शामिल हैं। यह संदेह है कि पर्यावरण और आहार कारक भी सीएचडी में योगदान देने वाले महत्वपूर्ण स्रोत हैं, जैसा कि मातृ जीवन शैली2,12,आर्थिक अभाव और रेस13को जोड़ने वाले महामारी विज्ञान के अध्ययनों द्वारा सुझाव दिया गया है, और फोलिक एसिड11,14 और बायोएक्टिव लिपिड रेटिनोइक एसिड15,16जैसे आहार कारकों में अनुसंधान द्वारा । सीएचडी और अन्य हृदय दोषों के तंत्र ों और कारणों की जांच करना निवारक रणनीतियों और उपन्यास चिकित्सीय विकल्प1,4,17,18,19विकसित करना महत्वपूर्ण है ।

विकासशील माउस स्तनधारियों में CHD का अध्ययन करने के लिए एक आधारशिला मॉडल है। हालांकि, नियोजित कुछ तरीकों और विश्लेषणों, जैसे हृदय आकृति विज्ञान के संरक्षण, विकासात्मक चरणों का विश्लेषण, और सीसीडी से जुड़े दोषों की पहचान, वैज्ञानिकों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है जो मूत्र दिलों के विश्लेषण के लिए नए हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का लक्ष्य इन प्रक्रियाओं के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक दिशानिर्देश प्रदान करना है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में हम समझाते हैं कि वांछित गर्भावधि चरण के भ्रूण का उत्पादन करने के लिए समय पर संभोग कैसे करें, गर्भवती महिलाओं को बरकरार दिल की वसूली के लिए विच्छेदन करें (बहिर्वाह पथ जैसे संबद्ध ऊतकों सहित), हृदय निर्धारण और तैयारी के लिए क्रायोस्टेट सेक्शनिंग, बुनियादी हिस्टोलॉजी विधियां, आम हृदय दोषों का मात्रात्मक विश्लेषण, और हृदय की मांसपेशियों के कॉम्पैक्टेशन का गुणात्मक विश्लेषण, कुछ प्रकार के सीएचडी के लिए एक आम अग्रदूत फेनोटाइप।

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Protocol

इस पेपर में संदर्भित प्रयोगों में इस्तेमाल किए गए सभी जानवरों को मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) के एनिमल केयर गाइडलाइंस का इस्तेमाल करइलाज किया गया ।

1. भ्रूण उत्पादन के लिए C57BL6/J चूहों का समय पर संभोग

  1. एक बार चूहों प्रजनन आयु (6-8 सप्ताह) तक पहुंच जाने के बाद, उन्हें हरम प्रजनन प्रारूप (यानी, प्रति एक पुरुष दो मादाओं) में एक साथ रखा जाता है। उन्हें दोपहर या शाम को कुछ समय प्रजनन के लिए स्थापित करें।
    नोट: चूहों अक्सर 1 घंटे के भीतर नस्ल के बाद रोशनी उनके आवास सुविधा के भीतर बंद कर दिया गया है । महिलाओं को लगभग 6-8 महीने में प्रजनन से सेवानिवृत्त किया जाना चाहिए और पुरुषों का उपयोग 12 महीने की उम्र से बाद में नहीं किया जाना चाहिए।
  2. यदि निषेचन का निर्धारण करने के लिए वजन-इन विधि का उपयोग करते हैं, तो बड़े समूहों में चूहों को नस्ल, क्योंकि वजन-विधि उन तरीकों की तुलना में धीमी गति से आगे बढ़ने के लिए समय पर संभोग का कारण बनती है जिसमें केवल मैथुन प्लग की निगरानी की जाती है।
  3. अगली सुबह 8 AM-12 PM के बीच कुछ समय मैथुन प्लग की जांच करें । सुनिश्चित करें कि यह सही समय पर किया जाता है । यदि प्लग परख 8 बजे से पहले किया जाता है, तो एक जोखिम है कि प्लग योनि नहर में बहुत गहरा है मनाया जाना है। यदि प्लग परख बाद में 12 बजे से किया जाता है, वहां प्लग बाहर गिर होने का खतरा है ।
    1. पूंछ के आधार से मादा को पकड़ो और माइक्रोपाइपेट टिप के उपयोग के साथ योनि नहर को खोलने की जांच करें। एक मैथुन प्लग एक म्यूकोसल बाधा(चित्रा 1ए)की तरह दिखेगा, जिसे कुछ मामलों में देखना थोड़ा मुश्किल हो सकता है। क्रस्टनेस भी एक संकेत है कि एक मैथुन प्लग है या मौजूद था। यदि कोई म्यूकोसल बाधा नहीं है(चित्रा 1बी)तो महिला की संभावना संभोग नहीं किया है या मैथुन प्लग पहले से ही बाहर गिर सकता है ।
    2. शयन की सुबह को e0.5 के रूप में देखें।
      नोट: C57BL6/J चूहों के साथ, मैथुन प्लग की पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है । इसलिए, कभी-कभी चूहों को कोई प्लग नहीं देखा गया था, भले ही चूहों को मिलाया गया था। मैथुन हमेशा गर्भधारण करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है। यह अक्सर C57BL6/J चूहों में अधिक होने की संभावना है । इसलिए, गर्भावस्था की पुष्टि करने के लिए वजन प्रगति की निगरानी करें (चरण 1.4 देखें)। वजन ins उन महिलाओं की पहचान करने में मदद कर सकता है जो गर्भवती हैं और पुष्टि करसकती हैं कि प्लग गर्भाधान के लिए नेतृत्व करते हैं। लगातार रातों तक महिलाओं का संभोग करते समय सावधानी बरतें। यदि किसी विशेष पुरुष को शयन प्लग बनाने में अच्छा मनाया जाता है, तो उस पुरुष को एक ही मादा के साथ लगातार रातों तक दोस्त पर भरोसा किया जा सकता है।
    3. ध्यान रखें कि गर्भावस्था की संभावना चूहों के साथ अधिक होती है जो प्रजनक साबित होते हैं, क्योंकि वे सफलतापूर्वक पहले पैदा हुए हैं। सिद्ध प्रजनक होने की संभावना को बढ़ाने के लिए, उपयोग किए जाने वाले पुरुषों को बहुत पुराना नहीं होना चाहिए।
  4. प्लग परख के बाद, महिलाओं का वजन करें। इस वजन को 7-10 दिन बाद फॉलो करना चाहिए। यदि वजन 1.73 ग्राम से अधिक है, तो माउस20गर्भवती होने की संभावना है। यदि वजन 1.73 ग्राम से नीचे है, तो यह गर्भावस्था से असंबंधित होने की संभावना है और माउस को प्रजनन आबादी में फिर से पेश किया जाना चाहिए।
    नोट: C57BL6/J चूहों छोटे कूड़े का उत्पादन (औसतपर पांच से छह भ्रूण) । गर्भावस्था निर्धारित करने के तरीकों में वजन बहुमत के लिए सटीक हैं। इस विधि का उपयोग करने से 12.8% झूठी सकारात्मक दर मिलती है और 3% महिलाओं को बाहर कर दिया जाएगा जो वास्तव में20गर्भवती हैं। यदि शोधकर्ता चिंतित है कि वांछित गर्भावधि समय बाद में है, १.५ कदम के लिए आगे बढ़ें
  5. वैकल्पिक: जिस दिन विच्छेदन होने जा रहा है, यह सुनिश्चित करें कि गर्भावस्था शारीरिक निरीक्षण द्वारा प्रगति की है। पूंछ के आधार से मादा को पकड़ो और शरीर को बाहर निकालें। यह कलाई पर माउस रखकर और धीरे-धीरे पूंछ के आधार को खींचकर करना सबसे आसान है। यदि मादा गर्भवती है, तो संभावना है कि विशेष रूप से निचले धड़ में वजन बढ़ेगा, और यह छोटे गांठ के रूप में दिखाई देगा।
    नोट: गर्भावस्था e12.5 के रूप में जल्दी के रूप में स्पष्ट किया जा सकता है और ज्यादातर मामलों में e14.5 से स्पष्ट हो जाएगा । C57BL6/J चूहों छोटे कूड़े के आकार है, इसलिए महिला गर्भवती हो सकती है भले ही वहां कोई शारीरिक संकेत कर रहे हैं ।

2. हृदय वसूली के लिए महिलाओं और भ्रूण का विच्छेदन

  1. विच्छेदन की शुरुआत से पहले, कमरे के तापमान पर निम्नलिखित समाधान तैयार करें।
    1. 0.5 एमएम एकाग्रता पर एस्थेलीनडाययामिनेटेट्रासेटिक एसिड (ईटीए) को फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) में भंग करें।
      नोट: एक बार तैयार होने के बाद, बर्फ पर समाधान रखना बेहतर है और केवल 4 डिग्री सेल्सियस पर इसका उपयोग करें। यदि संदूषण चिंता का विषय है, तो उपयोग करने से पहले इसे स्वचालित किया जाना चाहिए।
    2. पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) को 4% एकाग्रता पर पीबीएस में भंग करें।
      नोट: एक बार तैयार होने के बाद, बर्फ पर समाधान रखना बेहतर है और केवल 4 डिग्री सेल्सियस पर इसका उपयोग करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या ठंडा पर स्टोर करें। पीएफए समाधान की एकाग्रता ऊतक नमूनों के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के आधार पर भिन्न हो सकती है। इस प्रतिशत का उपयोग हेमैटोक्सीलिन और इओसिन धुंधला, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के लिए किया जाता है।
  2. एक बार मादा वांछित गर्भावधि चरण में पहुंच जाती है, तो जानवरों के उपयोग के अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार माउस को दिन के सही समय पर इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए। यदि समय आधे दिन (जैसे, e15.5) पर हैं तो उन्हें 12 बजे के करीब बलिदान दिया जाना चाहिए । यदि समय पूरे दिन (जैसे, e15.0) पर हैं तो उन्हें 12 बजे के करीब बलिदान दिया जाना चाहिए।
    नोट: गर्भाधान रात के दौरान आधी रात के पास होने के लिए चूहों बनती है ग्रहण किया जाता है । हालांकि गर्भधारण का सही समय तय करना मुश्किल है। इस कारण टाइमिंग का अनुमान लगाया जाता है, सही नहीं।
  3. चार अंगों को नीचे रखने के बाद, सावधानी से धड़ के साथ एक I-आकार का चीरा बनाएं, मूत्रमार्ग के चारों ओर से शुरू होकर उरोस्थि की ओर।
  4. गर्भाशय की संभावना श्रोणि क्षेत्र के ठीक ऊपर स्थित होगी। माउस गर्भाशय वाई के आकार का है; इसलिए, यह बहुत लंबा होगा और धड़ के चारों ओर लपेटा जाएगा। इसे धीरे-धीरे उठाकर निकालें। एक स्कूपिंग गति में ठीक संदंश के पक्षों का उपयोग करके ऐसा करें। गर्भाशय के सतही ऊतकों को शुरू में गर्भाशय को बाहर निकालते समय ठीक संदंश के सुझावों से बहुत सावधानी से पकड़ा जा सकता है। शरीर से गर्भाशय काटने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
    नोट: गर्भाशय के असामान्य वाई-आकार को ध्यान में रखते हुए, सुनिश्चित करें कि पूरे गर्भाशय को हटा दिया गया है।
  5. गर्भाशय को बर्फ-ठंडे पीबीएस में भिगो दें। गर्भाशय के एक छोर को नीचे पिन करें और इसे एक ही पंक्ति में फैलाएं।
  6. गर्भाशय को वर्गों में काट लें, प्रत्येक खंड जिसमें एक अलग भ्रूण होता है। धीरे-धीरे भ्रूण को ठीक संदंश के साथ छील लें। यह प्रत्येक हाथ में संदंश की एक जोड़ी के साथ करना सबसे आसान है। एक बार निकाले जाने के बाद, भ्रूण को तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस-ईटीए समाधान से भरे एक नए पेट्री डिश में रखें।
    नोट: सामान्य पीबीएस समाधान का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन ईटीए नमूनों में जमाव को रोकता है।
  7. 21 Theiler मचानका उपयोग कर भ्रूण मंच । क्योंकि मचान एक ही कूड़े के भीतर भ्रूण के बीच भिन्न हो सकते हैं, प्रत्येक व्यक्ति भ्रूण मंच ।
    नोट: यह भी भ्रूण में संभावित जन्मजात हृदय दोषों में दूरदर्शिता प्रदान कर सकते हैं । आमतौर पर, भ्रूणीय आकृति विज्ञान में जन्मजात हृदय दोष के लक्षण देखे जा सकते हैं। अक्सर कुछ दिल की स्थितियों से जुड़े अन्य प्रमुख दोष मौजूद हो सकते हैं।
  8. भ्रूण की उम्र के आधार पर दिल को कई तरह से हटाया जा सकता है।
    नोट: यदि यह स्पष्ट नहीं है या नहीं बहिर्वाह पथ हटाने के दौरान बरकरार रहेगा, या तो पूरी तरह से दिल से अधिक ऊतकों को हटा (बहिर्वाह पथ बरकरार रखने और दिल और संदंश के बीच सीधे संपर्क को कम करने) या पूरे भ्रूण का विश्लेषण ।
    1. एक विच्छेदन गुंजाइश और ठीक संदंश के दो जोड़े का उपयोग करना, अपनी पीठ पर भ्रूण की स्थिति और छाती तक पहुंच को स्थिर । यह या तो हथियारों को संदंश के साथ नीचे लगाए या हथियारों को हटाने और धड़ को स्थिति में पकड़कर किया जा सकता है।
    2. भ्रूण के उरोस्थि के साथ चीरा बनाने और नाभि के लिए clavicles के बीच विस्तार करने के लिए ठीक संदंश की एक दूसरी जोड़ी के तेज बिंदु का प्रयोग करें । धीरे-धीरे छाती गुहा के अंदर की ओर काम करते हुए बहुत ठीक और सतही चीरे बनाकर शुरू करें। दिल बस बमुश्किल दिखाई देना चाहिए। इन सतही चीरों के दौरान संदंश के साथ संपर्क न करें।
    3. रिब पिंजरे को धीरे से भ्रूण के धड़ पर निचोड़ने के लिए संदंश की पहली जोड़ी का उपयोग करके खुला पसली पिंजरे छीलें, रिब पिंजरे में थोड़ा कौडल। दिल को बाहर पॉप करना चाहिए या स्पष्ट हो जाना चाहिए। दिल को बाहर आने के लिए कुछ कोमल मनाना की आवश्यकता हो सकती है। संदंश के पक्ष का उपयोग करें, सुनिश्चित करें कि संदंश की बात दिल के संपर्क में कभी नहीं आता है। कार्यक्षेत्र और संदंश को साफ रखने के लिए, पास में एक लिंट-मुक्त पोंछ रखें।
    4. धीरे-धीरे संदंश के किनारों के साथ फेफड़े की रक्त वाहिकाओं को पकड़ो, जिससे ऊतक को न तोड़ना सुनिश्चित हो सके, और दिल को छाती गुहा से बाहर निकालें। इसके बाद दिल की सफाई करें।
      नोट: भ्रूण e13.5 और छोटे दिल के लिए पेरिकार्डियम द्वारा कवर किया जाता है । दिल तक पहुंचने के लिए इसे हटाया जाना चाहिए।
  9. एक स्टीरियोस्कोप का उपयोग करना, बाद में संदर्भ के लिए दिल की एक तस्वीर ले लो।
  10. 1-2 मिन के लिए पीबीएस-EDTA समाधान में दिलों को कुल्ला, और फिर उन्हें ठीक करने के लिए लगभग 45-60 मिन के लिए 4% पीएफए समाधान में जगह है। यदि पूरे भ्रूण का विश्लेषण वांछित है, तो रात भर भिगो एं। पीएफए समाधान की मात्रा 5-6x ऊतक की मात्रा तय की जा रही होनी चाहिए।
    नोट: यह ऊष्मायन समय बाद के अध्ययनों के आधार पर भिन्न हो सकता है। इस ऊष्मायन समय का उपयोग हेमेटिक्सलिन और इओसिन धुंधला, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला करने के लिए किया जाता है।
  11. पीबीएस-ग्लाइसिन 3x के साथ 5-10 टिन धोएं और पीबीएस में वापस रखें। बैक्टीरियल ग्रोथ को कम करने और बरकरार ऊतकों को संरक्षित करने के लिए सोडियम एजाइड या पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन भी जोड़ा जा सकता है । दिलों को अब 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्पकालिक संग्रहीत किया जा सकता है।

3. ऊतक तैयारी

नोट: ऊतकों को या तो OCT (इष्टतम काटने का तापमान) एम्बेडिंग या पैराफिन एम्बेडिंग का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है। किसी भी विधि के फायदे और नुकसान हैं और विश्लेषण के लक्ष्य पर विचार किया जाना चाहिए कि कौन सी एम्बेडिंग विधि का उपयोग किया जाना चाहिए।

  1. OCT एम्बेडिंग
    नोट: यह विधि फॉर्मेलिन/पैराफिन एम्बेडिंग के लिए बेहतर हो सकती है क्योंकि क्रायोसेक्शन एंटीजन प्रतिक्रियाशीलता को संरक्षित करते हैं, अभी भी हेमैटोक्सिलिन और इओसिन धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और स्लाइस को तेजी से उत्पादन करते हैं ।
    1. 30% (w/v) एकाग्रता पर पीबीएस में भंग सुक्रोज का समाधान तैयार करें।
    2. ऊतकों को एक नई 15 mL शंकुट्यूब या पीबीएस-30% सुक्रोज युक्त 1.5 एमएल माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। शुरू में टिश्यू फ्लोट होंगे।
    3. इसे फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। ऊतक OCT एम्बेडिंग के लिए तैयार हो जाएगा जब यह ट्यूब के नीचे तक डूब जाता है, आमतौर पर 24-40 घंटे में ।
      नोट: मांसपेशी ऊतकों फ्रीज के दौरान काफी पीड़ित/गल चक्र और उनके देशी आकृति विज्ञान खो देते हैं । सुक्रोज ऊतक द्वारा अवशोषित होता है और एक क्रायोप्रिजर्वेपिंग एजेंट के रूप में काम करता है जो आकृति विज्ञान के बेहतर संरक्षण की अनुमति देता है। सुनिश्चित करें कि ऊतकों के तैरने के लिए ट्यूब में पर्याप्त समाधान है पर्याप्त निगरानी की जानी चाहिए। पीबीएस-सुक्रोज आसानी से बैक्टीरिया से दूषित होता है, इसलिए बादलके लिए अक्सर समाधान की जांच करें, जो या तो फंगल या बैक्टीरियल ओवरग्रोथ को इंगित करता है। संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए या तो पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन या सोडियम एजाइड को पीबीएस-सुक्रोज समाधान में जोड़ा जा सकता है ।
    4. एक पाश्चर पिपेट के साथ दिलों को हटा दें, सुनिश्चित करें कि पिपेट का उद्घाटन ऊतक को फाड़ने के लिए पर्याप्त व्यापक है। जरूरत पड़ने पर पिपेट को कैंची से काट लें। यदि पूरे भ्रूण के साथ काम कर रहे हैं, तो नमूने को पुनः प्राप्त करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
      नोट: यह धीरे से करते हैं । यहां तक कि अगर पिपेट खोलने के लिए दिल को पुनः प्राप्त करने के लिए काफी व्यापक है, पिपेट के किनारों अभी भी ऊतकों आंसू कर सकते हैं । संदंश ऊतक के नमूनों को इंडेंट कर सकते हैं यदि बहुत आक्रामक रूप से उपयोग किया जाता है।
    5. संक्षेप में ऊतक को लिंट-मुक्त पोंछ पर सूखी हवा की अनुमति दें। नमूने को काटने के लिए वांछित स्थिति में एक OCT मोल्ड में रखें (यानी, सागताल, ट्रांसवर्स, कोरोनल)। नमूना पूरी तरह से जलमग्न होने तक OCT यौगिक जोड़ें, यह सुनिश्चित करें कि ऊतक के संपर्क में कोई बुलबुले नहीं हैं।
    6. मोल्ड को रात या कई दिन -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें और फिर मोल्ड को -80 डिग्री सेल्सियस तक ले जाएं। 24 घंटे के बाद मोल्ड क्रायोसेक्शनिंग के लिए तैयार है। इस प्रारूप में ऊतकों को दीर्घकालिक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. पैराफिन एम्बेडिंग
    1. इथेनॉल का उपयोग करके, इस उत्तराधिकार में ऊतकों को निर्जलित करें: 10 मिन के लिए 50% इथेनॉल, 10 मिन के लिए 70% इथेनॉल, 10 मिन के लिए 80% इथेनॉल, 10 मिन के लिए 95% इथेनॉल, 10 मिन के लिए 100% इथेनॉल (यह 3x करें)।
    2. ऊतकों को इस उत्तराधिकार में इथेनॉल/जाइलीन समाधानों की एक श्रृंखला में भिगोएं: 10-15 मिन के लिए 2:1 इथेनॉल/जाइलीन समाधान, 1:1 इथेनॉल/10-15 मिन के लिए जाइलीन समाधान, 10-15 मिन के लिए 1:2 इथेनॉल/जाइलीन समाधान, 10-15 मिन के लिए 100% जाइलीन (यह 3x करें)।
    3. जाइलीन को पैराफिन से बदलने के लिए, इस उत्तराधिकार में ऊतकों को वैक्यूम ओवन (54-58 डिग्री सेल्सियस के बीच सेट) में भिगोएं: 30 मिन के लिए 2:1 जाइलीन/पैराफिन समाधान, 30 मिन के लिए 1:1 जाइलीन/पैराफिन समाधान, 30 मिन के लिए 1:2 जाइलीन/पैराफिन समाधान, 1-2 घंटे के लिए 100% पैराफिन, 1-2 एच या रात के लिए 100% पैराफिन।
      नोट: समय की विस्तारित अवधि के लिए 60 डिग्री सेल्सियस से परे ऊतकों को गर्म करने से पैराफिन पॉलिमर नीचा और ऊतक भंगुर हो जाएंगे।
    4. ताजा पैराफिन का उपयोग करके, ऊतकों को वांछित स्थिति में एम्बेड करें।

4. OCT एम्बेडेड ऊतकों के लिए क्रायोस्टेट सेक्शनिंग

  1. क्रायोस्टेट में, सभी नमूनों को न्यूनतम 1 घंटे के लिए अंदर रखें यदि नमूने पहले -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहित किए गए थे। उन्हें तब तक वहां रहना चाहिए जब तक कि सभी वर्ग एकत्र नहीं हो जाते ।
  2. सुनिश्चित करें कि क्रायोस्टेट सही तापमान सेटिंग्स पर सेट है। क्रायोस्टेट चैंबर के अंदर पर्यावरणीय तापमान लगभग -20 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए और क्रायोस्टेट की बांह लगभग -24 डिग्री सेल्सियस पर होनी चाहिए।
    नोट: यह तापमान इस बात के आधार पर भिन्न हो सकता है कि ब्लॉक टुकड़ा करने की क्रिया का जवाब कैसे देता है। यदि असंगत टुकड़ा करने की क्रिया एक मुद्दा है, पर्यावरण के तापमान को कम किया जा सकता है ।
  3. इसे ढीला करने के लिए मोल्ड के खुले पक्ष के किनारों पर खींच कर अपने सांचे से OCT ब्लॉक निकालें और फिर बंद छोर पर ब्लॉक को चुटकी लें, जहां मोल्ड संकरी हो जाती है।
  4. अक्टूबर ब्लॉक माउंट करने के लिए, कमरे के तापमान चक पर अक्टूबर जगह है, बीच से शुरू करने और किनारे करने के लिए काम कर रहे । पूरे चक को कवर करने की जरूरत नहीं है ।
  5. मोल्ड पर OCT ब्लॉक (चरण 3.1 देखें) रखें। ब्लॉक के किनारे है कि मोल्ड के बंद पक्ष के खिलाफ था चक पर सामना करना पड़ जाना चाहिए । चक पर अक्टूबर की अनुमति के लिए फ्रीज जब तक यह अपारदर्शी सफेद है, के बारे में 5-10 मिन ।
  6. हाथ के तापमान पर आने के लिए ब्लॉक के लिए एक और 5-10 न्यूनतम के लिए बांह पर चक रखें। एक समानांतर टुकड़ा प्राप्त करने के लिए, हाथ को तब तक समायोजित करें जब तक कि ब्लॉक का किनारा मंच के समानांतर न हो जाए और मंच और ब्लॉक के निचले किनारे के बीच एक भी दूरी है जो ब्लॉक के चरण और शीर्ष किनारे के समान है।
  7. ब्लेड डालें और वर्गों लेने के लिए ब्लेड से ब्लॉक की दूरी को समायोजित करें।
  8. 10 μm की मोटाई पर स्लाइस लें। जब तक ब्याज की बात मैन्युअल रूप से या ट्रिम फ़ंक्शन का उपयोग करके नहीं पहुंच जाती तब तक टुकड़ा करने की क्रिया रखें।
  9. स्लाइस इकट्ठा करने के लिए, एक छोटे से फ्लैट तूलिका और एक विस्तार ब्रश का उपयोग करें। जब मोल्ड काटा जाना शुरू होता है, तो स्टैंड के खिलाफ टुकड़ा खींचने के लिए फ्लैट ब्रश का उपयोग करें। नमूने के माध्यम से काटते समय, आंदोलन निरंतर और बिना ठहराव के होना चाहिए, हालांकि गति नमूने की दृढ़ता पर निर्भर कर सकती है।
  10. टुकड़ा करने की क्रिया करते समय, फ्लैट ब्रश का उपयोग धीरे-धीरे स्लाइस का मार्गदर्शन करने के लिए करें क्योंकि यह बनाया जाता है। टुकड़ा इस बिंदु पर मंच के साथ फ्लश होने की जरूरत नहीं है, तो यह आंसू या खींचती है और हिस्टोलॉजी को प्रभावित करने के कारण नहीं करने के लिए बिल्लो की अनुमति देते हैं ।
    नोट: जब पूरे भ्रूण टुकड़ा करने की क्रिया, इस भाग विशेष रूप से मुश्किल हो सकता है, खासकर जब ऊतक प्रकार बदल रहा है । सुनिश्चित करें कि स्लाइस कोई ठहराव के साथ किया जाता है और ब्रश स्लाइस पर भी आक्रामक नहीं खींचता है। जब ऊतक प्रकार बदल जाते हैं, तो टुकड़ा टूट सकता है, इसलिए तापमान को ठंडा रखना महत्वपूर्ण है। यदि तोड़ना एक मुद्दा है, तो तापमान को कम करें या नमूने की मोटाई बढ़ाएं।
  11. ब्लॉक के आंदोलन को थामने के बाद नमूना पूरी तरह से काट दिया जाता है, लेकिन टुकड़ा अभी तक ब्लॉक से मुक्त नहीं है। स्लाइस से फ्लैट ब्रश को ले जाने के बिना, स्लाइस को फ्लैट बनाने और स्टेज के खिलाफ फ्रीज करने के लिए स्लाइस को नीचे थपथपाने के लिए डिटेल ब्रश का उपयोग करें।
  12. विस्तार ब्रश को हटाने और टुकड़ा खत्म करने से पहले ~ 10 एस के लिए वहां टुकड़ा पकड़ो। मंच के खिलाफ टुकड़ा को धीरे-धीरे समतल करने, किसी भी रोलिंग को रोकने के लिए दो पेंट ब्रश का उपयोग करें, और इसे ~ 20-30 एस के लिए मंच के खिलाफ पकड़ें।
  13. टुकड़ा फ्लिप और मंच के खिलाफ फिर से समतल। स्लाइस को आकर्षित करने और स्लाइड को चरण में छूने के बिना स्लाइड का पालन करने के लिए पर्याप्त रूप से चार्ज की गई स्लाइड को स्थानांतरित करें। स्लाइड्स को पेंसिल से लेबल करें।
  14. भंडारण के दौरान ऊतकों को बर्फ के निर्माण से बचाने के लिए एक एयरटाइट बॉक्स में स्लाइड स्टोर करें। अल्पकालिक भंडारण के लिए, स्लीव्स को धुंधला करने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। लंबे समय तक भंडारण के लिए उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

5. पैराफिन एम्बेडेड ऊतकों के लिए माइक्रोटोम सेक्शनिंग

  1. नमूनों को ठंडा करने के लिए धाराओं से पहले बर्फ पर ब्लॉक रखें। जब शांत, पैराफिन स्लाइस अधिक आसानी से और पतले स्लाइस का उत्पादन कर सकते हैं ।
  2. अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग कर40-45 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान तैयार करें।
  3. माइक्रोटोम के भीतर धारक में ब्लेड रखो। सुनिश्चित करें कि यह सुरक्षित है और फिर निकासी कोण निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि क्लीयरेंस एंगल सही है। निर्माता के निर्देशों के बाद इसकी जांच की जा सकती है।
  4. पैराफिन ब्लॉक को माइक्रोटोम में रखें। सुनिश्चित करें कि यह सही ढंग से उन्मुख है ताकि ब्लेड सीधे ब्लॉक में कट जाए।
  5. सुनिश्चित करें कि ब्लेड कुछ स्लाइस बनाकर ब्लॉक के साथ सही ढंग से उन्मुख है। ऐसा सावधानी से करें ताकि समायोजन किया जा सके।
  6. ब्याज की बात तक पहुंचने तक ब्लॉक ट्रिम करें।
  7. वांछित मोटाई पर स्लाइस बनाएं। ध्यान रखें कि पहले कुछ स्लाइस की संभावना को छोड़ दिया जाएगा।
  8. वर्गों को उठाओ और संदंश का उपयोग करके उन्हें पानी के स्नान में ले जाएं। इससे वर्गों को समतल करना चाहिए । जरूरत के अनुसार उन्हें समायोजित करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  9. स्लाइस को आकर्षित करने और स्लाइड का पालन करने के लिए पर्याप्त इलेक्ट्रोस्टैटिकली चार्ज स्लाइड को स्थानांतरित करें। स्लाइड्स को पेंसिल से लेबल करें।
  10. सभी एकत्र स्लाइड एक स्लाइड रैक में रखें। स्लाइड्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सूखने दें।

6. ऊतकों का अपपर्फिनाइजेशन

  1. आगे की स्लाइड्स में देखें: जाइलीन (2x) में 3 मिन, 1:1 जाइलीन/100% इथेनॉल सॉल्यूशन में 3 मिन, 100% इथेनॉल (2x) में 3 मिन, 95% इथेनॉल में 3 मिन, 70% इथेनॉल में 3 मिन, 50% इथेनॉल में 3 मिन।

7. हेमातक्सीलिन और इओसिन धुंधला

  1. स्नेसिंग के लिए स्लाइड्स तैयार करें।
    1. यदि अक्टूबर तैयार ऊतकों का उपयोग कर, ~ 4 मिन के लिए आसुत पानी में सोख जब तक अक्टूबर भंग कर दिया है और सूखी चलो ।
    2. यदि पैराफिन एम्बेडेड ऊतकों का उपयोग कररहे हैं, तो उन्हें डिपरफ़िन किया जाना चाहिए। चरण 6.1 देखें।
  2. स्लाइड को 10 सीन के लिए फ़िल्टर 0.1% हेमेटक्सीलिन में रखें स्लाइड को आसुत पानी में रखें, पानी को तुरंत बदलें और फिर 3 मिन के बाद फिर से।
  3. 10 एस या डुबकी 12x के लिए 0.5% eosin में स्लाइड रखें। आसुत पानी में स्लाइड डुबकी जब तक eosin अब धारियाँ, के बारे में 2-3 dips ।
  4. स्लाइड को 10 एस के लिए 50% इथेनॉल में भिगोकर, 10 एस के लिए 75% इथेनॉल, 30 एस के लिए 95% इथेनॉल और 1 मिन के लिए 100% इथेनॉल को डिहाइड्रेट करें। जाइलीन में डुबकी तब तक करें जब तक कि जाइलीन चिकनी नहीं आ जाती, ~ 5-7 डिप्स।
  5. जाइलीन को वाष्पित होने दें और एक त्वरित सुखाने वाले बढ़ते माध्यम के साथ माउंट करें जिसमें ग्लास के करीब एक अपवर्तक सूचकांक होता है।

8. आम हृदय दोषों का गुणात्मक विश्लेषण

  1. उल्टे या स्टीरियो माइक्रोस्कोप और उसके संबंधित कैमरे का उपयोग करके सभी नमूनों की छवियां लें। विश्लेषण किए जा रहे दोषों के प्रकारों के आधार पर स्थूल और सूक्ष्म छवियां लें। मैक्रोस्कोपिक छवियों को 10x से नीचे किसी भी आवर्धन के साथ लिया जा सकता है। सूक्ष्म छवियों को 40x आवर्धन या उससे अधिक पर लिया जाना चाहिए। इस पेपर में ली गई तस्वीरें एक टकसाल माइक्रोस्कोप और एक 40x वायु उद्देश्य (०.५५ के लेंस एनए) का उपयोग कर एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 5x आवर्धन के साथ लिया गया ।
    नोट: स्थूल छवियां एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है क्योंकि वे पूरे दिल को एक दृश्य प्रदान करते हैं(चित्रा 3)। पैटर्न की पहचान हो जाने के रूप में, विशिष्ट क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है और आगे की जांच की ।
  2. एक कंप्यूटर स्क्रीन पर साथ-साथ सभी छवियों को लाइन करें। स्क्रीन के एक तरफ नियंत्रण नमूनों की छवियों के सभी और स्क्रीन के दूसरी तरफ प्रयोगात्मक नमूनों की छवियों के सभी है । एक समय में एक उपचार समूह का विश्लेषण करना सबसे अच्छा है।
  3. उपचार समूहों के बीच फेनोटाइप में अंतर की तलाश करें, प्रमुख क्षेत्रों में शुरू करें जहां आम हृदय दोष होते हैं। यह इस आधार पर भिन्न होगा कि छवियां स्थूल हैं, जो दिल की सकल शरीर रचना, या सूक्ष्म शरीर रचना चित्रित करती हैं, जो हृदय ऊतक की सूक्ष्म शरीर रचना को चित्रित करती हैं।
  4. आम स्थूल हृदय दोषों की खोज शुरू करें, जैसे वेंट्रिकुलर सेप्टल दोष(चित्रा 2ए),एट्रियल सेप्टल दोष(चित्रा 2बी),और पेटेंट डक्टस आर्टेरियोसस(चित्रा 2सी)। ये सभी दोष हृदय के ट्रांसवर्स व्यू में सबसे आसानी से देखे जाते हैं।
  5. सेप्टल दोषों की पहचान करने के लिए, कई स्लाइस को देखने पर विचार करें, क्योंकि उन्हें ऊतक के एक विमान में देखा जा सकता है न कि दूसरा।
    नोट- कभी-कभी दोष में पट की कमी नहीं होती, बल्कि पट में छेद होता है। इसलिए, एक सेप्टल दोष के लिए एक आंसू गलती नहीं करने के लिए ध्यान दें। किसी विशिष्ट क्षेत्र में आस-पास के स्लाइस के बीच शामिल होने की तलाश इस बात की पुष्टि कर सकती है कि यह वास्तव में एक दोष है या टुकड़ा करने की क्रिया से आंसू है।
  6. बहिर्वाह पथ में दोषों की पहचान करने के लिए, जैसे पेटेंट डक्टस आर्टेरियोसस, प्रमुख रक्त वाहिकाओं का पालन करने के लिए कई स्लाइस का उपयोग करें क्योंकि वे दिल छोड़ देते हैं। एक-दूसरे के सापेक्ष प्रमुख रक्त वाहिकाओं की छवि बनाएं। एक उदाहरण चित्रा 2सीमें चित्रित किया गया है ।
    नोट: कुछ अनियमितताएं भ्रूण के विकास के चरण के कारण हो सकती हैं (उदाहरण के लिए, पेटेंट डक्टस आर्टेरियोसस जन्म के तुरंत बाद पोस्टटलली बंद हो जाता है; वेंट्रिकुलर सेप्टम ~ e14.5 तक पूरी तरह से बंद नहीं होता है)। आंकड़ों में शामिल नहीं किए गए कुछ अन्य सामान्य स्थूल हृदय दोषों में लगातार ट्रंक्यूस एटेरियोसस शामिल हैं, जिन्हें ई16.5 और बाद में सबसे आसानी से पता लगाया जा सकता है; डबल आउटलेट राइट वेंट्रिकल (DORV), जिसे स्लाइस में पाया जा सकता है जिसमें दिल बहिर्वाह पथ में प्रवेश करता है; और एक अधिभावी महाधमनी22. एक आम सूक्ष्म हृदय दोष में मांसपेशियों के कॉम्पैक्टेशन(चित्रा 4)में कमी शामिल है।

9. हेमेटोक्सीलिन और इओसिन दाग ऊतकों का उपयोग करहृदय मांसपेशी कॉम्पैक्टेशन का मात्रात्मक विश्लेषण

  1. दाग ऊतक नमूनों के स्थूल दृश्य का उपयोग करना(चित्र4ए),एक 40x आवर्धन(चित्र 4बी)पर छवि के लिए ब्याज के एक क्षेत्र की पहचान । इस पेपर के लिए लेफ्ट वेंट्रिकल की वॉल का इस्तेमाल किया गया था। वांछित प्रारूप में छवि को सहेजें। इस पेपर के लिए, छवियों को .tif फ़ाइलों के रूप में सहेजा गया था।
  2. इमेजजे सॉफ्टवेयर में छवि खोलें।
  3. छवि को 8-बिट पर सेट करें। इससे छवि को अगले चरण23,24में दहलीज उपकरण का उपयोग करने की अनुमति दी जाती है । ऐसा करने के लिए, "छवि" का चयन करें। टाइप । 8-बिट"।
  4. फोटो की दहलीज सेट करें। इस चरण का उद्देश्य केवल उन पिक्सेल का चयन करना है जो पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो23,24ऊतकों का प्रतिनिधित्व करने वाले पिक्सेल को छोड़कर।
    नोट: इस सतह क्षेत्र पर बाद में घटाया जाएगा । एक सही दहलीज पिक्सल का चयन करेगा कि शोधकर्ता मांसपेशियों के ऊतकों की सतह क्षेत्र से बाहर करना चाहता है । इसलिए, अंतिम परिणाम में ऊतक को ग्रेस्केल में शामिल किया जाना चाहिए और पृष्ठभूमि का चयन किया जाएगा।
    1. क्लिक करें"ImageJ। छवि । समायोजित करते हैं । दहलीज"। दहलीज समायोजन करने के लिए शीर्ष बार ले जाएं। वांछित वर्गों का चयन21के बाद किसी अन्य परिवर्तन किए बिना दहलीज समायोजन खिड़की को बंद कर दें ।
  5. ऊतक में रहने वाले स्थान का चयन करने के लिए बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करें। ध्यान से सुनिश्चित करें कि रूपरेखा ऊतक सीमाओं का पता लगाने, क्योंकि ढीला ट्रेसिंग झूठी माप प्रदान करेगा ।
  6. इमेजजे पर माप सेटिंग को समायोजित करें ताकि सॉफ्टवेयर केवल चरण 9.423में दहलीज उपकरण का उपयोग करके चुने गए पिक्सेल के क्षेत्र को मापता है। "इमेजजे । विश्लेषण करें । माप निर्धारित करें । क्षेत्र और सीमा सीमा"। केवल क्षेत्र और सीमा सीमा का चयन करें।
  7. हाइलाइट किए गए पिक्सेल के क्षेत्र को मापें। "इमेजजे । विश्लेषण करें । उपाय"। यह मूल्य नकारात्मक स्थान के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है।
  8. हित के पूरे क्षेत्र के क्षेत्र को मापें। यह वह क्षेत्र है जिसे बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके चुना गया था। "छवि जम्मू । विश्लेषण करें । माप निर्धारित करें । क्षेत्र"। केवल क्षेत्र का चयन करें और सीमा को सीमा से हटाने का चयन करें। फिर उपाय, "छवि जम्मू का चयनकरें । विश्लेषण करें । उपाय"।
  9. क्षेत्र की गणना वास्तविक मांसपेशियों के ऊतकों ब्याज के क्षेत्र के भीतर कब्जा कर रहा है। ब्याज के पूरे क्षेत्र के क्षेत्र से नकारात्मक अंतरिक्ष के क्षेत्र को घटाएं। यह मूल्य मांसपेशियों के ऊतकों का क्षेत्र है।
  10. पेशी कॉम्पिटिशन इंडेक्स (एमसीआई) की गणना करें। ब्याज के क्षेत्र के क्षेत्र से मांसपेशियों के ऊतकों के क्षेत्र को विभाजित करें।

    एमसीआई मूल्य जितना बड़ा होगा, मांसपेशियों को उतना ही अधिक संकुचित किया जाता है। इन एमसीआई मूल्यों का उपयोग उपचार समूहों(चित्रा 4सी)के बीच मांसपेशियों के कॉम्पैक्टेशन में महत्वपूर्ण परिवर्तनों के लिए परीक्षण करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

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Representative Results

मांसपेशी कॉम्पैक्टेशन सूचकांक दो अलग वातावरण, एक नियंत्रण और एक प्रयोगात्मक समूह के तहत विकसित दिलों के बीच तुलना की थी । इन प्रोटोकॉलों का उपयोग मात्रात्मक रूप से मांसपेशियों के ऊतकों के कॉम्पैक्टेशन का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, जिसने सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति दी थी। गैर-प्रयोगात्मक परिस्थितियों में विकसित भ्रूणों के सापेक्ष प्रयोगात्मक दिलों में मांसपेशियों के कॉम्पिटिशन को काफी कम दिखाया गया था।

भ्रूण अगर अवलोकन समय गलत लग रहा था खारिज कर दिया गया । हालांकि भ्रूण के अवरुद्ध विकास प्रयोग के उपचार का परिणाम हो सकता है, और वहां विकास की प्रगति में एक सीमा है, प्रजनन पर्याप्त रूप से बाहर दूरी के लिए भ्रूण के विकास के समय सुनिश्चित किया गया था । भ्रूण का मंचन21थेलर मंचन का उपयोग करके किया गया था । यदि स्लाइस स्थिरता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं या यदि उनके पास स्पष्ट आंसू या सिलवटथे तो नमूनों को खराब कटा हुआ माना जाता था। धुंधला ऊतक किनारों को बाहर करने के लिए पर्याप्त विपरीत प्रदान की है, लेकिन सेल सुविधाओं को अविवेच्य बनाने के लिए इतना अंधेरा नहीं था। स्लाइड तो एक 40x उद्देश्य के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ छवि थे । इमेजजे सॉफ्टवेयर और माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल का उपयोग करके एमसीआई मूल्यों की गणना की गई थी। इन एमसीआई मूल्यों का विश्लेषण टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्लग परख C57BL6/J चूहों में परिणाम । (A)एक आसानी से पहचाने जाने योग्य मैथुन प्लग वाला माउस। (ख)कोई मैथुन प्लग के साथ एक माउस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आम हृदय दोष। जन्मजात हृदय दोष के सच्चे प्रत्याशित आकृति विज्ञान की योजनाबद्ध। (क)वेंट्रिकुलर सेप्टल दोष का ट्रांसवर्स व्यू। (ख)एक अलिंद सेप्टल दोष का ट्रांसवर्स व्यू । (ग)पेटेंट डक्टस आर्टेरियोसस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: Hematoxylin और e15.5 दिलों के eosin दाग । (क)एक दाग दिल जो सामान्य परिस्थितियों में विकसित हुआ। स्केल बार = 750 माइक्रोन।(बी)एक दाग दिल जो प्रायोगिक परिस्थितियों में विकसित हुआ। स्केल बार = 750 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: आवश्यक फैटी एसिड की कमी वाले मातृ आहार के तहत विकसित सामान्य मातृ आहार और दिलों के तहत विकसित दिलों के बीच मांसपेशियों के कॉम्पैक्टेशन का मात्रात्मक विश्लेषण। (A)हेमैटोक्सीलिन और इओसिन ने स्थूल (5x) दृश्य में दिलों को दाग दिया । स्केल बार = 1,000 माइक्रोन.(बी)हेमैटोक्सीलिन और इओसिन ने सूक्ष्म दृश्य (40x) पर दिलों को दाग दिया। स्केल बार = 75 माइक्रोन।(सी)मांसपेशियों के कॉम्पैक्टेशन इंडेक्स मापन का परिणामी डेटा। मूल्यों का विश्लेषण टी-टेस्ट (एन = 4 प्रति उपचार समूह) का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल भ्रूणीय हृदयों में हृदय विकास के विश्लेषण में शामिल तकनीकों की पड़ताल करता है। इस विधि की कुछ सीमाएं प्रारंभिक तकनीकों के लिए आवश्यक शारीरिक निपुणता हैं, जिसके लिए अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है, और माइक्रोस्कोप इमेजिंग के साथ कौशल। यदि क्रायोस्टेट पर प्राप्त स्लाइस गन्दा हैं, तो हेमैटोक्सीलिन और इओसिन धुंधला स्पष्ट नहीं होगा, या यदि माइक्रोस्कोप पर ली गई छवियों में खराब प्रकाश व्यवस्था है, तो इमेजजे के साथ उपयोग की जाने वाली विधि काम नहीं करेगी। इमेजजे सॉफ़्टवेयर की सीमा सुविधा की एक सीमा यह है कि यह पिक्सेल मूल्य पर निर्भर सीमा के एक छोर पर स्थित पिक्सेल का चयन करता है। इसलिए, सीमा के गलत पक्ष पर मौजूद किसी भी पिक्सेल को गलत तरीके से शामिल किया जाएगा या गणना में बाहर रखा जाएगा। अंततः, एक अध्ययन में उपयोग के लिए प्रोटोकॉल को अपनाने के लिए समस्या निवारण आवश्यक होगा।

इस घटना में कि दिल निकालने बहुत मुश्किल है, 2.8 कदम लंघन पर विचार करें। इसके अतिरिक्त, छाती गुहा से सिर्फ दिल और फेफड़ों से अधिक हटाने पर विचार करें। लक्ष्य तो बड़ा और हेरफेर करने के लिए आसान हो जाता है, और दिल और ठीक संदंश के बीच सीधा संपर्क कम हो जाता है । क्रायोस्टेट सेक्शनिंग करते समय, प्रायोगिक नमूनों को हमेशा सीधे नमूनों को नियंत्रित करने की तुलना में किया जाएगा। यह उपयोगकर्ता त्रुटि के लिए कुछ कमरे की अनुमति देता है जब तक त्रुटि सभी नमूनों में सुसंगत है। उपयोगकर्ता त्रुटि को कम करने और झूठे परिणामों से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि दोनों उपचार समूहों से तुलनीय अनुभाग प्राप्त किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, यदि एक से अधिक व्यक्ति वर्गों का उत्पादन कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि एक व्यक्ति नियंत्रण और सभी उपचार समूहों के लिए एक भी संख्या में वर्गों का उत्पादन करता है, न कि केवल एक उपसमूह । अंत में, इमेजजे पर छवियों को थ्रेसकरने पर, सीमा उपकरण का उपयोग उन पिक्सेल के चयन में अधिकतम स्वतंत्रता की अनुमति देने के लिए किया जाता है जो ऊतक और पिक्सेल का प्रतिनिधित्व करते हैं जो नहीं करते हैं। यदि आवश्यक हो, तो ऊतक के पिक्सेल मूल्य से पृष्ठभूमि के पिक्सेल मूल्य को और तेज करने के लिए छवियों के विपरीत समायोजित करें। हालांकि समस्या निवारण विकल्प हैं, तकनीकों को अभी भी उच्च स्तर के कौशल की आवश्यकता होती है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन उन डेटा तक पहुंच प्रदान करता है जिन्हें आमतौर पर अन्य हृदय विकासात्मक अनुसंधान अध्ययनों में मापा नहीं जाता है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल की सुविधाओं का उपयोग एक वैज्ञानिक जांच के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान कर सकता है ।

कार्डियोलॉजी अनुसंधान में प्रयोगात्मक उपचार के प्रभावों की पहचान अक्सर आकृति विज्ञान मूल्यांकन के माध्यम से जांच की जाती है। यह विशेष रूप से विकासात्मक जीव विज्ञान में मामला है, जिसमें अपरा दिल ों के विकास की शारीरिक विशेषताओं को मापा जाना मुश्किल बना ता है। इसलिए, रूपात्मक विश्लेषण जो दिल के कार्य में अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है, नाटकीय रूप से विकासात्मक जीव विज्ञान अनुसंधान के प्रक्षेपवक्र को स्थानांतरित करता है। यद्यपि अधिकांश कागजात हृदय की शक्ति निर्धारित करने के लिए हृदय की मांसपेशियों की मोटाई का विश्लेषण करते हैं, मांसपेशियों के कॉम्पैक्टेशन का प्रत्यक्ष माप विकासशील स्तनधारी हृदय25,26,27के शरीर विज्ञान में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास रिपोर्ट करने के लिए कोई खुलासे नहीं हैं ।

Acknowledgments

Aguirre लैब राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के रक्त संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या K01HL135464 के तहत और पुरस्कार संख्या 19IPLOI34660342 के तहत अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Tube(s) Fisher Scientific # 1495970C
C57BL/6J Mice Jackson Labs C57BL/6J - stock 000664
Coplin Staining Jars (x6) VWR Scientific # 25457-006
Coverslips 24X50MM #1.5 VWR Scientific # 48393-241
Cryostat - Leica CM3050S Leica N/A
Dissecting Dish(s) Fisher Scientific # 50930381
Dumont #5 - Fine Forceps (x2) Fine Science Tools # 11254-20
Eosin Y Solution Millipore Sigma # HT110116-500ML
Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) Fisher Scientific # BP2818-500
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Millipore Sigma # E9884-100G
Eukitt Millipore Sigma # 03989-100ML
Fine Scissors Fine Science Tools # 14060-10
Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC Leica N/A
Glycine Millipore Sigma # 410225-250G
Graefe Forceps Fine Science Tools # 11052-10
Graphpad Prism 8 Software Graphpad
ImageJ Software ImageJ
Kimwipes Fisher Scientific # 06666A
Mayer's hematoxylin solution Millipore Sigma # MHS16-500ML
Micropipette tip(s) - p200 Fisher Scientific # 02707448
Microsoft Excel Software Microsoft
OCT Compound VWR Scientific # 102094-106
Olympus CkX53 Microscope Olympus
Paint Brushes (at least 2)
Paraformaldehyde VWR Scientific # 0215014601 Make into 4% solution (dissolved in PBS)
Pasteur pipette(s) Fisher Scientific # 13-711-7M
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific # 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific # 70011044 Dilute from 10x to 1x before using
Scale Mettler Toledo # MS1602TS
Scale Mettler Toledo # MS105
Scalpel Handle #3 VWR Scientific # 10161-918
Scalpel Blades VWR Scientific # 21909-612
Square Mold VWR Scientific # 100500-224 For OCT molds
Sucrose Millipore Sigma # S9378-500G
Superfrost Plus Slides Fisher Scientific # 1255015
Surgical Scissors Fine Science Tools # 14002-14
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades VWR Scientific # 25608-964
Travel Scale Acculab VIC 5101
Xylene Millipore Sigma 214736-1L

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Ball, K., Kinne, R., Aguirre, A.… More

Ball, K., Kinne, R., Aguirre, A. Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods. J. Vis. Exp. (157), e60926, doi:10.3791/60926 (2020).

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