Traktionskraftmikroskopie zur Untersuchung der B-Lymphozytenaktivierung

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von Traktionskraftmikroskopieexperimenten an B-Zellen vor. Wir beschreiben die Herstellung von weichen Polyacrylamidgelen und deren Funktionalisierung sowie die Datenerfassung am Mikroskop und eine Zusammenfassung der Datenanalyse.

Abstract

Die Traktionskraftmikroskopie (TFM) ermöglicht die Messung der Von einer Zelle auf einem Substrat erzeugten Kräfte. Diese Technik leitet Traktionskraftmessungen aus einem experimentell beobachteten Verschiebungsfeld ab, das durch das Ziehen einer Zelle auf einem elastischen Substrat erzeugt wird. Hier haben wir TFM angepasst, um die räumliche und zeitliche Struktur des Kraftfeldes zu untersuchen, das von B-Zellen ausgeübt wird, wenn es durch Antigeneingriff des B-Zellrezeptors aktiviert wird. Gelsteifigkeit, Perlendichte und Proteinfunktionalisierung müssen für die Untersuchung relativ kleiner Zellen optimiert werden, die mit Liganden für Zelloberflächenrezeptoren interagieren und speziell auf Sie reagieren.

Introduction

B-Zellen sind die Antikörper produzierenden Zellen des Immunsystems. Um die adaptive Immunantwort zu aktivieren, erwerben sie das Antigen zunächst in nativer Form (d. h. nicht verarbeitet) über einen spezifischen Rezeptor namens B-Zellrezeptor (BCR)¹. Dieser Prozess findet in der Zellzone des Lymphknotens B statt. Selbst wenn einige Antigene die B-Zelle durch lymphatische Flüssigkeiten erreichen können, werden die meisten Antigene, insbesondere mit hohem Molekulargewicht (>70 kDa, das ist die Grenzgröße für lymphatische Schläuche), tatsächlich in ihrer nativen Form auf der Oberfläche einer Antigen darstellenden Zelle (APC) dargestellt, typischerweise eine subkapsuläre Sinusmakrophagen oder follikuläre dendritische Zelle, durch Lectin oder Fc-Rezeptoren (nicht-spezifisch). Der Kontakt mit dieser Zelle führt zur Bildung einer Immunsynapse, bei der das BCR Die APC-assoziierten Antigene anübt. Die Bindung eines Antigens an den BCR löst bCR-Signalisierung aus, die krafterzeugende Mechanismen aktivieren kann. Diese Kräfte könnten wichtig für die Verstärkung BCR-Signalisierung sein, sind aber auch wichtig für B-Zellen zu extrahieren und dann verinnerlichen das Antigen.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass der BCR in der Tat mechanosensibel ist². Beispielsweise entlocken steifere Substrate verbesserte BCR-Signalisierung³. Darüber hinaus zieht die an der Immunsynapse erzeugte Kraft einzelne BCRs, um ihre Affinität zu Antigen zu untersuchen und dadurch eine Affinitätsdiskriminierung zu gewährleisten⁴. Es ist daher interessant, die mechanische Reaktion von B-Zellen auf die Antigen-Präsentation zu untersuchen und diese Reaktion in Form von Typ der beteiligten Rezeptoren (IgG/IgM)⁵, Adhäsionsmoleküle (Integrin-Liganden) oder in pharmakologisch und genetisch veränderten Zellen (d.h. Zum Silencing eines Proteins nach der BCR-Signalisierung oder Zytoskelettdynamik) zu sezieren⁶.

Eine einfache Methode, um die Reaktion einer Zelle auf ein Substrat physiologischer Steifigkeit zu beobachten und gleichzeitig die auf das Substrat ausgeübten Untersuchungskräfte zu untersuchen, ist Traction Force Microscopy (TFM). TFM besteht aus der Beobachtung des Verschiebungsfeldes, das durch das Ziehen der Zelle auf einem elastischen Substrat erzeugt wird. Ursprünglich wurde die Verformung des Gels durch Falten des Elastomers selbst durch Phasenkontrastmikroskopie⁷beobachtet, aber das Einsetzen von Fluoreszenz-Mikroperlen als treuer Marker ermöglichte eine bessere Auflösung und ist seitdem zum Standard⁸geworden. Diese Methode wurde verwendet, um die Zugkraft zu untersuchen, die von anhaftenden Zellen, Geweben und sogar Organoiden ausgeübt wird, die in Gele eingebettet sind. Mehrere Varianten von TFM wurden entwickelt⁹ einschließlich, Kombination mit hochauflösender Mikroskopie (d.h. STED¹⁰ oder SRRF¹¹), Modifikation des Brechungsindex des Gels, um die TIRF-Mikroskopie¹²zu ermöglichen, Perlen durch nanogedruckte Muster¹³zu ersetzen und Nanosäulen anstelle von flacher Oberfläche¹⁴zu verwenden. Eine vollständige Übersicht dieser Variationen finden Sie unter Colin-York et al.¹⁵.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Messung der von B-Zellen ausgeübten Kräfte auf einem antigenbeschichteten Substrat. Diese Kräfte werden auf die Liganden (Antigen) aufgetragen, um sie zu bündeln und anschließend aus dem antigenpräsentierenden Substrat zu extrahieren. Wir haben das Standard-TFM-Protokoll angepasst, um die Steifigkeit physiologischer Antigen-präsentierender Substrate, die Größe und die entsprechende Beschichtung für die B-Zellen nachzuahmen. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Zellen und kann in Verbindung mit Fluoreszenzmikroskopie-Techniken und chemischen Behandlungen verwendet werden. Es geht jedoch nicht darum, Einzelmolekülkraftmessungen zu untersuchen, für die optische Pinzette¹⁶, Molekularspannungssonden^17,18, Biomembrankraftsonden¹⁹und Atomkraftmikroskopie²⁰ geeignetere Techniken sind. Im Vergleich zu anderen Einzelzellkraftmessmethoden (z.B. Mikropipetten²¹ oder Mikroplatten²²) ermöglicht TFM die Rekonstruktion einer vollständigen Karte der an der Synapse ausgeübten Kräfte mit einer Auflösung von 300 nm. Dies ist nützlich, um räumlich-zeitliche Muster in den auf die Oberfläche ausgeübten Kräften zu identifizieren und, da das Gel mit konfokaler Bildgebung kompatibel ist, sie mit der Rekrutierung spezifischer Proteine (z. B. Zytoskelett und Signalproteine) zu korrelieren.

Obwohl 3D TFM möglich ist, ist es nicht kompatibel mit der Steifigkeit und dem Setup, das wir verwendet haben. Verformungen in 3D sind durch andere komplexere Setups wie die Protrusionskraftmikroskopie (AFM-Scanning einer verformbaren Membran, in der die Zellen plattiert sind)^23,24 und elastische Resonator-Interferenzspannungs-Stressmikroskopie (ERISM, ein Gel, das als Resonationshöhle für Licht fungiert und Verformungen des Substrats mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern hervorhebt)^{erreichbar 25}. Obwohl diese Techniken sehr vielversprechend sind, wurden sie noch nicht in B-Zellen eingesetzt. Andere Arten von TFM, wie z. B. auf Nanosäulen¹⁴, könnten verwendet werden, um reproduzierbarere Substrate zu haben. Diese Geometrie ist jedoch nicht an weiche Zellen angepasst, da die Zelle die Säulen durchdringt, was die Analyse erschwert. Dieser Ansatz wurde in der Tat in T-Zellen verwendet, um die Fähigkeit der Zelle zu beobachten, Strukturen um die Säulen zu bauen²⁶.

Trotz seiner Einfachheit ermöglicht TFM mit Polyacrylamidgelen die gleichzeitige Beobachtung vieler Zellen und kann einfach und kostengünstig in jedem Labor implementiert werden, das mit einer Bank und einem Epifluoreszenzmikroskop ausgestattet ist (obwohl wir konfokale/spinnende Scheibe empfehlen).

Um die physiologische Steifigkeit eines APC nachzuahmen, verwendeten wir Polyacrylamid-Gele mit einer Steifigkeit von 500 Pa²⁷ und funktionalisierten das Gel mit aktivierenden Antigenen. In diesem Protokoll haben wir die Oberfläche des Polyacrylamidgels mit Hühnereilysozym (HEL) funktionalisiert. Dies ermöglicht die Messung der Kräfte, die durch Stimulation des BCR durch Eingreifen der Antigenbindungsstelle erzeugt werden. Die Verwendung dieses Antigens und der HEL-spezifischen B-Zellen von MD4-Mäusen sorgt für eine relativ gleichmäßige Krafterzeugung als Reaktion auf Antigenligation²⁸. Andere Moleküle (wie Anti-IgM für B6-Mäuse) können jedoch auf das Gel gepfropft werden, aber die in diesen Fällen erzeugten Kräfte könnten heterogener und weniger intensiv sein. Da es sich bei B-Zellen um kleine Zellen handelt (Durchmesser 6 m), wurde die Anzahl der Perlen so optimiert, dass sie maximal, aber dennoch nachvausbar ist. Bei großen Zellen, die die Kräfte der kPa auf ihren Substraten ausüben, kann man mit relativ spärlichen Perlen oder der Durchführung einfacher Partikelbild-Velocimetrie (PIV) zufriedenstellende Ergebnisse erzielen, um das Verformungsfeld zu rekonstruieren. Für kleine Zellen wie B-Lymphozyten, die Stress von bis zu 50 Pa ausüben, ist jedoch die Verwendung von Einzelpartikelverfolgung (Partikelverfolgungs-Velocimetrie, PTV) erforderlich, um die gewünschte Genauigkeit bei der Rekonstruktion des Verformungsfeldes zu erreichen. Um Perlen zuverlässig einzeln zu verfolgen, muss die Vergrößerung der Objektivlinse mindestens 60-fach und ihre numerische Blende um 1,3 betragen. Daher müssen die Gele relativ dünn sein (<50 m), sonst sind die Perlen nicht sichtbar, da sie über dem Arbeitsabstand des Objektivs liegen.

Das Hauptprotokoll besteht aus drei Abschnitten: Gelzubereitung, Gelfunktionalisierung und Bildgebung; zwei weitere Abschnitte sind optional und sind der Antigenextraktionsquantifizierung und Bildgebung von fluoreszierenden Zellen gewidmet.

Protocol

1. Gelzubereitung

1. Silanisierung der Gelunterstützung
   1. Aktivieren Sie die Abdeckungsrutsche oder Glasboden Petrischale (die als Gelträger verwendet wird) mit einer UV-Lampe für 2 min (warten Sie 30 s vor der Exposition gegenüber der UV-Lampe, um die Exposition gegenüber Restozon zu vermeiden).
   2. Silanisieren Sie die Coverslip/Glasbodenschale mit 200 l Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS) für 5 min. Dadurch wird die Unterstützung für die kovalente Bindung des Gels vorbereitet.
   3. Waschen Sie die Coverslip/Glasbodenschale gründlich mit reinem, reinem Wasser.
   4. Trocknen Sie die Abdeckungslip/Glasbodenschale mit Vakuum-Aspiration.
2. Herstellung des 18mm-Abdeckungsslips zur Abflachung des Gels
   1. Um die Abdeckungen vorzubereiten, legen Sie sie zuerst in einen keramischen Deckelhalter. Dann den Deckelhalter in einen kleinen Becher (50 ml) geben und Siliziumreagenz (bei 4 °C gelagert, wiederverwendbar) über die Deckellipsen gießen, wobei sichergestellt ist, dass sie vollständig abgedeckt sind.
   2. Bedecken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und brüten Sie für 3 min bei Raumtemperatur. Während des Wartens einen großen Becher (500 ml) mit reinem reinem Wasser füllen. Nach 3 min Inkubation im Siliziumisierungsreagenz den Deckelhalter mit Denlipsen auf das Glaswasser übertragen.
   3. Spülen Sie die Deckelmitlipsen gründlich mit reinem Wasser, trocknen Sie sie gut und halten Sie sie auf Papiertüchern auf. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, fahren Sie sofort mit dem nächsten Abschnitt fort.
3. Gelpolymerisation
   1. Bei Gelen von 0,5 kPa 75 l 40 % Acrylamid mit 30 l 2% Bisacrylamid (Vernetzer) und 895 l phosphatgepufferter Saline (PBS) mischen. Dieser Vormix kann bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.
   2. Auf 167 l 0,5 kPa-Gel-Vormischung 1% (1,67 l) Perlen, Wirbel und Beschallung für 5 min in einem Bad-Sonicator (Standard-Bänke-Ultraschallreiniger mit einer Leistung von 50–100 W und Frequenz 40 kHz) hinzufügen. Halten Sie die Mischung mit Aluminiumfolie vor Licht geschützt.
      HINWEIS: Der Premix polymerisiert erst, wenn der Initiator (TEMED) hinzugefügt wurde.
   3. Um die Polymerisation zu katalysieren, fügen Sie 1% (1,67 l) von 10% w/v Ammoniumpersulfat (APS) hinzu.
   4. Um die Polymerisation zu initiieren, fügen Sie 0,1% (0,2 l) N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzu. Mit einer Pipette mischen. Sobald APS und TEMED hinzugefügt wurden, polymerisiert sich das Gel schnell, so dass es schnell zum Gelguss übergeht.
4. Gelguss
   1. Pipetten 9 l Gelmischung auf jede Coverslip/Glasbodenschale (Tropfen in der Mitte, Abbildung 1A)
   2. Den silanisierten/hydrophoben Deckelschlupf platzieren und das Gel abflachen (Abbildung 1B). Drücken Sie mit Zangen den Deckelschlupf, um sicherzustellen, dass sich das Gel über den gesamten Bereich des Deckslips ausbreitet (Abbildung 1C), bis es ausläuft.
   3. Invertieren Sie die Coverslip/Glasbodenschale in eine große Petrischale und tippen Sie sie auf die Bank, um Perlen zu zwingen, die auf die Geloberfläche zugehen (Abbildung 1D).
   4. Mit Aluminiumfolie abdecken und 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer polymerisieren lassen (d.h. ein Nassgewebe über die Schale legen, um Verdunstung zu verhindern).
   5. Fügen Sie nach 1 h PBS zum Beispiel hinzu, um die Freigabe des Deckslips zu erleichtern. Entfernen Sie den Deckelrutsch vorsichtig mit einer Nadel (die Beschichtung mit verschiedenen Silanen sollte ein einfaches Abblättern des Deckels vom Gel ermöglichen, Abbildung 1E).
   6. Lassen Sie das Gel in PBS.
      HINWEIS: Gele können jetzt in PBS bei 4 °C für 5–7 Tage gelagert werden, aber es wird empfohlen, sie innerhalb von 48 h zu verwenden.

2. Gelfunktionalisierung

1. Bereiten Sie Sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat (Sulfo SANPAH) Lösung bei 0,5 mg/ml in 10 mM HEPES Puffer vor. Diese kann bei 4 °C mit Aluminiumfolie bis zu einer Woche bedeckt gelagert werden.
2. Aspirieren Sie die PBS von Gelen.
3. Fügen Sie dem Gel bei Raumtemperatur 150 l Sulfo SANPAH hinzu (Abbildung 1F).
4. Setzen Sie das Gel 2 min UV-Behandlung aus, um die Standorte von Sulfo SANPAH zu photoaktivieren und an der Geloberfläche kleben zu lassen.
5. Dreimal mit PBS waschen (Abbildung 1G).
6. Wiederholen Sie die Schritte 2.2–2.5.
7. Fügen Sie jedem Gel 250 l HEL (100 g/ml) hinzu und in kubisieren Sie über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4 °C, während sie mit Aluminiumfolie bedeckt bleiben (Abbildung 1H).
8. HEL-Antigen entfernen und dreimal mit PBS waschen.
   HINWEIS: HEL wirkt sowohl als Antigen als auch als Haftmolekül. Es kann durch andere Moleküle ersetzt werden, die an den Rezeptor binden (z. B. ein Anti-Maus-IgM, Rinderserum Albumin, Ovalbumin) oder mit Integrin-Liganden gemischt werden (z. B. ICAM1-Bindung an LFA1). Bei Bedarf kann die Antigenextraktion mit einer fluoreszierenden Version des HEL beobachtet werden (erhalten durch Färbung des Moleküls mit einem Protein-Etikettierungskit, siehe Schritt 4). Beachten Sie, dass eine bestimmte Konzentration in loser Schüttung möglicherweise nicht die gleiche Oberflächenkonzentration auf dem Gel ergibt wie auf dem Glas: Dies muss mit sekundärer Färbung quantifiziert werden, wenn ein direkter Vergleich erforderlich ist.

3. Zellbeladung und Bildgebung

1. Vor der Bildgebung, entfernen Sie PBS aus den Gelen und fügen Sie 500 L B-Zellmedien (RPMI 1640, 10% dekomplementiertes fetales Kalbsserum, 1% Penicillin-Streptomycin, 2% Natriumpyruvat, 50uM Mercaptoethanol und 1x nicht essentielle Aminosäuren) hinzu und lassen sie RT auswerten.
2. Zellvorbereitung
   1. Reinigen Sie primäre B-Zellen aus Milz gemäß einem negativen Selektionsprotokoll (siehe Materialtabelle). Die typische endliche B-Zellausbeute beträgt etwa 1 x 10⁷ Zellen. Konzentrieren Sie dies auf 3 x 10⁶ Zellen/ml in B-Zellmedium (RPMI-1640 ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum, 1% Penicillin-Streptomycin, 0,1% Mercaptoethanol und 2% Natriumpyruvat).
   2. Zellen bei Bedarf bis zu 6 h bei 4 °C lagern.
   3. Halten Sie die Zellen 30 min vor der Bildaufnahme bei 37 °C.
3. Imaging
   1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit thermischer und (möglicherweise)_{CO2-Steuerung.}
      HINWEIS: Unabhängig davon, ob ein konfokales oder spinnförmiges Scheibenmikroskop verwendet wird, ist es wichtig, ein Objektiv/Pinloch zu verwenden, das es einer Pixelgröße <200 nm ermöglicht, die Perlen in der Analysephase bequem zu verfolgen (z. B. 60x, NA 1.3). Epifluoreszenzmikroskopie kann auch verwendet werden, bietet jedoch ein geringeres Signal-Rausch-Verhältnis und kann das individuelle Perlenverfolgung erschweren.
   2. Zwei Hauptschichten von Perlen erscheinen auf der Unterseite und der Oberseite des Gels. Konzentrieren Sie sich auf die Gelebene.
      HINWEIS: Ein schönes Gel erscheint als Sternenhimmel, mit Perlen, die ungefähr gleichmäßig auf der gleichen Ebene verteilt sind.
   3. Programmieren Sie die Erfassung für 30 min mit einer Bildrate von 5 s (dies ist anpassungsfähig an die Bedürfnisse des Experiments, z.B. andere Farben erwerben, z Stapel erwerben, etc.)
   4. Aspirieren Sie die Medien aus dem Gel, so dass etwa 200 l Medien auf dem Gel. Positionieren Sie das Gel auf dem Mikroskop und finden Sie die Oberflächenschicht der Perlen und einen schönen, gleichmäßigen Bereich auf dem Gel.
   5. Fügen Sie 80 L Zellen hinzu (vermeiden Sie das Berühren des Gels, um den Fokus zu erhalten).
   6. Stellen Sie sicher, dass der Fokus immer noch korrekt ist und dass Zellen im Bereich (unter durchdsestehendem Licht) absteigend zu sehen sind. Starten Sie die Erfassung, bevor die Zellen das Gel erreichen.
   7. Bei versehentlichem Kontakt mit Gel, Vibrationen oder Fokusdrift, stellen Sie den Fokus ein.
      HINWEIS: Es ist wichtig, ein Bild des entspannten Gels zu sammeln und dies kann jedes Bild sein, das vor der Ankunft der Zellen auf dem Gel aufgenommen wurde.

4. Fluoreszierendes HEL-Extraktionsexperiment

1. Bereiten Sie fluoreszierende HEL durch Bindung eines fluoreszierenden Farbstoffs (von einer Farbe anders als die Perlen eine wie Alexa 555), siehe die Tabelle der Materialien.
2. Ersetzen Sie in Schritt 2.7 herkömmliche SHEL durch den fluoreszierenden HEL.
3. Erfassen Sie Bilder mit niedriger Beleuchtungseinstellung oder niedriger Bildrate (z. B. 2 Bilder pro Minute), um Fotobleichungen zu vermeiden.
4. Um die HEL-Extraktion zu quantifizieren, berechnen Sie die über den Zellbereich integrierte Intensität für jeden Frame I(t) korrigiert und normalisiert durch die Intensität I(0) von Frame 0 nach der Formel:
   
   HINWEIS: Das mit einem Fluorophor konjugierte Antigen ist nicht sichtbar (wahrscheinlich aufgrund der Abschreckung des Fluorophors an der Geloberfläche), aber sein Vorhandensein auf dem Gel kann mit einem Anti-HEL und einem fluoreszierenden Sekundärantikörper überprüft werden. Es kann überprüft werden, dass das Fluorophor tatsächlich fluoreszierend ist, wenn es vom Gel mit einem mit Anti-HEL beschichteten Deckslip abgetrennt wird und es mit einem sekundären fluoreszierenden Antikörper (auf dem Deckschein)⁶offenbart. Das Signal des extrahierten Antigens ist sehr düster und wird manchmal durch Auslaufen der Perlen maskiert. Wenn man nur an der Antigenextraktion interessiert ist, wird empfohlen, das Gel ohne Perlen zuzubereiten (Schritte 1.3.2 und 1.4.3 überspringen).

5. Fluoreszenz-Bildgebung

1. Erhalten Sie fluoreszierende B-Zellen, indem Sie B-Zellen aus den Milz genetisch veränderter Mäuse reinigen, wie es für den Wildtyp (z. B. von Lifeact-GFP- oder Myosin-II-GFP-Mäusen) der Gelung der Tiere ist.
2. Verwenden Sie (wenn möglich) ein Spinnscheibenmikroskop mit einem Wassertauch-Langstreckenobjektiv von 40x–100x.
3. Halten Sie Belichtungsdauer und Bildrate niedrig, um Bleichen zu vermeiden.
   ANMERKUNG: Die Punktstreufunktion in Z wird durch das Vorhandensein des Gels stark abgebaut, daher empfehlen wir die Verwendung eines Wassertauchobjektivs. Die live-aufrechte Mikroskopie mit wassertauchenden Objektiven leidet unter starken sphärischen Aberrationen, die durch das Vorhandensein der (sphärischen) Zelle (und des Zellkerns) im Emissionspfad induziert werden.

6. Analyse

ANMERKUNG: Die Datenanalyse wird im Allgemeinen durchgeführt, indem zuerst der gesamte Stapel für Drift korrigiert wird, die Perlen in jedem Frame gefunden, ihre Bewegungen in Bezug auf einen Referenzrahmen (in Abwesenheit von Zellen) verfolgt, das Verschiebungsfeld interpoliert und das Problem invertiert wird, um die Spannung mit Fourier-Transformation²⁹zu erhalten. Zu diesem Zweck empfehlen wir die Verwendung einer Kombination aus ImageJ Macro und MATLAB Programmen, die von einem Online-Repository³⁰heruntergeladen werden können.

1. Öffnen Sie den Film in ImageJ als Bildstapel
2. Führen Sie das Makro "Crop_and_save.ijm" aus
   1. Wählen Sie die Bereiche von Interesse (ROI) mit dem Werkzeug "Rechteck" und fügen Sie sie der ROI-Liste mit der Taste "t" hinzu.
   2. Achten Sie beim Zuschneiden der Zelle darauf, einen Bereich mit mindestens 5–10 Pixeln unbeweglicher Perlen einzubeziehen. Schließen Sie Zellen aus, die zu nahe an den Grenzen oder an anderen Zellen liegen, aus der Analyse. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf 'OK'.
   3. Das Makro schlägt eine Maske der Zelle vor: Wenn dies zufriedenstellend ist, klicken Sie auf "OK". Wenn nicht zufriedenstellend, klicken Sie auf "Nicht ok" und wählen Sie dann manuell einen geschlossenen Bereich mit einem beliebigen Auswahlwerkzeug (z.B. "Freehand" oder "Oval") und klicken Sie auf "Weiter".
3. Öffnen Sie MATLAB und führen Sie "TFM_v1.m" aus.
   1. Eingabe der erforderlichen Parameter: Überprüfen Sie insbesondere die Bildeigenschaften (Pixelgröße, Erfassungsintervall) und die Geleigenschaften (Young Module E, Poisson-Verhältnis).
   2. Das Referenzbild ist standardmäßig das erste. Legen Sie ihn bei Bedarf auf einen anderen Frame fest, oder legen Sie es auf "0" fest, um eine externe Datei zu laden.
   3. Suchen Sie die Ausgaben der Software im selben Verzeichnis wie die Originaldatei (eine Beschreibung finden Sie in der User_notice.pdf Datei). Dazu gehört eine vorläufige Spur der Perlen ("FILENAME.fig"), eine Darstellung der kontraktilen Energie im Zeitverlauf ("FILENAME_energy.fig"), eine Tabelle mit mehreren über die Zelle integrierten Mengen (Energie, Fläche, Momente, etc.) "FILENAME_finaltable.mat", eine Struktur, die das Verschiebungs- und Kraftfeld, Filme der Perle, des Verdrängungsfeldes, der Spannung und der Energie enthält (die mit jedem Avi-Leser geöffnet werden können).
      HINWEIS: In den Eingabeparametern ist die "Fenstergröße" das Fenster, über das die Verschiebung interpoliert wird, daher die endgültige Auflösung des Spannungs- und Verschiebungsfeldes. Dies ist auf einige (standardmäßig vier) Pixel festgelegt. Es ist nicht ratsam, dies zu reduzieren, da dies die Auflösung künstlich erhöhen würde, indem Regionen interpoliert würden, in denen es keine Perlen gibt.

Results

Angesichts der Größe der Zellen sind Algorithmen, die die Verschiebungskarte der Perlen über korrelative Techniken (wie Partikelbildvelocimetrie) extrahieren, im Allgemeinen nicht sehr präzise. Je nach benötigtem Auflösungsgrad kann man jedoch mit einem kostenlosen Fiji/ImageJ Plugin^31,32leicht qualitative Ergebnisse erzielen. Während dieser Ansatz ausreicht, um stimulierende und nicht stimulierende Bedingungen zu vergleichen, empfehlen wir für eine gründliche Analyse die Verwendung unserer Software, die aus einem Online-Repository³⁰heruntergeladen werden kann, das die Perlen einzeln verfolgt und die Verschiebungsfeldkarte zu einem bestimmten Zeitpunkt als Interpolation der einzelnen Perlenverschiebungen³³angibt. An dieser Stelle sind mehrere Quantifizierungen möglich. Zum Beispiel (wenn man davon ausgeht, dass die Verschiebung nur durch Spannung tangential zur Geloberfläche verursacht wird) stellt die Software auch die Spannung an jedem Punkt bereit, der diese bestimmte Verschiebungskarte verursacht. Dies ist eine Art "Inversionsproblem": Die Verschiebung an einem bestimmten Punkt hängt von der Summe aller Kräfte ab, die über die anderen Punkte angewendet werden. Der "Inversionsalgorithmus" berücksichtigt die physikalischen Parameter des Substrats: seine Steifigkeit (Young Modulus) und das Poisson-Verhältnis. Direkte Algorithmen sind in der Regel sehr genau, aber rechnerisch teuer. Algorithmen, die auf Fourier-Transformation basieren, führen im Wesentlichen eine Dekonvolution im Fourier-Raum durch und sind effizienter, aber anfällig für einige Fehler (hauptsächlich aufgrund des Interpolationsschritts). Diese Algorithmen erfordern in der Regel die Abstimmung eines Parameters, der verhindert, dass kleine lokale (und potenziell artefaktische) Verschiebungen bei der Berechnung des Spannungsfeldes zu relevant werden (Tikhonov-Regularisierungsparameter^8,29; Variable "Regularisierung" im Dialogfenster; hier setzen wir in der Regel gleich 5 x 10^-19). Für eine fortgeschrittenere Interpretation und Analyse, wie z. B. räumlich-zeitliche Korrelationen, lokale Bewegungen, Korrelationen mit fluoreszierenden Kanälen, empfehlen wir die Zusammenarbeit mit Experten auf diesem Gebiet. Für einen Überblick über Rechenmethoden siehe Schwarz et al.⁹.

Wie oben erwähnt, sehen korrekte Perlenbilder wie ein "Sternenhimmel", eine gleichmäßige und zufällige Verteilung von hellen Flecken (Abbildung 2A). Daten und Analysen sind nicht zuverlässig, wenn die Anzahl der Perlen zu niedrig ist (Abbildung 2B) oder das Bild nicht fokussiert ist (Abbildung 2C). Sobald sich B-Zellen auf der Oberfläche des Gels niedergelassen haben, beginnen sich die Perlen unter den Zellen aufgrund der Zugkraft zu bewegen, die von der Zelle auf das Gel ausgeübt wird. Rahmen, für die die Perlen nicht nachvollziehbar sind, sollten verworfen werden.

Als Kontrolle ist es möglich, per Auge die Bewegung von Perlen zu beobachten, die den "Referenzrahmen" vergleichen, typischerweise den, der dem ersten Kontakt der Zelle mit dem Substrat vorausgeht. Ungefähre Ergebnisse können aus der Einzelpartikelverfolgung (z.B. Trackmate, Fidschi ³⁴) wie in Abbildung 3Aerzielt werden. Die Analyse liefert eine Segmentierung der Perlen im Referenzbild ("FILENAME.fig") als Steuerelement.

Mit der Software, die wir vorschlagen, kann man die Verschiebung (Abbildung 3B) und das Spannungsfeld (der Vektor der lokalen Spannung an jedem Pixel und jeden Zeitpunkt durch Inversion aus dem Verschiebungsfeld erhalten, Abbildung 3C) erhalten. Skalare Produkt der Verschiebung und Kraftfelder auf der Fläche der Zelle integriert bietet die Gesamtarbeit von der Zelle auf dem Substrat ausgeübt (Abbildung 4A). Diese Berechnung erfordert die Maske der Zelle, die in Schritt 6.2 des Protokolls eingeführt wurde.

Um zwei biologische Bedingungen (als Aktivierung von HEL im Vergleich zum nicht aktivierenden Substrat BSA oder Wildtyp im Vergleich zum Knock-out) zu vergleichen, ist es sinnvoll, die durchschnittliche Kurve (Abbildung 4B) oder, noch synthetischer, einen Durchschnittswert über die letzten Zeitpunkte (20 min) zu berechnen, wenn die Energie ein Plateau erreicht (Abbildung 4C). Wenn die räumlichen Informationen der Kräfte relevant sind, ist es möglich, einzelne Zeitpunkte jeder Bedingung zu vergleichen (Abbildung 4D). Weitere Informationen finden Sie unter Kumari et al.^6.

Ein Beispiel für Fluoreszenz-Antigenextraktions-Zeitraffer ist in Abbildung 5Adargestellt: das progressive Auftreten von Fluoreszenzsignalen an der Synapse, die auf Antigenablösung vom Gel angezeigt werden. Die durchschnittliche Extraktionskurve mit ihrem Konfidenzintervall (Standardfehler des Mittelwerts) über 15 Zellen ist in Abbildung 5Bdargestellt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Zubereitung des Gels und seiner Funktionalisierung. Die Schritte werden im Protokoll beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Drei Beispiele für Perlenbilder unterschiedlicher Qualitäten. (A) Beispiel für ein Perlenbild mit dem richtigen Signal-Rausch-Verhältnis und der richtigen Dichte. (B) Beispiele für Bilder mit einer zu unzureichenden Anzahl von Perlen und (C) ablätsgemäßer Ebene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Verarbeitung der Bilder zum Extrahieren des Kraftfeldes. (A) Beispiel für ein Bild der Perlen (Umriss der Zelle in Weiß, extrahiert aus dem Übertragungsbild), Perlenverfolgung zum Zeitpunkt t = 5 min (rote Überlagerung) und Verschiebung (Pfeile) relativ zur Zeit t = 0 min (Skala bar 5 m). (B) Interpoliertes Verschiebungsfeld (dargestellt als Vektorköcher und Magnitudenkarte, Pfeile sind proportional zur Verschiebung [nm]; siehe Farbleiste auf der rechten Seite); unten: ein glatteres Bild der Größe (durch Interpolation mit einer bikubischen Funktion erhalten). (C) Spannungsfeld aus dem Verschiebungsfeld in Panel B (dargestellt als Vektorköcher und Magnitudenkarte; Pfeile sind proportional zur Scherspannung [Pa]; siehe Farbleiste rechts); unten: ein glatteres Bild der Größe (durch Interpolation mit einer bikubischen Funktion erhalten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beispiel für Informationen, die aus Kraft- und Verschiebungsfeldern extrahiert werden können. (A) Beispiel für die zeitliche Entwicklung der Energie für eine einzelne Zelle: Eine Plateauphase (grau hervorgehoben) zeigt sich nach etwa 10 min. (B) Vergleich der durchschnittlichen Energiekurven und (C) der relativen Plateauwerte für 65 Zellen, die auf HEL (aktivierend) beschichtetes Gel und 35 Zellen auf BSA (nicht aktivierendes) beschichtetes Gel (median ± interquartilen Bereichen gezeigt werden), Mann-Whitney-Test wurde statistisch verwendet). (D) Zeitraffer-Farbkarten der Spannung für HEL und Kontrolle BSA Zustand; sowohl Größe als auch Köcherdiagramme werden angezeigt. Diese Bilder wurden von Kumari et al.⁶adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Beispiel für Experimente mit fluoreszierendem Antigen. (A) Zeitraffer der Extraktion von fluoreszierendem HEL (unten: Prozentsatz des Maximums, Skalenbalken = 3 m). (B) Antigensammeln im Laufe der Zeit (Mittelwert ± SEM, n = 15). Diese Bilder wurden von Kumari et al.⁶adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die hier beschriebene TFM-Methode ermöglicht die systematische Untersuchung der aktiven mechanischen Fähigkeiten von B-Zellen. Im Kontext von B-Zellen, Dies ist im Zusammenhang mit der Fähigkeit, das Antigen zu extrahieren und zu verinnerlichen. Im Vergleich zu anderen TFM-Methoden ist das hier vorgestellte Protokoll einfach und eher reproduzierbar: Die Steifigkeit, gemessen durch Einrückung einer Glasmikrosphäre und mit Hertz-Modell, liegt zwischen 400 und 600 Pa. Ähnliche Protokolle wurden erfolgreich nicht nur für B-Zellen^35, sondern auch für T-Zellen³⁶eingesetzt. Im Vergleich zu Nanosäulen (auch für T-Lymphozyten³⁷) bietet es eine flache homogene Oberfläche, daher sind die Ergebnisse leichter zu interpretieren, da die Wechselwirkung des Gels hauptsächlich darauf beschränkt ist, tangential zur Oberfläche zu sein.

Das von uns beschriebene Protokoll ermöglicht den Zugang zur räumlich-zeitlichen Dynamik der Kräfte, die von B-Zellen auf antigenpräsentierenden Substraten ausgeübt werden. Auf räumlicher Ebene liefert dies Informationen über die Lokalisierung von Kräften und ermöglicht es dem Experimentator in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie, lokale Kräfte mit der Anwesenheit spezifischer Moleküle (d. h. Komponenten des Zytoskeletts oder BCR-Signalkaskade) zu korrelieren. Auf der zeitlichen Ebene ist es möglich, Mengen (wie Gesamtenergie oder Gesamtspannung) zu integrieren, um einen Wert pro Zeitpunkt bereitzustellen und das Rauschen zu reduzieren. Dies ermöglicht die Beobachtung der Entwicklung der Zugkraft in der Zeit (Wachstum und Plateau) und das Vorhandensein von pulsatilen Mustern.

Kritische experimentelle Aspekte für die Analyse werden wie folgt beschrieben. i) Zelldichte: Um eine korrekte Analyse durchzuführen, sollten die Zellen ausreichend getrennt sein. Wir halten eine Zelle für analyzierbar, wenn sie eine leere Region ihrer eigenen Größe um sich herum hat. ii) Übertragungsbild: Es ist ratsam, während des Experiments mindestens ein Übertragungsbild der Zellen zu erfassen, das als Maske bei der Analyse verwendet werden soll. (iii) Anzahl der Perlen im Bild: Wir empfehlen, nur Bilder zu analysieren, bei denen die Anzahl der Perlen in der Synapse zwischen 30 und 200 liegt (d. h. 1–8 Perlen/m2). Niedrigere Dichten erlauben keine adäquate Rekonstruktion von Kartenverschiebungen. Hohe Beaddichten machen die Verfolgung einzelner Partikel unzuverlässig. iv) Die Anzahl der Perlen sollte während des Versuchs konstant sein; Schwankungen können jedoch aufgrund geringer Variabilität der bildgebenden Bedingungen auftreten (insbesondere in Perlen, die zu nah beieinander liegen). Fokusdrift, wenn auftreten, muss korrigiert werden und problematische Rahmen sollten verworfen werden. v) Gelqualität: Gele mit zu vielen Rissen, Variabilität in der Perlenverteilung oder zu dicke Gele sollten verworfen werden. vi) Je nach Zelltyp können Zellen nach wiederholten Expositionen zu späten Zeitpunkten (>300 Frames) phototoxische Wirkungen erleiden. Es ist ratsam, das Programm auf einer Maske ohne Zellen als "Baseline" auszuführen, die mit den Daten verglichen werden soll. Dies ergibt eine Größe des Geräuschpegels allein aufgrund der experimentellen Bedingungen.

Gele, die zur Messung der Zugkraft in der klassischen Haftung verwendet werden, ermöglichen die Untersuchung von Prozessen, die an der fokalen Haftung auftreten (Actin-Flows und Rekrutierung von Signalmolekülen) – die Punkte, an denen Kräfte angewendet werden^38,39. Kräfte an der Synapse werden jedoch nicht durch Fofokusadhäsionen angewendet. Das räumlich-zeitliche Muster der Krafterzeugung an der B-Zell-Immunsynapse wurde erst vor kurzem mit dieser Methode quantitativ untersucht. Mit TFM beobachteten wir zum ersten Mal, Kraftmusterung an der B-Zell-Immunsynapse, wie in unserer aktuellen Studie⁶vorgestellt, und eröffneten ermutigende Perspektiven in der Studie von Lymphozyten.

Insbesondere verwendet diese Methode ein Bild, das vor dem Eintreffen der Zellen auf dem Gel aufgenommen wurde, als Referenzbild für die Kraftberechnung. Übliche TFM-Protokolle schlagen vor, das Referenzbild am Ende des Experiments zu nehmen, nachdem die Zellen mit Trypsin abgelöst wurden; Dadurch kann der Experimentator nach einer zellereichen Region suchen. Obwohl dies auch hier möglich ist, ist Trypsin eher ineffizient, wenn es darum geht, B-Zellen von antigenbeschichtetem Gel zu lösen, man muss lange auf die Ablösung warten und das Risiko von Gelmodifikationen und -bewegungen (die den gesamten Datensatz unausnutzbar machen) ist höher.

Die hier vorgestellte Methode ist flexibel und kann angewendet werden, um die Wirkung anderer Signale an der Immunsynapse zu untersuchen, da sie die Transplantation anderer Proteine auf die Geloberfläche (z. B. Integrinligaden und Immunglobuline wurden getestet) und sogar fluoreszierendes Antigen (siehe Abschnitt 4) ermöglicht. Darüber hinaus bleiben Zellen für den Experimentator für die medikamentöse Behandlung und lokale Störungen zugänglich. Schließlich ist die Methode auch mit der Abbildung fester Zellen kompatibel. Für diese Beobachtungen wird empfohlen, das Gel auf einem Deckelrutsch zu machen, die Zellen zu färben, den Deckelschlupf auf einem Dia zu kleben und erst dann Montagemedien und einen weiteren Deckschein hinzuzufügen. Die Beobachtung erfolgt dann mit dem Gel oben, um den Abbau des Bildes durch das Gel zu vermeiden.

Mögliche Fallstricke sind die Variabilität des Gels in Polymerisation und Beschichtung. Polymerisationsprobleme sind hauptsächlich auf die Qualität des Initiators/Katalysators zurückzuführen. Auch kann das Gel aufblasen, vor allem, wenn nicht direkt nach der Montage verwendet. Dieses Problem scheint die mechanischen Eigenschaften des Gels nicht dramatisch zu beeinflussen, aber es kann die Perlenschicht für das Ziel unerreichbar machen und das Gel effektiv nutzlos machen. Wir empfehlen, zusätzliche Gele für jede Bedingung vorzubereiten, wenn dieses Problem auftritt. Es kann auch eine gewisse Variabilität in der Beschichtung geben, und es ist wichtig, sulfo SANPAH frisch verdünnt zu haben.

Abschließend haben wir eine einfache, billige und reproduzierbare Methode beschrieben, um die von B-Zellen ausgeübten Kräfte an der immunologischen Synapse zu messen, wenn sie durch BCR-Ligand aktiviert werden. Es kann angepasst werden, um die Reaktion auf andere Liganden und andere Arten von Lymphozyten (Speicher-B-Zellen, T-Zellen, etc.) mit der Verwendung des richtigen Rezeptor-Ligand zu studieren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS)	Sigma-Aldrich	281778	Aliquotiert lagern, vor Feuchtigkeit geschützt
40% Acrylamidlösung	Biorad	1610140
Alexa555 Mikroskaliges Proteinmarkierungskit	Molekulare Sonden	A30007
Ammoniumpersulfat (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
B-Zellisolationskit, Maus	Miltenyi Biotec	130-090-862
B-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010
2% Bis Lösung	Biorad	161-0142
Rinderserum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100-812-C
Deckglas 18mm	VWR	631-1580
Fötales Kälberserum	PAA	A15-151	Dekomplementär (40min @56° C)
Fluorodishes FD35	World Precision Instruments, Inc	FD35100
Fluosphäre: Carboxylat-modifiziert, 0,2 μm, dunkelrot	Molekulare Sonden	F8807
Hühnerei Lysozym	Sigma-Aldrich	L6876	Gelagert in Aliquote 100 mg/ml
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung (100X)	Thermofisher/Gibco	11140035
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammin (TEMED)	Euromedex	50406-B
PBS (Phosfatpuffer Kochsalzlösung)	Gibco	10010-015
Penicillin– Streptomycin	Gibco	15140-010
RMPI 1640 – Glutamax I	Thermofisher	61870-010
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2
Natriumpyruvat	Gibco	11360-039
Sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat (Sulfo-SANPAH)	Thermo Scientific	22589