Methodenartikel

In Vitro Modell der menschlichen kutanen hypertrophen Narbenbildung mit makromolekularer Crowding

DOI:

10.3791/61037

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1. Mai 2020

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1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von makromolekularem Crowding, um ein in vitro menschliches hypertrophes Narbengewebemodell zu erstellen, das in vivo-Bedingungen ähnelt. Wenn sie in einer überfüllten makromolekularen Umgebung kultiviert werden, weisen menschliche Hautfibroblasten Phänotypen, Biochemie, Physiologie und funktionelle Eigenschaften auf, die Narbengewebe ähneln.

Zusammenfassung

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Es hat sich gezeigt, dass In-vivo-Gewebe stark von Proteinen, Nukleinsäuren, Ribonukleoproteinen, Polysacchariden usw. überfüllt sind. Das folgende Protokoll wendet eine makromolekulare Crowding-Technik (MMC) an, um diese physiologische Verdrängung durch die Zugabe von neutralen Polymeren (Crowdern) zu Zellkulturen in vitro nachzuahmen. Frühere Studien mit Ficoll oder Dextran als Crowder zeigen, dass die Expression von Kollagen I und Fibronectin in WI38 und WS-1 Zelllinien mit der MMC-Technik deutlich verbessert werden. Diese Technik wurde jedoch nicht bei primären hypertrophen Narben-abgeleiteten menschlichen Hautfibroblasten (hHSFs) validiert. Da hypertrophe Narbenbildung aus der übermäßigen Ablagerung von Kollagen entsteht, zielt dieses Protokoll darauf ab, ein kollagenreiches in vitro hypertrophes Narbenmodell zu konstruieren, indem die MMC-Technik mit hHSFs angewendet wird. Dieses optimierte MMC-Modell hat nachweislich mehr Ähnlichkeiten mit in vivo Narbengewebe als herkömmliche 2-dimensionale (2-D) Zellkultursysteme. Darüber hinaus ist es im Vergleich zu Tiermodellen kostengünstig, zeiteffizient und ethisch wünschenswert. Daher bietet das hier beschriebene optimierte Modell ein fortschrittliches "in vivo-ähnliches" Modell für hypertrophe Narbenstudien.

Einleitung

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Narbengewebe stellt den Endpunkt der Gewebereparatur dar. Jedoch, bei vielen Personen, vor allem diejenigen, die an Verbrennungen oder Trauma1leiden, Narbenbildung kann übermäßig sein und unerwünschte Auswirkungen auf die Morphologie und Funktion der geheilten Haut. Obwohl die genauen Mechanismen der pathologischen (hypertrophen Narben und Keloide) Narbenbildung nicht vollständig verstanden werden, hat sich gezeigt, dass übermäßige Ablagerung von Kollagen während der Wundheilung ein wesentlicher Beitrag2ist.

Es ist allgemein bekannt, dass die Transformation des Wachstumsfaktors Beta 1 (TGF-1) und alpha-glatter Muskelaktin (SMA) eine Schlüsselrolle bei der Bildung von hypertrophen Narben spielen. Es gibt Hinweise darauf, dass erhöhte TGF-Nr. 1 direkt die übermäßige Ablagerung von Kollagen durch Regulierung des SMAD-Signalwegs3stimuliert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass SMA zur hypertrophen Narbenbildung beiträgt, indem die Zellkontraktion und Reepithelisierung im Wundheilungsprozess reguliertwird 4. Das Fehlen geeigneter In-vitro- und In-vivo-Modelle ist ein großes Hindernis für die Entwicklung und Bewertung von Interventionen und Therapien zur Narbensanierung. Ziel dieser Studie ist es, die bestehende MMC-Technik zu nutzen, um ein "in vivo-ähnliches" hypertrophes Narbenmodell zu konstruieren, das sich für die Bewertung neuartiger und aufkommender Narbeninterventionen eignet.

Die Reproduktion von lebendem Gewebe außerhalb des Körpers ist seit Jahren ein Ziel in der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Mit der Entwicklung von In-vitro-Techniken im frühen 20. Jahrhundert wurde dieses Ziel teilweise erreicht. Aktuelle In-vitro-Techniken haben sich leicht aus Roux' ursprünglicher Demonstration entwickelt, dass embryonale Zellen ex vivo für mehrere Tage in warmer Saline überleben können5. In-vitro-Methoden sind jedoch meist auf Einzelzelltypen beschränkt, die in 2D kultiviert werden, und rekapitulieren Gewebe in vivo nicht genau. Während nützlich für die Untersuchung der Zellbiochemie, Physiologie, und Genetik, native Gewebe sind 3-D und enthalten mehrere Zelltypen. Einfache 2-D-In-vitro-Systeme unterwerfen Säugetierzellen hochgradig künstlichen Umgebungen, in denen die native gewebespezifische Architektur verloren geht6. Dies wiederum wirkt sich auf intrazelluläre und extrazelluläre Ereignisse aus, was zu abnormaler Zellmorphologie, Physiologie undVerhalten7 führt.

Das Interesse hinter diesem Protokoll liegt in der Entwicklung und dem klinischen Management von hypertrophen Narben und Keloiden. Während es allgemein bekannt ist, dass dermale Fibroblasten in hohem Maße für die reichliche Produktion von Kollagen enden, die im Narbengewebe vorhanden sind, gelingt es bei der Kultivierung dermaler Fibroblasten mit 2-D-In-vitro-Systemen nicht, den Umsatz von Kollagen zu reproduzieren, das in vivo8beobachtet wurde. Zeitgenössische In-vitro-Methoden verwenden nach wie vor im Wesentlichen "warme Saline", eine Umgebung, die sich völlig von der in lebenden Geweben unterscheidet. Gewebe in vivo sind extrem überfüllt, mit Proteinen, Nukleinsäuren, Ribonukleoproteinen und Polysacchariden, die 5% –40% des Gesamtvolumens einnehmen. Da keine zwei Moleküle den gleichen Raum gleichzeitig einnehmen können, gibt es wenig freien Raum und eine fast vollständige Abwesenheit von freiem Wasser9.

Die MMC-Technik setzt Einschränkungen auf, die die thermodynamischen Eigenschaften von Zytosol und interstitiellen Flüssigkeiten beeinflussen. Molekulare Wechselwirkungen, Rezeptor-Ligand-Signalkomplexe, Enzyme und Organellen sind beschränkt und von der freien Interaktion eingeschränkt9. Wechselwirkungen innerhalb der perizellulären Umgebung (d. h. Interstitium) sind ebenfalls eingeschränkt. Jüngste Erkenntnisse bestätigen, dass hohe Konzentrationen von inerten Makromolekülen in überfüllten Lösungen Diffusion, physikalische Assoziation, Viskosität und hydrodynamische Eigenschaften stören10.

Interessanterweise sind mehrere beliebte Crowding-Agenten (z.B. Ficoll, Dextran, Polyvinylpyrrolidon [PVP] und Natrium 4-Styrenesulfonat [PSS]) nicht gleichwertig, wenn sie auf verschiedene Zelltypen und in unterschiedlichen Einstellungen angewendet werden. In einer früheren Studie, Ficoll wurde berichtet, dass weniger zytotoxisch für mesenchymale Stammzellen im Vergleich zu PVP. Diese Ergebnisse wurden als Folge ihrer neutralen Ladung und des relativ kleinen hydrodynamischen Radius11interpretiert. Im Gegensatz dazu ergab eine zweite Studie, dass Dextran effektiver bei der Stimulierung der Kollagen-I-Abscheidung durch menschliche Lungenfibroblasten im Vergleich zu Ficoll12ist. Daten aus unserer eigenen Studie deuten darauf hin, dass Ficoll die Kollagenablagerung durch hypertrophe Narbe-abgeleitete Fibroblasten verbessert, während PVP für diese Zellen toxisch ist13.

Es wurde gezeigt, dass die Umwandlung von Prokollagen zu Kollagen in einer stark überfüllten in vivo Umgebung14schneller ist, während die Rate der biologischen Reaktionen in einem verdünnten 2D-Kultursystem verzögert wird15. Wir haben hier das In-vitro-Protokoll optimiert und MMC integriert, um die Kultivierung von dermalen Fibroblasten zu zeigen, die als "in vivo-ähnliches" Modell für dermale Fibrose und Narbenbildung dienen. Im Gegensatz zum gemeinsamen 2-D-Kultursystem stimuliert die Kultivierung von hHSFs mit MMC die Biosynthese und Ablagerung von Kollagen signifikant13. Insbesondere sind unter diesem optimierten MMC-Protokoll13auch andere Merkmale der Fibrose (d.h. erhöhte Expression von Matrixmetalloproteinasen [MMPs] und proinflammatorischen Zytokinen) zu erkennen. Bei der Kultivieren mit dieser Methode wird gezeigt, dass dermale Zellen die physiologischen, biochemischen und funktionellen Parameter rekapitulieren, die in vivo gemessen werden.

Das optimierte MMC-In-vitro-Protokoll wurde verwendet, um die Expression von Kollagen und anderen ECM-Proteinen durch dermale Fibroblasten zu bewerten, die aus hypertrophen Narbendermisen und unbeteiligten angrenzenden Dermis isoliert wurden. Bei der Kultiviertheit in MMC-Umgebungen in vitro wurde beobachtet, dass hHSFs bestimmte Eigenschaften (z. B. mRNA, Biochemie, Physiologie und Phänotyp) ähnlich wie dermale hypertrophe Narbengewebe in vivo exprimieren. Die Beweise deuten darauf hin, dass physikalische und chemische Eigenschaften wichtige Überlegungen bei der Auswahl von Crowdern und der Optimierung der MMC-Bedingungen für den Anbau in vitro sind.

Zum Proof-of-Prinzip wird hier das MMC-Protokoll angewendet, um die Fähigkeit von Shikonin und seinen Analoga, Apoptose zu induzieren, qualitativ und quantitativ zu bewerten. Dies ermöglicht die Bewertung der möglichen Anwendungen dieser natürlich abgeleiteten traditionellen chinesischen Medizin (TCM) Verbindungen für die Verwaltung dermal Narben13. Ungeachtet der Einfachheit, Kostenwirksamkeit und Aktualität dieses In-vitro-MMC-Protokolls erfüllt es auch die jüngsten Vorschriften zur Beseitigung von Säugetierexperimenten durch die EU-Richtlinie 2010/63/EU und die US-Umweltbehörde EPA.

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Protokoll

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1. Zellkultur

  1. Bewahren Sie hHSFs und normale dermale Fibroblasten aus nichtpathologischem Gewebe (hNSFs) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) auf, das 10% fetales Kalbsserum (FCS) und 1% v/v Penicillin/Streptomycin-Lösung (P/S) bei 37°C in einem Inkubator mit 5%CO2/95%Luft enthält.
  2. Kaufen Sie Ficoll 70, Ficoll 400 und Ascorbinsäure von den entsprechenden Unternehmen.

2. Konstruktion des hypertrophen Narbenmodells MMC

  1. Säen Sie die hHSFs oder hNSFs (50.000/well) in eine 24 Wellplatte, die 1 ml Medien in jedem Brunnen enthält.
  2. In einem 37°C-Inkubator bei 5%CO2 platzieren und über Nacht verlassen.
  3. Bereiten Sie die MMC-Medien vor. Basierend auf dem für das Experiment erforderlichen Gesamtvolumen erzeugen Sie 10% FCS/DMEM-Medien durch Mischen von Ficoll 70 (18,75 mg/ml), Ficoll 400 (12,5 mg/ml) und Ascorbinsäure (100 m).
  4. Legen Sie das Gemisch 1 h in ein 37°C-Wasserbad, um die Crowder in die Lösung zu zerstreuen, und sterilisieren Sie dann die MMC-Medien mit einem 0,2 m-Filter.
  5. Aspirieren Sie die verbrauchten Medien und ersetzen Sie durch die frisch gemachten MMC-Medien.
  6. Inkubieren Sie die Zellen für 6 Tage bei 37°C und 5%CO2, und wechseln Sie alle 3 Tage die Medien.

3. Ausdruck der Gesamtmenge an Kollagen

  1. Bereiten Sie Sirius rote Lösung (0,1% w/v). 0,2 g Direct Red 80 Pulver in 200 ml destilliertem entionisiertem Wasser (ddH2O) mit 1 ml Essigsäure auflösen.
  2. Aspirieren Sie die MMC-Medien und fügen Sie 300 L Sirius Red Lösung in jedem Brunnen. Bei 37 °C 90 min inkubieren.
  3. Spülen Sie die Sirius Red-Lösung vorsichtig mit Leitungswasser ab und lassen Sie die Platte über Nacht lufttrocknen.
  4. Extrahieren Sie den Sirius Red Fleck, indem Sie jedem Brunnen 200 l Natriumhydroxid (0,1 M) hinzufügen. Legen Sie die Platte für 5–10 min auf einen Orbital-Shaker, um den Sirius Red-Fleck vollständig zu extrahieren.
  5. Übertragen Sie 100 l des extrahierten Sirius Red Flecks in eine gut transparente 96-Platte und messen Sie die Absorption bei 620 nm mit einem Mikroplattenleser.

4. Expression von Kollagen I (Immunostainierung)

  1. Waschen Sie die Brunnen mit 200 l Phosphat-gepufferter Saline (PBS, pH = 7,35).
  2. Fixieren Sie die Zellen mit Methanol (500 l/Well) bei 4 °C für 10 min.
  3. Blockieren Sie unspezifische Wechselwirkungen mit 3% Rinderserumalbumin für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
  4. Aspirieren Sie die Blockierlösung und inkubieren Sie mit 200 l Anti-Kollagen-I-Antikörper (10 g/ml) für 90 min bei RT.
  5. Den primären Antikörper ansaugen und 3x mit PBS für jeweils 5 min waschen.
  6. Inkubieren Sie mit 200 l Ziegenanti-Rabbit-FITC-Sekundärantikörper (1:400 Verdünnung) und 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI; 1: 2000 Verdünnung) für 30 min bei RT. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie.
  7. Entsorgen Sie sowohl den sekundären Antikörper als auch DAPI und waschen Sie 3x mit PBS für jeweils 5 min.
  8. Visualisieren Sie die Fluoreszenzfärbung direkt unter dem Mikroskop.

5. WestlicheS Blotting

  1. Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS.
  2. Fügen Sie in jedem Brunnen 40 L Lysepuffer hinzu und kratzen Sie die Zellschicht mit einer Pipettenspitze. Der Lysepuffer enthält RIPA-Puffer, Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC), 2 mM Natriumvanadate und 10 mM Natriumfluorid.
  3. Übertragen Sie das Proteinlysat in Mikrozentrifugenröhrchen und messen Sie die Proteinkonzentration anhand eines Protein-Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers16.
  4. Laden Sie 10 g Protein jeder Gruppe in die Brunnen von 4%–12% Bis-Tris Proteingelen. Führen Sie Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bei 200 V 30 min durchführen.
  5. Übertragen Sie das Protein auf die Nitrocellulosemembran, indem Sie 90 min einen westlichen Blot bei 90 V laufen lassen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen zwischen Gel und Nitrocellulosemembran.
  6. Blockieren Sie die Membran mit 10 ml Sperrpuffer.
  7. Mit primärer Antikörper n 4°C über Nacht inkubieren. Primäre Antikörper sind: Antikollagen I, Antikollagen III, Antikollagen IV, Anti-SMA, Anti-MMP-1, Anti-MMP-2, Anti-MMP-9, Anti-MMP-13 und Anti-Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH).
  8. Waschen Sie die Membran mit 0,1% TBS-Tween 20 (5x für je 5 min). TBS/Tween 20 (1 L) enthält folgendes: 50 ml von 1 M Tris (pH = 7,4), 30 ml 5 M Natriumchlorid, 1 ml Tween 20 und 920 ml ddH2O.
  9. Mit einer artgeeigneten Sekundärantikörper bei RT für 1 h inkubieren.
  10. Wiederholen Sie Schritt 5.8 und visualisieren Sie die Fluoreszenz mit einem Bildgebungssystem.

6. RT-PCR

  1. Sammeln Sie die gesamte RNA mit dem Lysepuffer gemischt mit 2-Mercaptoethanol, die im RNA-Extraktions-Assay-Kit enthalten sind.
  2. Reinigen Sie die RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers17.
  3. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer.
  4. Führen Sie die cDNA-Synthese des ersten Strangs mit einem cDNA-Synthesekit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  5. RT-PCR Oligonukleotid-Primer sind in kundenspezifischen 96 Wellplatten erhältlich (vorbeschichtet). Mischen Sie 100 ng der cDNA-Proben mit 10 l SYBR-Grün-Supermix in die kundenspezifische Platte.
  6. Erhöhen Sie das Gesamtvolumen mit ddH2O auf 20 l/well.
  7. Führen Sie RT-PCR mit einem Thermocycler nach den Anweisungen des Herstellers: 40 Zyklen Denaturierung bei 98°C für 15 s und Glühen/Verlängerung bei 60 °C für 60 s. Zu den in RT-PCR getesteten Genen gehören: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 und VEGF.

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Ergebnisse

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In jedem Experiment wurden dreifache Proben durchgeführt, und jedes Experiment wurde 3x mit Zellen von drei einzelnen Patienten wiederholt. Die Daten werden als Prozentsätze der Kontrollgruppe ausgedrückt. Einweg-ANOVA und Tukeys Post-hoc-Test wurden zur Analyse statistischer Unterschiede (*p n 0,05) angewendet.

MMC mit Ficoll bei 9% FVO (Fractional Volume Occupancy) erhöht die Gesamtmenge an Kollagen und Kollagen I Ablagerung in hHSF13. Wie in

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Diskussion

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Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein verbessertes In-vitro-Modell von :scar-in-a-jar für menschliches Kutanennarbengewebe zu optimieren und zu authentifizieren. Frühere Studien haben die Anwendung der MMC-Technik auf menschliche Lungen-Fibroblasten12, menschliche Knochenmark mesenchymale Stammzellen23und menschliche dermale Fibroblasten23 mit Dextran12, Ficoll12und PVP23 als Cro...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Singapurer Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" und der "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 unterstützt. Die Autoren danken Ihnen bei Dr. Paula Benny und Dr. Michael Raghunath.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 μ m filterSartorius16534
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificP36962
Alexa Fluor 680Thermo Fisher ScientificA-21076
Alexa Fluor 800Thermo Fisher ScientificA-11371
Alpha-Aktin-Primärantikörper der glatten Muskulatur (αSMA)Abcamab5694
Applied Biosystems 7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System (Thermocycler) ThermoFisher Scientific4351106
AscorbinsäureWako#013-12061
RinderserumalbuminSigma-Aldrich#A2153
Bradford-Protein-AssayBio-Rad500-0006
Kollagen I Primärantikörper (für die Immunfärbung)Abcam6308
Kollagen I Primärantikörper (für Western Blot)Abcamab21286
Kollagen III PrimärantikörperAbcamab7778
Kollagen IV PrimärantikörperAbcamab6586
Direct Red 80Sigma-Aldrich2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies11996-065
Fötales Kälberserum (FCS)Life Technologies6000-044
Ficoll 400GE HealthCare#17-0300-10
Ficoll 70GE HealthCare#17-0310-10
GAPDH primärer AntikörperSigma-AldrichG8795
Ziege Anti-Kaninchen SekundärantikörperAbcamab97050
Humane hypertrophe Narbe/normale Fibroblasten (hHSF/hNSF)Cell Research Corporation106, 107, 108
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad#1708890
MMP-1 PrimärantikörperAbcamab38929
MMP-13 PrimärantikörperAbcamab39012
MMP-2 PrimärantikörperAbcamab37150
MMP-9 PrimärantikörperAbcamab38898
NanoDrop Mikrovolumen-SpektralphotometerThermo Fisher ScientificN/A
NitrozellulosemembranBio-Rad10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GeleThermo Fisher ScientificNP0321BOX
Odyssey Blocking-PufferLI-COR Biosciences927– 40000
Odyssey Fc Imaging SystemLI-COR BiosciencesN/A
Olympus IX-81 HCS Mikroskop (für Immunfärbung)OlympusN/A
Penicillin/Streptomycin-Lösung (P/S)Life Technologies15140-122
PrimePCR AssaysBio-RadKundenspezifische Primer, vorbeschichtet in 96-Well-Platten, je nach Bedarf
Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC)Sigma-Aldrich11697498001
PVP 360Sigma#PVP360
PVP 40Sigma#PVP40 RIPA-Puffer
MerckR0278
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN#74134
NatriumvanadatSigma-Aldrich450022
Natrium vanadatSigma-Aldrich450243
SpectraMax M5 Multi-Mode Mikroplatten-ReaderMolecular DevicesN/A
SsoAdvanced universal SYBR grün supermixBio-Rad#172-5270
Tween 20Sigma-AldrichP9416

Referenzen

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