Summary
Præsenteret her er en protokol, der beskriver overvågning af hele livscyklus aggressiv bakterie Bdellovibrio bakterien ved hjælp af time-lapse fluorescens mikroskopi i kombination med en agarose pad og celle-imaging retter.
Abstract
Bdellovibrio bacteriovorus er en lille gram-negativ, forpligte aggressiv bakterie, der dræber andre gram-negative bakterier, herunder skadelige patogener. Derfor er det betragtes som et levende antibiotikum. At anvende B. bacteriovorus som et levende antibiotikum, er det først nødvendigt at forstå de store faser af sin komplekse livscyklus, især dens spredning inde bytte. Hidtil har det været udfordrende at overvåge på hinanden følgende stadier af aggressiv livscyklus i realtid. Præsenteret her er en omfattende protokol for real-time billeddannelse af hele livscyklus B. bacteriovorus, især under sin vækst inde i værten. Til dette formål anvendes et system bestående af en agarosepude i kombination med cellebilleddannelsesretter, hvor de rovfugleceller kan bevæge sig frit under agarosepuden, mens immobiliserede bytteceller er i stand til at danne bdelloplasts. Anvendelsen af en stamme, der frembliker en fluorescerende mærket β-underenhed af DNA polymerase III yderligere gør det muligt kromosom replikation, der skal overvåges i reproduktionsfasen af B. bakteriens livscyklus.
Introduction
Bdellovibrio bacteriovorus er en lille (0,3-0,5 μm med 0,5-1,4 μm) gram-negativ bakterie, der udnytter andre gram-negative bakterier, herunder skadelige patogener såsom Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, og Shigella flexneri1,2,3. Da B. bacteriovorus dræber patogener, det betragtes som en potentiel levende antibiotikum, der kan anvendes til bekæmpelse af bakterielle infektioner, især dem forårsaget af multiresistente stammer.
B. bacteriovorus udviser en ejendommelig livscyklus bestående af to faser: en fritlevende ikke-replikeret angrebsfase og en intracellulær forplantningsfase (Figur 1). I den fritlevende fase søger denne meget motile bakterie, som bevæger sig med hastigheder på op til 160 μm/s, efter sit bytte. Efter fastgørelse til byttets ydre membran kommer den ind i periplasmen4,5. I den interperiplasmiske forplantningsfase bruger B. bacteriovorus et væld af hydrolytiske enzymer til at nedbryde værtens makromolekyler og genbruge dem til sin egen vækst. Kort efter at invadere periplasma, værtscellen dør og oppustethed i en sfærisk struktur kaldet en bdelloplast, inden for hvilken den aggressiv celle forlænger og replikerer sine kromosomer. Replikeringsprocessen starter ved replikeringsstarten (oriC)6 og fortsætter, indtil flere kopier af kromosomet er blevet fuldstændig syntetiseret7. Interessant, replikation af hvert kromosom er ikke efterfulgt af celledeling. I stedet rovdyrlanger til at danne en lang, multinucleoid og filamentous celle. Ved næringsstofudtynding gennemgår glødetråden synkron septation, og afkomceller frigives fra bdelloplast8.
Før B. bacteriovorus kan bruges som et levende antibiotikum mod bakterielle infektioner, er det afgørende at forstå de store faser af sin livscyklus, især dem, der vedrører dens spredning inde i byttet. Live-celle billeddannelse af B. bacteriovorus har været udfordrende, på grund af de forskellige morfologiske former for rovdyr og dets bytte i den komplekse livscyklus. Hidtil har samspillet mellem B. bacteriovorus og dens værtscelle er hovedsageligt blevet undersøgt ved elektronmikroskopi og snap-shot analyse2,9,10, som begge har begrænsninger, især når de bruges til at overvåge på hinanden følgende stadier af aggressiv livscyklus. Disse metoder giver billeder i høj opløsning af B. bacteriovorus celler og muliggøre observation af et lille rovdyr under angrebet eller vækstfasen. Men, de tillader ikke sporing af enkelt B. bakteriovorus celler i begge livscyklus faser.
Præsenteret her er en omfattende protokol for brug af time-lapse fluorescens mikroskopi (TLFM) til at overvåge hele livscyklus B. bacteriovorus. Et system bestående af en agarosepude anvendes i kombination med en cellebilledskål, hvor de rovfugleceller kan bevæge sig frit under agarosepuden, mens de immobiliserede bytteceller er i stand til at danne bdelloplasts (Figur 2). Denne opsætning er udarbejdet på grundlag af specifikke stammer af både E. coli og B. bacteriovorus, men protokollen kan let ændres, så den passer til en brugers individuelle stammer (f.eks med forskellige udvælgelsesmarkører, proteiner sammensmeltet med forskellige fluorophores osv.).
I dette tilfælde, at visualisere B. bacteriovorus under angrebet fase, en bestemt stamme (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) blev konstrueret, der udtrykker en fluorescerende mærket version af cytoplasmatisk protein, PilZ (tilgængelig i vores laboratorium efter anmodning)7. Denne stamme desuden producerer DnaN (β-glidende klemme), en underenhed af DNA polymerase III holoenzym, fusioneret med en fluorescerende protein. Dette gør det muligt løbende DNA replikation, der skal overvåges inde i aggressiv celler, som de vokser inden for bdelloplasts.
Selv om den beskrevne protokol og software, der anvendes til billederhvervelse, henviser til et omvendt mikroskop fra en bestemt producent (se Tabelover Materialer), kan denne teknik justeres for ethvert omvendt mikroskop, der er udstyret med et miljøkammer eller en anden ekstern varmeholder, og som kan foretage time-lapse-billeddannelse. Til dataanalyse kan brugerne vælge tilgængelig software, der er kompatibel med de enkelte outputformater.
Figur 1: B. bacteriovorus livscyklus i E. coli som værtscelle. Under angrebet fase, en fri-svømning B. bacteriovorus celle søger efter og tillægger en vært E. coli celle. Efter invasionen bliver den rovcelle lokaliseret i byttets periplasme, hvilket ændrer værtscellens form og danner en bdelloplast. Den reproduktive fase starter med bdelloplast dannelse. Den aggressiv celle fordøjer byttecellen og genbruger simple forbindelser til at bygge sine egne strukturer. B. bacteriovorus vokser som en lang enkelt glødetråd inde i værtens periplasm. Når byttecellens ressourcer er opbrugt, b. bakterienus glødetråd synkront septater og danner afkom celler. Efter afkomceller udvikle deres flagella, de lyse bdelloplast. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Præparat af B. bakterieiovorus lysat til mikroskopisk analyse
- I en 250 ml kolbe skal coculture ved at kombinere 1 ml frisk 24 h B. bakterieiovoruskultur (f.eks. E. coli S17-1 pZMR100) med 50 ml Ca-HEPES buffer (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7.6]) suppleret med antibiotika, når det er nødvendigt (her, 50 μg/mL kanamycin).
- Kolbonnende i 24 timer ved 30 °C med omrystning ved 200 omdrejninger.
- Kontroller, at byttecellerne er fuldt lyset af væskemonteret fasekontrastmikroskopi. På dette tidspunkt bør der være adskillige motile angrebsfase B. bakterielvorusceller til stede, og ingen E. coli-celle eller bdelloplast bør være synlige.
- B. bakteriekulturen filtreres gennem et 0,45 μm porestørrelsesfilter for at fjerne eventuelle resterende værtsceller. Rovdyrceller (0,3-0,5 μm x 0,5-1,4 μm) trænger frit ind i 0,45 μm porer, mens værtsceller tilbageholdes på filteroverfladen.
- Drej filtratet ned i 20 minutter ved 2469 x g og 30°C i et 50 ml konisk rør for at indsamle rovceller. Opspræn den B. bacteriovorus pellet i 3 ml Ca-HEPES buffer (til en endelig OD600 på ca 0,2) og inkuberes ved 30 °C og 200 rpm i 30 min.
2. Forberedelse af værtsceller til B. bakterieop invasion
- Brug en enkelt koloni af værtsstammen(E. coli S17-1 pZMR100 anbefales på grund af forskellige cellestørrelser, der resulterer i dannelsen af ulige størrelse bdelloplasts) til at inokulere 10 ml YT-medium (0,8% Bacto tryptone, 0,5% gær ekstrakt, 0,5% NaCl [pH = 7,5]), der er blevet suppleret med antibiotika, hvis det er nødvendigt (her, 50 μg/ml kanamycin). Kulturceller natten over ved 37 °C og 180 omdr./min.
- Overfør 2 ml overnight E. coli-kultur (OD600 af ~3,0) til et 2 ml reagensglas og centrifuge ved stuetemperatur (RT) og 2469 x g i 5 min. Opspærret pellet i 200 μL Ca-HEPES buffer.
3. Opsætning af mikroskopet (se Materialetabel)
- Forvarm et mikroskopisk kammer med et 100x olienedsænkningsmål til 30 °C i mindst 1 time før brug. Dette trin er nødvendigt for at forhindre fejl i opretholdelsen af fokus under eksperimentet.
- Tænd både mikroskopet og mikroskopiautomatiseringen. Initialiser kontrolsoftwaren, og vælg de relevante filtre for at anskaffe brightfield/DIC/phase-contrast og fluorescensbilleder efter behov (her: BF-billeder, GFP/mCherry polykromfilter og emission/excitation for mCherry og GFP).
4. Samling af layout til time-lapse fluorescens mikroskopi
- Bland 200 mg lav fluorescerende molekylær kvalitet agarose med 20 ml Ca-HEPES buffer (1% endelig agarose koncentration) og opløses agarose i en mikrobølgeovn. Partiet kan genbruges flere gange, efter at det størkner, så gentag blot varmetrinnet.
- Hæld 3 ml smeltet agarose i en 35 mm glasbundsskål (Materialetabel). Lad agarose at størkne.
- Ved hjælp af en laboratoriemikrospatel fjernes agarosepuden forsigtigt fra 35 mm skålen uden at forstyrre agarosepudens midterpol. Vend pudens nederste side opad og læg den i et petriskålsdæksel (Figur 2).
- Sæt 5 μL koncentreret E. coli suspension på toppen af spejlvendte pad og sprede celler i midten pol ved hjælp af en vaccination loop. Der tilsættes 5 μL koncentreret B. bacteriovorus suspension (OD600 af ~0,2) på den E.coli-belagte overflade. Cellerne må ikke spredes.
- Returner hurtigt agarosegelen til den 35 mm glasbundede skål (øverste side nedad), og dæk derefter med et låg. Fjern om nødvendigt eventuelle luftbobler ved forsigtigt at trykke agaren ned mod pladen.
Figur 2: Skematisk skildring af forsøgsarbejdsgangen. Agarosepuden fjernes fra 35 mm skålen og vendes, så den nederste side vender opad. Friske suspensioner af aggressiv celler og natten kultur bytte celler er placeret på vendt pad til pels den "nederste" side. Agarosepuden vendes derefter til sin oprindelige orientering og placeres tilbage i 35 mm skålen, som er monteret på den omvendte mikroskopfase i mikroskopkammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
5. Ledning af time-lapse fluorescens mikroskopi
- 35 mm skålen sættes i petriskålens holder, således at den ikke bevæger sig i løbet af forsøget. Anmal en dråbe nedsænkningsolie (1,518 brydningsindeks) på målet samt bunden af 35 mm skålen.
- Monter holderen på scenen af det omvendte mikroskop i mikroskopkammeret.
- Konfigurer indstillingerne i mikroskopkontrolsoftwaren til at indsamle flere billeder på flere trinpositioner over tid.
- Indstil forstørrelsen (100x) og polykromlinse (GFP/mCherry). Ved hjælp af et øje stykke og brightfield (BF), finde brændvidde flyet og åbne punktlisten manager.
- Vælg mindst 10 interessepositioner ved at flytte scenen og gemme koordinaterne for hver position i mikroskopsoftwaren ved at klikke på knappen Markér punkt. Undgå positioner placeret tæt på hinanden for at forhindre fotobleaching og fototoksicitet. Drej kameraventilen fra okularet til skærmen, og kalibrer hvert punkt ved at indstille brændplanet og klikke på knappen Erstat punkt i pointlistelederen.
- Åbn eksperimentdesigneren, og angiv alle eksperimentelle parametre under hver fane på følgende måde:
- Fjerne markeringen af Z-stablingsboksen.
- Vælg lysstofrør og indstil de optimale belysningsindstillinger. Her blev følgende indstillinger brugt: for mCherry-kanalen, mCherry-filtersæt (EX575/25; EM625/45), 50% intensitet og 200 ms eksponeringstid; for GFP-kanalen, GFP-filtersættet (EX475/28; EM525/48), 50% intensitet og 80 ms; og for BF-billederne, POL-kanalen, 5 % intensitet og 50 ms.
- Vælg intervaller mellem hentning af billeder og eksperimentets samlede tid. Her blev der udført 5 minutters intervaller i løbet af eksperimentets 10 timer.
- Aktiver fokusvedligeholdelse for de valgte positioner (for det system, der bruges her, ved at markere afkrydsningsfeltet Bevar fokus med UltimateFocus).
- Vælg den datamappe, som billedfilerne skal gemmes i automatisk.
- Kontroller alle indstillinger i mikroskopsoftwarekontrolelementet igen, og start derefter time-lapse-eksperimentet.
- Efter eksperimentets første time skal du kontrollere, at alle scenepositioner stadig er i fokus. Juster fokus i tidsintervaller mellem billedopkøb, hvis det er nødvendigt.
- Når time-lapse eksperimentet er færdigt, skal du fjerne petriskålen og bruge 35 mm skålen med en agarosepude i henhold til biosikkerhedsprotokollen.
BEMÆRK: Alle undertrin efter trin 5.2 er specifikke for DeltaVision Elite-brugere. Forskere, der bruger andre systemer nødt til at justere indstillingerne i henhold til de enkelte systemer.
6. Behandling af time-lapse billeder og generation af film ved hjælp af Fiji software
- Overfør eksperimentelle data til en computer fyldt med Fiji-softwaren. Start Fiji-programmet, og åbn et billede ved hjælp af File | Åbn eller ved blot at trække og slippe billedfilen til Fiji.
- I Importindstillinger for Bioformaterskal du vælge Vis stak med Hyperstack i stakvisningsindstillingerne, Klikke på Sammensat farvetilstand i farveindstillingerne og markere Automatisk skalering.
- Ved at rulle gennem billedstakkene skal du vurdere, om cellerne og bdelloplasterne forblev i fokus i løbet af eksperimentet. Kontroller, om grønne fluorescerende pletter fra DnaN-mNeonGreen er til stede i B. bacteriovorus celler inde bdelloplasts i hele vækstfasen, og sikre, at alle faser af aggressiv livscyklus kan visualiseres.
- Hvis du vil analysere en bestemt B. bacteriovorus celle/bdelloplast, skal du markere den ved hjælp af markeringsværktøjerne i menuen Fiji (rektangel, oval, polygon eller frihånd). Duplikere det valgte område ved hjælp af Billede | Dubler eller ved hjælp af Ctrl + Skift + D.
- Juster lysstyrken og kontrasten for hver fluorescenskanal på følgende måde:
- Hvis du vil vælge en enkelt kanal, skal du åbne kanalværktøjer ved at klikke på Billede | Farve | Kanaler værktøjer eller Ctrl + Skift + Z, og vælg den kanal af interesse (Kanal 1:mCherry, Kanal 2:mNeonGreen, Kanal 3: brightfield).
- Juster lysstyrken og kontrasten af billeder i fluorescenskanalen ved at åbne B&C-menuen i Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast eller ved at klikke på Ctrl + Skift + C.
- Tilføje skalerbar ved hjælp af Analysér | Redskaber | Skaler linje. Føj tidsstemplen til billederne ved at klikke på Billeder | Stakke | Tidsstempel.
- Hvis du vil gemme ændrede billeder, skal du gå til Filer | Gem som, og vælg TIFF for at gemme som en billedsekvens, AVI for at producere en film eller PNG for at gemme et enkelt billede af den aktuelle ramme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det beskrevne TLFM-baserede system gør det muligt at spore individuelle celler af B. bakterieædre i tide (Figur 3, Film 1) og giver værdifulde oplysninger om hver fase af den komplekse aggressiv livscyklus. PilZ-mCherry-fusionen gør det muligt at mærke hele den rovcelle i angrebsfasen samt den tidlige fase af vækstfasen (figur 3). Overgangen fra angrebet til replikativ fase blev visualiseret ikke kun af værten bdelloplast dannelse, men også af udseendet af replisome (replikation maskiner), som var præget af DnaN-mNeonGreen fluorescerende foci (Figur 3).
Som tidligere påvist, replisom blev samlet på invaderende celle pol (pili-pole)7, og mere end én replisome blev observeret i en voksende B. bakteriedræt filament som reproduktion fase skred frem (Figur 3). Efter flere kopier af kromosomet blev syntetiseret, replikationen blev afsluttet (visualiseret som forsvinden af DnaN-mNeonGreen foci). Endelig gennemgik flerkernegidetråden septation, og afkomcellerne blev frigivet fra bdelloplast (Figur 3).
Den præsenterede protokol, der beskriver billedbehandlingen ved hjælp af Fiji-softwaren, giver en trinvis forklaring på, hvordan man producerer en film til offentliggørelse fra den erhvervede time-lapse-serie (Movie 1).
Figur 3: B. bakterieniovorus livscyklus efterfulgt af time-lapse fluorescensmikroskopi. a) Fritlevende rovdyr (B. bacteriovorus DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) og værtsceller (E. coli). (B) Tilknytning af B. bacteriovorus til E. coli. cC) Bdelloplast-formation. (D,E) Filamentøs vækst og kromosomreplikering. (F)Afslutning af kromosomreplikering. gG) Start af synkron glødetrådspæration. HH) Bdelloplast lysis og frigivelse af afkomceller. Øvre paneler viser brightfield billeder, lavere paneler repræsenterer fusionerede brightfield og fluorescens kanaler. Skalabar = 1 μm, tid = hh:min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Film 1: Time-lapse imaging af B. bacteriovorus livscyklus i E. coli som en værtscelle. Subcellulær lokalisering af DnaN-mNeonGreen (grøn) i stamme HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry. Rød kanal angiver mærkning af rovdyrcellerne med cytoplasmatisk PilZ-mCherry. Grå angiver brightfield. Billeder blev indsamlet hver 5 min. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af den øgede interesse i at bruge B. bacteriovorus som et levende antibiotikum, nye værktøjer til at observere aggressiv livscyklus, især rovdyr-patogen interaktioner, er nødvendige. Den præsenterede protokol bruges til at spore hele B. bakteriens livscyklus, især under sin vækst inde i værten, i realtid. Desuden, anvendelse af en stamme, der producerer fluorescerende mærket beta klemme af DNA polymerase III holoenzyme aktiveret overvågning af kromosom replikation progression i hele reproduktion fase af B. bakteriovorus.
Et kritisk skridt i denne metode er den korrekte forberedelse af layouts i 35 mm skålen. En udfordring i at observere livscyklus B. bakteriecykel under mikroskop er at etablere betingelser, der understøtter aggressiv vækst (involverer andre gram-negative bakterieceller som værtsceller) og sørge for aggressiv celle motilitet. Et af de afgørende aspekter af effektive mikroskopiske observationer er behovet for en ensartet fordeling af bytte på agarosepuden, hvilket opnås ved at sprede cellerne med en podningsløkke. Værtscelletætheden kan ikke være for høj, og de valgte observationspunkter bør indeholde et tilstrækkeligt antal separate værtsceller. I mellemtiden bør Bdellovibrio celler være motile nok til aktivt at søge efter deres bytte. De bør derfor ikke spredes ud eller lufttørres, før puden vendes tilbage og placeres i skålen. Nogle gange større mængder af rovdyr suspension er nødvendige for at give tilstrækkelig motilitet i et tyndt lag af væske mellem agarose og glasoverflade.
Her anvendes en μ-Dish. Dette er dog ikke afgørende for protokollen. Enhver glasbundet skål kan anvendes. En fordel ved μ-Dish er den optimale højde og volumen af agarose stien, som gør det muligt coculture af aggressiv og vært, der skal placeres på den nederste side af agarose pad. Det er også vigtigt at bruge friske B. bacteriovorus celler i forsøgene, da cellerne mister deres motilitet under langvarig opbevaring. En begrænsning af denne protokol er, at brugerne i det enkelte synsfelt kan tælle ca. 100 rovdyrceller og 100 værtsceller, men MOI kan anslås til 50%-60%.
Aktuel viden om Bdellovibrio celle cyklus er i vid udstrækning baseret på undersøgelser, der har ansat E. coli eller P. aeruginosa. Dette system giver mulighed for overvågning af B. bacteriovorus bytte på en række bakterielle patogener, herunder Salmonella spp., S. flexneri, Proteus mirabilis, eller K. pneumoniae. Desuden kan denne platform være nyttig i forsøg med multiresistente patogener. Det kan således bidrage til at lette forbedringer i genteknologien af B. bakteriiovorus som et levende antibiotikum i human- og veterinærmedicin, navnlig for at bekæmpe multiresistente patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Science Centre grant Opus 2018/29/B/NZ6/00539 til J.Z.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates. Frontiers in Microbiology. 5, (2014).
- Willis, A. R., et al. Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae. Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).
- Lambert, C., et al. Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus. Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).
- Lambert, C., et al. A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus. Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).
- Makowski, Ł, et al. Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus. Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).
- Makowski, Ł, et al. Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus. Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).
- Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).
- Kuru, E., et al. Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation. Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).
- Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus. Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).
