Summary
Qui è presentato un protocollo che descrive il monitoraggio dell'intero ciclo di vita del batterio predatorio Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse in combinazione con un cuscinetto di agarose e piatti di imaging cellulare.
Abstract
Bdellovibrio bacteriovorus è un piccolo batterio predatorio negativo e obbligato che uccide altri batteri gram-negativi, compresi gli agenti patogeni nocivi. Pertanto, è considerato un antibiotico vivente. Per applicare B. bacteriovorus come antibiotico vivente, è prima necessario comprendere le principali fasi del suo complesso ciclo di vita, in particolare la sua proliferazione all'interno della preda. Finora, è stato difficile monitorare le fasi successive del ciclo di vita predatorio in tempo reale. Presentato qui è un protocollo completo per l'imaging in tempo reale dell'intero ciclo di vita di B. bacteriovorus, soprattutto durante la sua crescita all'interno dell'host. A tale scopo, viene utilizzato un sistema costituito da un cuscinetto di agarose in combinazione con piatti di imaging cellulare, in cui le cellule predatorie possono muoversi liberamente sotto il cuscinetto di agarose mentre le cellule di preda immobilizzate sono in grado di formare bdelloplasts. L'applicazione di un ceppo che produce una β-sottounità di polimerasi del DNA III consente inoltre di monitorare la replicazione cromosomia durante la fase di riproduzione del ciclo di vita B. batteriovorus.
Introduction
Bdellovibrio bacteriovorus è un piccolo batterio gram-negativo che preda altri batteri gram-negativi, tra cui patogeni nocivi come Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Shigella flexneri1,2,3. Poiché B. bacteriovorus uccide agenti patogeni, è considerato un potenziale antibiotico vivente che può essere applicato per combattere le infezioni batteriche, in particolare quelle causate da ceppi multifarmacori.
B. bacteriovorus presenta un ciclo di vita particolare costituito da due fasi: una fase di attacco non replicativo e una fase riproduttiva intracellulare (Figura 1). Nella fase di vita libera, questo batterio altamente motile, che si muove a velocità fino a 160 m/s, cerca la sua preda. Dopo essersi attaccata alla membrana esterna della preda, entra nel periplasma4,5. Durante la fase riproduttiva interperiplasmica, B. bacteriovorus utilizza una pletora di enzimi idrolitici per degradare le macromolecole dell'ospite e riutilizzarle per la propria crescita. Poco dopo aver invaso il periplasma, la cellula ospite muore e si gonfia in una struttura sferica chiamata bdelloplast, all'interno della quale la cellula predatoria allunga e replica i suoi cromosomi. Il processo di replica inizia dall'origine della replica (oriC)6 e procede fino a quando diverse copie del cromosoma non sono state completamente sintetizzate7. È interessante notare che la replica di ogni cromosoma non è seguita dalla divisione cellulare. Invece, il predatore si allunga per formare una cellula lunga, multinucleoide e filamentosa. Al momento dell'esaurimento dei nutrienti, il filamento subisce setto sincrono e le cellule della progenie vengono rilasciate dal bdelloplast8.
Prima che B. bacteriovorus possa essere usato come antibiotico vivente contro le infezioni batteriche, è fondamentale comprendere le principali fasi del suo ciclo di vita, in particolare quelle legate alla sua proliferazione all'interno della preda. L'imaging a cellule vive di B. bacteriovorus è stato impegnativo, a causa delle varie forme morfologiche del predatore e della sua preda durante il complesso ciclo di vita. Finora, le interazioni tra B. bacteriovorus e la sua cellula ospite sono state studiate principalmente dalla microscopia elettronica e dall'analisi a scatto a scatto2,9,10, entrambe con limitazioni, soprattutto quando vengono utilizzate per monitorare le fasi successive del ciclo di vita predatorio. Questi metodi forniscono immagini ad alta risoluzione di cellule B. batteriovorus e consentono l'osservazione di un piccolo predatore durante la fase di attacco o di crescita. Tuttavia, non consentono il tracciamento di singole cellule B. batteriovorus durante entrambe le fasi del ciclo di vita.
Presentato qui è un protocollo completo per l'utilizzo di microscopia a fluorescenza time-lapse (TLFM) per monitorare l'intero ciclo di vita di B. bacteriovorus. Un sistema costituito da un cuscinetto di agarose viene utilizzato in combinazione con un piatto di imaging cellulare, in cui le cellule predatorie possono muoversi liberamente sotto il cuscinetto di agarose mentre le cellule preda immobilizzate sono in grado di formare bdelloplasts (Figura 2). Questo set-up è preparato sulla base di ceppi specifici di E. coli e B. bacteriovorus, ma il protocollo può essere facilmente modificato per adattarsi ai singoli ceppi di un utente (ad esempio, portando diversi marcatori di selezione, proteine fuse con fluorofori diversi, ecc.).
In questo caso, per visualizzare B. bacteriovorus durante la fase di attacco, è stato costruito un ceppo specifico (HD100 DnaN-mNeonGreen/Pil-mCherry) che esprime una versione fluorescente della proteina citoplasmica, Pil , (disponibile nel nostro laboratorio su richiesta)7. Questo ceppo produce inoltre DnaN (il morsetto β-sliding), una sottounità di oloenzima della polimerasi del DNA III, fusa con una proteina fluorescente. Ciò consente di monitorare la replicazione del DNA in corso all'interno delle cellule predatorie man mano che crescono all'interno dei bdelloplasts.
Sebbene il protocollo e il software descritti utilizzati per l'acquisizione delle immagini si riferis facciano riferimento a un microscopio invertito fornito da un produttore specifico (c'è la tabella dei materiali), questa tecnica può essere regolata per qualsiasi microscopio invertito dotato di camera ambientale o di un altro supporto di riscaldamento esterno e in grado di imaging time-lapse. Per l'analisi dei dati, gli utenti possono scegliere qualsiasi software disponibile compatibile con i singoli formati di output.
Figura 1: B. ciclo di vita batterivoro in E. coli come cella ospite. Durante la fase di attacco, una cellula B. bacteriovorus che nuota libera cerca e si attacca a una cellula E. coli ospitante. Dopo l'invasione, la cellula predatoria viene localizzata nel periplasma della preda, cambiando la forma della cellula ospite e formando un bdelloplast. La fase riproduttiva inizia con la formazione di bdelloplastica. La cellula predatoria digerisce la cellula preda e riutilizza semplici composti per costruire le proprie strutture. B. bacteriovorus cresce come un lungo filamento singolo all'interno del periplasma dell'ospite. Quando le risorse della cellula preda sono esaurite, il filamento B. bacteriovorus si setta in modo sincrono e forma cellule progenie. Dopo che le cellule della progenie sviluppano i loro flagelli, elivano il bdelloplast. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. Preparazione di B. bacteriovorus lysate per l'analisi microscopica
- In una fiaschetta da 250 mL, impostare la cocultura combinando 1 mL di coltura fresca 24 h B. batteriovorus (ad esempio, HD100 DnaN-mNeonGreen/Pil-mCherry) e 3 mL di coltura prede durante la notte (ad esempio, E. coli S17-1 p-MR100) con 50 mL di buffer Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH - 7,6]) integrato con antibiotici quando necessario (qui, 50 g/mL kanamycin).
- Incubare la cocoltura per 24 h a 30 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/min.
- Verificare che le cellule preda siano completamente lissete dalla microscopia a contrasto di fase montata sul liquido. A questo punto, dovrebbero essere presenti numerose cellule di attacco motile B. cellule batteriovorose e nessuna cellula E. coli o bdelloplast dovrebbe essere visibile.
- Filtrare la coltura B. bacteriovorus tramite un filtro di dimensione poro di 0,45 m per rimuovere tutte le celle host rimanenti. Le cellule predatorie (0,3–0,5 m x 0,5–1,4 m) penetrano liberamente in 0,45 gradi, mentre le cellule ospitanti vengono mantenute sulla superficie del filtro.
- Girare verso il basso il filtrato per 20 min a 2469 x g e 30oC in un tubo conico di 50 mL per raccogliere le cellule predatorie. Risuostare il pellet B. bacteriovorus in 3 mL di buffer Ca-HEPES (per un ODfinale 600 di circa 0,2) e incubare a 30 gradi centigradi e 200 giri/min per 30 min.
2. Preparazione delle cellule ospitante per l'invasione di B. batteriovorus
- Utilizzare una singola colonia del ceppo ospite (E. coli S17-1 p-MR100 è raccomandato a causa di varie dimensioni delle cellule con conseguente formazione di bdelloplasts di dimensioni ineguali) per inoculare 10 mL di metà YT (0,8% di tryptone bacto, 0.5% Estratto di lievito, 0.5% NaCl [pH - 7.5]) che è stato integrato con antibiotici, se necessario (qui, 50 g/mL kanamycin). Cellule di coltura durante la notte a 37 gradi centigradi e 180 giri/min.
- Trasferire 2 mL di coltura E. coli durante la notte (OD600 di 3,0 USD) in una provetta da 2 mL e centrifuga a temperatura ambiente (RT) e 2469 x g per 5 min. Riespegnare il pellet in 200 L di tampone Ca-HEPES.
3. Configurazione del microscopio (c'è la tabella dei materiali)
- Pre-riscaldare una camera microscopica con un obiettivo di immersione di olio 100x a 30 gradi centigradi per almeno 1 h prima dell'uso. Questo passaggio è necessario per evitare errori nel mantenimento dello stato attivo durante l'esperimento.
- Accendere sia il microscopio che l'automazione della microscopia. Inizializzare il software di controllo e selezionare i filtri appropriati per acquisire immagini di contrasto e fluorescenza a campo luminoso/DIC/phase-contrast e fluorescenza, in base alle esigenze (qui: immagini BF, filtro policromo GFP/mCherry ed emissione/eccitazione per mCherry e GFP).
4. Assemblaggio di layout per microscopia a fluorescenza time-lapse
- Mescolare 200 mg di agarose di basso grado molecolare fluorescente con 20 mL di tampone Ca-HEPES (1% concentrazione di agarose finale) e sciogliere l'agarose in un forno a microonde. Il lotto può essere riutilizzato più volte dopo che si solidifica, quindi è sufficiente ripetere la fase di riscaldamento.
- Versare 3 mL di agarose fuso in un piatto con fondo di vetro da 35 mm(Tabella dei materiali). Lasciare che l'agarose si solidifichino.
- Utilizzando una micro-spatola di laboratorio, rimuovere con cura il cuscinetto di agarose dal piatto da 35 mm senza disturbare il palo centrale del pad di agarose. Capovolgere il lato inferiore del pad rivolto verso l'alto e posizionarlo in una copertura del piatto Petri (Figura 2).
- Mettere 5 L di sospensione concentrata E. coli sulla parte superiore del pad capovolto e diffondere le cellule nel polo centrale utilizzando un loop di inoculazione. Aggiungere 5 L di sospensione concentrata B. bacteriovorus (OD600 di 0,2 USD) sulla superficie rivestita di E. coli. Non spargere le cellule.
- Riportare rapidamente il gel di agarose al piatto con fondo di vetro da 35 mm (lato superiore rivolto verso il basso), quindi coprire con un coperchio. Se necessario, rimuovere eventuali bolle d'aria premendo delicatamente l'agar contro la piastra.
Figura 2: rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale. Il cuscinetto di agarose viene rimosso dal piatto da 35 mm e capovolto in modo che il lato inferiore si affaccia verso l'alto. Sospensioni fresche di cellule predatorie e coltura durante la notte di cellule preda sono poste sul pad capovolto per rivestire il lato "inferiore". Il pad di agarose viene quindi capovolto al suo orientamento originale e riposto nella piatto da 35 mm, che viene montato sullo stadio del microscopio invertito nella camera al microscopio. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
5. Conduzione della microscopia a fluorescenza time-lapse
- Mettere il piatto da 35 mm nel portapiacchi Petri in modo che non si muova nel corso dell'esperimento. Posizionare una goccia di olio di immersione (1.518 indice di rifrazione) sull'obiettivo e sul fondo della piatto da 35 mm.
- Montare il supporto sul palco del microscopio invertito nella camera al microscopio.
- Impostare le opzioni nel software di controllo al microscopio per raccogliere più immagini in più posizioni di fase nel tempo.
- Impostare l'ingrandimento (100x) e la lente policromica (GFP/mCherry). Utilizzando un pezzo occhio e un campo luminoso (BF), trovare il piano focale e aprire il gestore della lista dei punti.
- Selezionare almeno 10 posizioni di interesse spostando lo stage e memorizzando le coordinate per ogni posizione nel software al microscopio facendo clic sul pulsante Segna punto. Evitare le posizioni situate vicine l'una all'altra per evitare fotobleaching e fototossicità. Ruotare la valvola della fotocamera dall'oculare al monitor e calibrare ogni punto impostando il piano focale e facendo clic sul pulsante Sostituisci punto nel gestore dell'elenco dei punti.
- Aprire la finestra di progettazione dell'esperimento e impostare tutti i parametri sperimentali in ogni scheda come segue:
- Deselezionare la casella di sovrapposizione.
- Scegliere i canali fluorescenti e impostare le impostazioni di illuminazione ottimali. In questo caso, sono state utilizzate le seguenti impostazioni: per il canale mCherry, set di filtri mCherry (EX575/25; EM625/45), intensità del 50% e tempo di esposizione di 200 ms; per il canale GFP, set di filtri GFP (EX475/28; EM525/48), intensità del 50% e 80 ms; e per le immagini BF, il canale POL, l'intensità del 5% e 50 ms.
- Selezionare gli intervalli tra l'acquisizione di immagini e il tempo totale dell'esperimento. Qui, sono stati eseguiti intervalli di 5 minuti nel periodo di 10 ore dell'esperimento.
- Abilitare la manutenzione dello stato attivo per le posizioni scelte (per il sistema utilizzato qui, selezionando la casella di controllo Mantieni lo stato attivo con UltimateFocus).
- Selezionare la cartella dati in cui salvare automaticamente i file di immagine.
- Ricontrollare tutte le impostazioni nel controllo software al microscopio, quindi avviare l'esperimento time-lapse.
- Dopo la prima ora dell'esperimento, verificare che tutte le posizioni di fase siano ancora a fuoco. Regolare la messa a fuoco durante gli intervalli di tempo tra l'acquisizione dell'immagine, se necessario.
- Quando l'esperimento time-lapse è finito, rimuovere la piastra Petri e utilizzare il piatto da 35 mm con un tampone di agarose secondo il protocollo di biosicuità.
NOTA: tutti i passaggi secondari dopo il passaggio 5.2 sono specifici per gli utenti DeltaVision Elite. I ricercatori che utilizzano altri sistemi devono regolare le impostazioni in base ai singoli sistemi.
6. Elaborazione di immagini time-lapse e generazione di film utilizzando il software Fiji
- Trasferire dati sperimentali su un computer caricato con il software Fiji. Avviare il programma Fiji e aprire un'immagine utilizzando File Aprire o semplicemente trascinando e rilasciando il file di immagine in Fiji.
- In Opzioni di importazione bio-formatiscegliere Visualizza pila con Hyperstack nelle opzioni di visualizzazione della pila, fare clic sulla modalità Colore composito nelle opzioni di colore e contrassegnare Scala automatica.
- Scorrendo le pile di immagini, valutare se le celle e i bdelloplasts sono rimasti a fuoco nel corso dell'esperimento. Controllare se le macchie fluorescenti verdi di DnaN-mNeonGreen sono presenti all'interno delle cellule B. bacteriovorus all'interno di bdelloplasts durante la fase di crescita e assicurarsi che tutte le fasi del ciclo di vita predatorio possano essere visualizzate.
- Per analizzare una particolare cella B. bacteriovorus/bdelloplast, contrassegnarla utilizzando gli strumenti di selezione del menuFigi( Rettangolo , Ovale , Poligono o Mano libera). Duplicare l'area scelta utilizzando Immagine Duplicare o utilizzando D Ctrl .
- Regolare la luminosità e il contrasto per ogni canale di fluorescenza come segue:
- Per scegliere un singolo canale, aprite gli strumenti Canale facendo clic su Immagine . Proprietà Color . Strumenti Canali o Ctrl e Maiusc e selezionare il canale di interesse (Canale 1: mCherry, Canale 2: mNeonGreen, Canale 3: campo luminoso).
- Regolare la luminosità e il contrasto delle immagini nel canale di fluorescenza aprendo il menu B&C in Immagine . Regolare la proprietà Luminosità/Contrasto o facendo clic su Ctrl e Maiusc . C
- Aggiunta della barra della scala mediante Analizza Strumenti - Strumenti Barra della scala. Aggiungere l'indicatore di data e ora alle immagini facendo clic su Immagini . Proprietà Stacks . Indicatore di data e ora.
- Per salvare le immagini modificate, vai a File Salva con nome e scegli TIFF per salvare come sequenza di immagini, AVI per produrre un filmato o PNG per salvare una singola immagine del fotogramma corrente.
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Representative Results
Il sistema basato su TLFM descritto consente di tenere traccia in tempoFigure 3delle singole Movie 1cellule di B. La fusione Pil-mCherry consente di etichettare l'intera cellula predatoria nella fase di attacco e nella fase iniziale della fase di crescita (Figura 3). Il passaggio dall'attacco alla fase replicativa è stato presentato non solo dalla formazione bdelloplast ospite, ma anche dalla comparsa del replisome (macchina di replica), che è stato contrassegnato da Foci fluorescenti DnaN-mNeonGreen (Figura 3).
Come dimostrato in precedenza, il replisome è stato assemblato presso il polo della cellula invasiva (pili-polo)7e più di un replisome è stato osservato all'interno di un filamento B. bacteriovorus in crescita man mano che la fase di riproduzione progredisce (Figura 3). Dopo diverse copie del cromosoma sono stati sintetizzati, la replica è stata terminata (visualizzazione come la scomparsa di DnaN-mNeonGreen foci). Infine, il filamento multinucleoide ha subito il setto, e le cellule della progenie sono state rilasciate dal bdelloplast (Figura 3).
Il protocollo presentato che descrive l'elaborazione delle immagini utilizzando il software Fiji fornisce una spiegazione passo-passo di come produrre un film per la pubblicazione dalla serie time-lapse acquisita (Film 1).
Figura 3: B. ciclo di vita batterivoro seguito dalla microscopia a fluorescenza time-lapse. (A) Predatori in vita libera (B. bacteriovorus DnaN-mNeonGreen/Pil-mCherry) e cellule host (E. coli). (B) Allegato di B. bacteriovorus a E. coli. (C) Formazione Bdelloplast. (D,E) Crescita filamentosa e replicazione cromosomi. (F) Terminazione della replica cromosoma. (G) Inizio del setticazione del filamento sincrono. (H) L'lisi Bdelloplast e il rilascio di cellule di progenie. I pannelli superiori mostrano immagini a campo luminoso, i pannelli inferiori rappresentano i canali di fluorescenza e il campo luminoso uniti. Barra della scala : 1 m, ora e hh:min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Filmato 1: Imaging time-lapse del ciclo di vita B. bacteriovorus in E. coli come cellula ospite. Localizzazione subcellulare di DnaN-mNeonGreen (verde) nel ceppo HD100 DnaN-mNeonGreen/Pil-mCherry. Il canale rosso indica l'etichettatura delle cellule predatore con pil-mCherry citoplasmico. Il grigio indica il campo luminoso. Le immagini sono state raccolte ogni 5 minuti. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
A causa del crescente interesse per l'uso di B. bacteriovorus come antibiotico vivente, sono necessari nuovi strumenti per osservare il ciclo di vita predatorio, in particolare le interazioni predatore-patogeno. Il protocollo presentato viene utilizzato per tracciare l'intero ciclo di vita B. bacteriovorus, soprattutto durante la sua crescita all'interno dell'host, in tempo reale. Inoltre, l'applicazione di un ceppo che produce morsetto beta fluorescente della polimerasi DEL DNA III holoenzyme ha permesso il monitoraggio della progressione della replicazione cromosomia durante la fase di riproduzione di B. bacteriovorus.
Un passo fondamentale in questo metodo è la corretta preparazione dei layout nella piatto da 35 mm. Una sfida nell'osservare il ciclo di vita di B. bacteriovorus al microscopio consiste nel stabilire condizioni che supportano la crescita predatoria (coinvolgendo altre cellule batteriche gram-negative come cellule ospite) e fornire la motilità delle cellule predatorie. Uno degli aspetti cruciali delle osservazioni microscopiche efficaci è la necessità di una distribuzione uniforme delle prede sul cuscinetto di agarose, che si ottiene diffondendo le cellule con un ciclo inoculante. La densità delle celle host non può essere troppo elevata e i punti di osservazione scelti devono contenere un numero sufficiente di celle host separate. Nel frattempo, le cellule di Bdellovibrio dovrebbero essere abbastanza motile da cercare attivamente le loro prede. Pertanto, non devono essere distribuiti o asciugati all'aria prima che il pad venga capovolto e inserito nel piatto. A volte sono necessari maggiori volumi di sospensione dei predatori per fornire sufficiente motilità in un sottile strato di fluido tra la superficie agarose e vetro.
Qui viene utilizzato un piatto z; tuttavia, ciò non è essenziale per il protocollo. Qualsiasi piatto con fondo di vetro potrebbe essere utilizzato. Un vantaggio del piatto z è l'altezza e il volume ottimali del percorso di agarose, che consente alla cocultura di predatori e di ospitare di essere collocata sul lato inferiore del pad di agarose. È anche importante utilizzare cellule fresche di B. bacteriovorus negli esperimenti, poiché le cellule perdono la loro motilità durante lo stoccaggio prolungato. Una limitazione di questo protocollo è che, nel singolo campo di visualizzazione, gli utenti possono contare circa 100 cellule predatore e 100 cellule host, ma il MOI può essere stimato al 50%-60%.
Le attuali conoscenze sul ciclo cellulare di Bdellovibrio si basano in gran parte su studi che hanno impiegato E. coli o P. aeruginosa. Questo sistema consente il monitoraggio di B. bacteriovorus predando una varietà di patogeni batterici, tra cui Salmonella spp., S. flexneri, Proteus mirabilis, o K. pneumoniae. Inoltre, questa piattaforma può essere utile negli esperimenti che coinvolgono agenti patogeni multifarmacorsi. Pertanto, può contribuire a facilitare i miglioramenti nell'ingegneria genetica di B. bacteriovorus come antibiotico vivo nella medicina umana e veterinaria, in particolare per combattere i patogeni multifarmacori.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Science Centre Opus 2018/29/B/N'6/00539 a J.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
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