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Studium der vorgeformten Fibril-induzierten Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Maus-Midbrain-Neuronen

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DOI:

10.3791/61118

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16. August 2020

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1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Neuroscience Center, HiLIFE, University of Helsinki, 3Department of Brain Biochemistry, Maj Institute of Pharmacology, Polish Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier, Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der neuronalen Synuclein-Akkumulation in primären Maus-Dopamin-Neuronen. Phosphorylierte-Synuclein-Aggregate in Neuronen werden mit vorgebildeten ,-Synuclein-Fibrillen induziert. Die automatisierte Bildgebung von immunfluorest markierten Zellen und die unvoreingenommene Bildanalyse machen dieses robuste Protokoll für das Screening von Medikamenten mit mittlerem bis hohem Durchsatz geeignet, die die Akkumulation von Synuclein hemmen.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein robustes und reproduzierbares Modell der Akkumulation von Synuclein in primären Dopamin-Neuronen zu etablieren. In Kombination mit immunostainierender und unvoreingenommener automatisierter Bildanalyse ermöglicht dieses Modell die Analyse der Auswirkungen von Medikamenten und genetischen Manipulationen auf die Aggregation von Synuclein in neuronalen Kulturen. Primäre Midbrain-Kulturen bieten eine zuverlässige Quelle für gutgläubige embryonale Dopamin-Neuronen. In diesem Protokoll wird die charakteristische Histopathologie der Parkinson-Krankheit, Lewy-Körper (LB), durch die Zugabe von vorgebildeten Fibrillen (PFFs) direkt zu neuronalen Kulturmedien nachgeahmt. Die Akkumulation von endogenem Phosphoryliertem-Synuclein im Soma von Dopamin-Neuronen wird durch Immunfärbung bereits 7 Tage nach der PFF-Zugabe nachgewiesen. In-vitro-Zellkulturbedingungen eignen sich auch für die Anwendung und Bewertung von Behandlungen, die die Akkumulation von Synuclein verhindern, wie kleine Molekülmedikamente und neurotrophe Faktoren, sowie Lentivirus-Vektoren für die genetische Manipulation (z.B. mit CRISPR/Cas9). Das Kultivieren der Neuronen in 96 Brunnenplatten erhöht die Robustheit und Leistungsfähigkeit der Versuchseinrichtungen. Am Ende des Experiments werden die Zellen mit Paraformaldehyd für die Immunzytochemie und Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung fixiert. Multispektrale Fluoreszenzbilder werden durch automatisierte Mikroskopie von 96 Brunnenplatten gewonnen. Diese Daten werden quantifiziert (z.B. zählen die Anzahl der Phospho--Synuclein-haltigen Dopamin-Neuronen pro Brunnen) mit der Verwendung von freier Software, die eine Plattform für unvoreingenommene hochklassige Phänotypanalyse bietet. PFF-induzierte Modellierung der phosphorylierten Synuclein-Akkumulation in primären Dopamin-Neuronen bietet ein zuverlässiges Werkzeug, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, die bildung und Eliminierung von Einschlüssen von Synuclein vermitteln, mit der Möglichkeit für hochdurchsatziges Arzneimittelscreening und zelluläre Phänotypanalyse.

Einleitung

Parkinson-Krankheit (PD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch den Tod der Midbrain Dopamin-Neuronen in der Substantia nigra (SN), den anschließenden Verlust von Dopamin-Ton in Basalganglien und daraus resultierende motorische Beeinträchtigungen1,2gekennzeichnet ist. Ein wichtiges histopathologisches Merkmal im Gehirn von PD-Patienten sind intrazelluläre Protein-Lipid-Aggregate, die in neuronatolen Soma, lewy Bodies (LB), oder in Neurriten, Lewy-Neuriten (LN), kollektiv bekannt als Lewy Pathologie3gefunden werden. Lewy Pathologie im Gehirn scheint mit fortschreitenden PD ähnlich der Ausbreitung von pathogenen Faktoren durch neuronale Verbindungen fortschritten. Reichlich Lewy Pathologie ist in Dopamin-Neuronen in der SN und Zellen in anderen Bereichen von Neurodegeneration4betroffen gefunden. Jedoch, während der Krankheitsprogression, Ausbreitung und Beginn der Proteinaggregation nicht immer mit neuronalen Tod korrelieren und der genaue Beitrag der Lewy Pathologie zum neuronalen Tod ist immer noch unklar5.

LB und LN hatten gezeigt, dass sie aus membranösen und proteinhaltigen Komponentenbestehen 3. Erstere sind Membranfragmente, vesikuläre Strukturen (möglicherweise Lysosomen und Autophagosomen) und Mitochondrien3. Letzteres besteht aus mindestens 300 verschiedenen Proteinen6. Eine markante Studie von Spillantini et al.7 zeigte, dass die Hauptproteinkomponente der Lewy-Pathologie das Synuclein ist. Hoch exprimiert in Neuronen, und verbunden mit Membranfusion und Neurotransmitter-Freisetzung, ist die -Synuclein in der Lewy-Pathologie meist in falsch gefalteter, Amyloidfibrillenform vorhanden, deren Großteil bei Ser129 (pS129-syn)4,8phosphoryliert ist.

Wichtig ist, dass auch gezeigt wurde, dass aufgrund seiner prionähnlichen Eigenschaften, falsch gefaltete '-Synuclein könnte eine ursächliche Rolle in Lewy Pathologie Bildung4. Die prionähnlichen Eigenschaften von falsch gefaltetem Synuclein wurden sowohl mit Midbrain-Extrakten von Patienten als auch mit exogen vorbereiteten präformierten Fibrillen (PFFs) gezeigt, um in Neuronen in Kultur und in vivo9,10. PFFs präsentieren ein zuverlässiges und robustes Modell, um das Fortschreiten der Pathologie von Synuclein in Dopamin-Neuronen zu untersuchen. Wenn PFFs auf kultivierte primärneuronen angewendet oder in das tierische Gehirn injiziert werden, führen sie zur Bildung von ,Synuclein-haltigen Einschlüssen in Neuriten und Zellsoma11, die viele Merkmale in der Lewy-Pathologie rekapitulieren. Beobachtete Einschlüsse sind in Triton X waschmittelunlöslich, ubiquitiniert, mit dem Amyloid-spezifischen Farbstoff Thioflavin S gefärbt und enthalten bei Ser12911,12. Wichtig ist, dass sich diese Einschlüsse nicht in den Knockout-Tieren11bilden, was auf die Abhängigkeit ihrer Bildung von endogenem N-Synuclein hindeutet.

Dennoch ist es schwierig, PFF-induzierte Einschlüsse und Lewy-Pathologie bei PD-Patienten direkt zu vergleichen, da menschliche LBs und LNs sehr heterogen sind3. Die beobachtete Heterogenität der Lewy-Pathologie könnte durch verschiedene Stadien der Bildung, unterschiedliche anatomische Lage oder Unterschiede in der Konformation von falsch gefaltetem Synuclein verursacht werden, die den Aggregationsprozess einführen. Dieselben Faktoren können PFF-induzierte pS129-Syn-positive Einschlüsse beeinflussen. In der Tat, vor kurzem wurde gezeigt, dass PFF-induzierte pS129-Syn positive Einschlüsse in primären neuronalen Kulturen sehr frühe Stadien der Pathologie darstellen, die zu Strukturen reifen können, die nach längerer Inkubationszeit12,13ähnlich sind.

Die Modellierung der frühzeitigen Ausbreitung und Anhäufung von falsch gefaltetem Synuclein mit PFFs ist wertvoll für die Arzneimittelentwicklung, da die Ausbreitung der Lewy-Pathologie als einer der Frühstadium-Krankheitsmarker gilt. Daher können Aggregations-präventive Behandlungen vielversprechend sein, um das Fortschreiten der PD in sehr frühen Stadien zu stoppen oder zu verlangsamen. Mehrere klinische Studien zur Verlangsamung oder Beendigung der Akkumulierung von Synuclein sind im Gange14. Für Patienten im späteren Stadium kann die Transplantation von Dopamin-Neuronenvorläufern eine bessere Behandlungsalternative sein15. Jedoch, Lewy Pathologie wurde in transplantierten embryonalen Neuronen während der post-mortem Analyse der PD-PatientenGehirne dokumentiert 16,17, was auch auf die Notwendigkeit des Schutzes gegen die Akkumulation von Synuclein.

In vitro, Die PFFs von Synuclein sind dafür bekannt, aggregationiert in verewigten Zelllinien oder häufiger in primären Hippocampus- oder kortikalen Neuronen des Nagetiers zu induzieren. Keiner von ihnen sind in der Nähe der Rekapitulation Dopamin-Neuronen10. Das Kultivieren dieser Neuronen erfordert eine dichte Beschichtung einer bestimmten Anzahl von Neuronen in vitro18. Um eine hohe Beschichtungsdichte mit begrenztem Material (z. B. primäre Dopamin-Neuronen) zu erreichen, wird die Mikroinsel-Kultivierungsmethode häufig verwendet. In der Mikroinselkultivierung werden die Zellen zunächst in einem kleinen Tropfen Medium (in der Regel ein paar Mikroliter) zusammengehalten durch Oberflächenspannung in der Mitte eines großenBrunnens 18. Nachdem sich die Neuronen anheften, wird der gesamte Brunnen mit dem Medium gefüllt, während die Zellen bei hoher Dichte im kleinen Beschichtungsbereich verbleiben. Neben der Erreichung einer hohen Beschichtungsdichte verhindern Mikroinseln auch die Beschichtung in der Nähe der Brunnenränder, wo Schwankungen in der Zelldichte und dem Überleben häufig auftreten. Mikroinseln werden oft in relativ großen Brunnen oder Gerichten genutzt; jedoch ermöglicht die Etablierung von neuronalen Midbrain-Kulturen in Mikroinseln im 96-Well-Plattenformat die Untersuchung der Lewy-Pathologie in gutgläubigen Dopamin-Neuronen mit mittlerer bis hoher Durchsatzleistung. In-vitro-Experimente mit diesen Neuronen ermöglichten es uns, den glialzellzelligen neurotrophen Faktor (GDNF) zu entdecken, der das Überleben von reifen Dopamin-Neuronen in vitro und in vivo19,20,21,22 fördert und auch die Bildung von Synuclein-Aggregaten in Dopamin-Neuronen23verhindert. Menschliche Patienten-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Dopamin-Neuronen stellen aufgrund ihrer menschlichen Herkunft und längerer Überlebenszeit in vitro ein genaueres Modell dar. Jedoch, Induktion der -Synuclein-Pathologie in menschlichen Neuronen wird nach mehreren Monaten beobachtet, im Vergleich zu einer Woche in Maus embryonalen Neuronen, und/oder mit mehreren Stressoren (z.B. Kombination von -Synuclein-Überexpression und PFFs)24,25. Darüber hinaus ist die Aufrechterhaltung der menschlichen Dopamin-Neuronen teurer und mühsamer im Vergleich zu primären embryonalen Neuronen, im Wesentlichen ihre Verwendung in Hochdurchsatzanwendungen zu begrenzen.

Darüber hinaus können primäre Dopamin-Neuronalkulturen genetisch verändert (z.B. mit CRISPR/Cas9) und/oder mit pharmakologischen Wirkstoffen behandelt werden23. Sie bilden eine schnelle und reproduzierbare Plattform für Anwendungen wie molekulare Pfadsektion und Arzneimittelbibliothekscreening. Auch wenn aus diesen Kulturen nur begrenztes Material gewonnen werden kann, ist es dennoch möglich, genomische/proteome Analysen in kleinem Umfang durchzuführen. Die Kultivierung primärer Neuronen im 96-Well-Format ist besser für Immunzytochemie- und Fluoreszenzmikroskopie-Techniken, gefolgt von einer hochgehaltigen Phänotypanalyse. Multispektrale Fluoreszenzbilder, die aus der automatisierten Bildgebung von 96 Wellplatten gewonnen wurden, können in quantitative Ergebnisse umgewandelt werden (z. B. die Anzahl der LB-haltigen Neuronen pro Brunnen). Solche Analysen können mit freier Software wie CellProfiler26,27durchgeführt werden. Insgesamt bieten primäre embryonale Midbrain-Kulturen, die in 96 Well-Platten plattiert sind, eine robuste und effiziente Plattform, um Dopamin-Neuronen und die Aggregation von Synuclein zu untersuchen, mit der Möglichkeit für ein Phänotyp-Screening mit hohem Durchsatz.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom finnischen Nationalen Amt für Tierversuche genehmigt und gemäß den europäischen Rechtsvorschriften zum Schutz von Tieren durchgeführt, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden.

1. Vorbereitung

  1. Bereiten Sie Dopamin-Neuron-Medium (DPM) mit 0,46% D-Glucose, 1% L-Glutamin, 1% N2, 0,2% Primocin, abgeschlossen mit DMEM/F12. Filtern Sie das DPM nach dem Mischen der Zutaten. DPM bei 4 °C aufbewahren und jedes Aliquot nur einmal erwärmen.
    ANMERKUNG: DPM sollte GDNF nicht enthalten, da es die Akkumulation von Synuclein in Dopamin-Neuronen23reduzieren wird.
  2. Bereiten Sie silikonisierte Glaspipetten vor, die extrem hydrophob sind, wodurch die Bindung an die Oberfläche und der Verlust von Zellen während der erstmaligen Handhabung embryonaler Neuronen minimiert werden.
    1. 10 ml Siliziumflüssigkeit zu 1 L destilliertem Wasser geben und in einem 2 L-Gefäß unterRühren mischen. Lassen Sie die Glaspipetten 15 min in die Siliziumisierungslösung eintauchen.
    2. Spülen Sie die Pipetten 3-5x mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie die Pipetten über Nacht bei Raumtemperatur (RT) oder für 1-2 h bei 100-120 °C beheizten sterilen Raum, um die Trocknung zu beschleunigen.
    3. Sterilisieren Sie die Pipetten durch Standard-Autoklavierung in einem versiegelten Autoklavenbeutel.
  3. Bereiten Sie Poly-L-Ornithin (PO) beschichtete 96 Brunnenplatten mit transparenten Böden vor, indem Sie 60 L PO-Lösung in die mittleren Bohrungen der 96-Well-Platte einfügen, die für die Aussaat der Neuronen verwendet werden soll, sodass mindestens eine Reihe/Säule von Brunnen an den Rändern der Platte übrig bleibt, um Kanteneffekte zu vermeiden. Bewahren Sie die beschichtete Platte über Nacht bei 4 °C oder 4 h bei RT auf.
  4. Vor der Beschichtung der Zellen, aspirieren PO vollständig und waschen Sie die Zellen dreimal mit 100 l von 1x PBS. 1x PBS aus den Brunnen aspirieren und den Deckel der Platte für eine vollständige Trocknung offen halten.
    HINWEIS: Es ist möglich, gebrauchte PO zu sammeln und für die Wiederverwendung zu filtern. Dies kann für dieselbe PO-Lösung zweimal wiederholt werden.
  5. Fügen Sie 50 l DPM zu zuvor beschichteten Brunnen hinzu. Saugen Sie DPM aus den Brunnen mit einer 100-L-Kunststoffspitze und kratzen Sie gleichzeitig den Boden des Brunnens mit kreisförmigen Bewegungen, um die Beschichtung am Umfang jedes Brunnens zu entfernen. Eine PO-beschichtete Insel wird in der Mitte des Brunnens bleiben.
  6. Unter einer laminaren Haube fügen Sie 10 L DPM in die Mitte jeder beschichteten Insel hinzu, um Mikroinseln zu erstellen.
    HINWEIS: Eine Platte mit DPM-bedeckten Mikroinseln kann während der Isolierung von Zellen für 1–2 h unter der laminaren Durchflusshaube aufbewahrt werden.

2. Isolierung des ventralen Mittelhirnbodens von E13.5 Mausembryonen

HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für Mittelhirn-Bodensezieren Schritte.

  1. Vor der Zerlegung eine 10 cm Petrischale mit Dulbeccos Puffer füllen und auf Eis halten.
  2. Euthanisieren Sie eine E13.5 schwangere weibliche Maus nach den Richtlinien der Institution. Legen Sie die Maus flach auf den Rücken und sprühen Sie den vorderen Körper mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut über der Gebärmutter mit Zange und machen Sie einen Schnitt mit chirurgischer Schere, um die Gebärmutter zu belichten.
  3. Entfernen Sie die Gebärmutter vorsichtig und legen Sie sie in die zuvor vorbereitete Petrischale auf Eis.
  4. Entfernen Sie die Embryonen vorsichtig aus der Gebärmutter, indem Sie die chirurgische Schere unter der laminaren Haube bei RT verwenden. Entfernen Sie alle Plazentarückstände aus den Embryonen mit Zangen und legen Sie sie in eine neue 10 cm Petrischale, die mit Dulbeccos Puffer gefüllt ist.
  5. Schneiden Sie mit Sezierenderzangen oder Nadeln das Hinterviertel des Kopfes von den stellendten Stellen ab, die in Abbildung 1Amit schwarzen Pfeilen markiert sind. Nehmen Sie das geschnittene Stück vom Rest des Embryos ab (Abbildung 1B).
  6. Legen Sie das Hinterteil des geschnittenen Stückes in Richtung des Beobachters (Abbildung 1C) und schneiden Sie es vorsichtig von kaudal zu kranial auf (Abbildung 1D). Von 0,5 mm unter der Schädelöffnung einen 2 mm2-3 mm2 Bereich schneiden, siehe Abbildung 1E.
  7. Sammeln Sie den ventralen Mittelhirnboden (siehe Abbildung 1F) in einem leeren 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Halten Sie das Mikrozentrifugenrohr auf Eis, bis alle Mittelhirnböden darin gesammelt sind.
    HINWEIS: Alternativ können die Mittelhirnböden mit einer 1 ml Mikropipette nach der Zerlegung aller Embryo-Gehirne gesammelt werden.

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Abbildung 1: Zerlegung des Mittelhirnbodens vom E13.5-Mausembryon. (A) Schnittstellen am Hinterkopf des Kopfes sind mit schwarzen Pfeilen und weißen gestrichelten Linien markiert. (B) Das Stück wurde vom Rest des Embryos entfernt. Das entfernte Stück ist eingekreist. (C) Das Stück wurde um 90° gedreht, um dem Betrachter gegenüber zu stehen. (D) Das Stück wurde von den schwarzen Pfeilen geöffnet, von kaudal bis kranial (markiert mit weißer gestrichelter Linie). (E) Von 0,5 mm bis 1 mm unterhalb der Öffnung wurde der 2 mm2-4 mm2 Bereich geschnitten (mit schwarzen Linien markiert). (F) Der ventrale Mittelhirnboden wurde isoliert (mit schwarzem gestricheltem Quadrat markiert). Skalenbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Etablierung primärer embryonaler Midbrain-Kulturen aus E13.5-Mausembryonen im 96-Well-Platten-Format

  1. Nach der Entnahme von Mittelhirnböden aus allen Embryonen in der gleichen 1,5 ml-Röhre, entfernen Sie den verbleibenden Dulbecco-Puffer und waschen Sie die Gewebestücke dreimal mit 500 l Ca2+,Mg2+-frei Hank es Balanced Salt Solution (HBSS).
  2. Entfernen Sie HBSS und fügen Sie dem Rohr 500 l 0,5% Trypsin hinzu. Inkubieren Sie es bei 37 °C für 30 min.
  3. Während der Inkubation 1,5 ml fetales Rinderserum (FBS) bei 37 °C warm, 30 l DNase I zum FBS geben und mischen. Auch die Spitze einer silikonisierten Glaspipette feuerpolieren. Stellen Sie sicher, dass das Loch keine scharfen Kanten hat und etwa die gleiche Größe wie eine 1 ml Mikropipette-Spitze hat.
    HINWEIS: Alternativ kann eine niedrige Haftung von 1 ml Mikropipette-Spitze zur Trituration verwendet werden. Siliziumisierte Glaspipetten scheinen jedoch die besten Ergebnisse zu liefern.
  4. Sobald die Inkubation in Schritt 3.2 endet, 500 l der FBS/DNase-Mischung in das teilweise verdaute Gewebe geben. Verwenden Sie die Glaspipette, um das Gewebe in der FBS/Trypsin-Mischung zu trituieren. Trituieren, bis Gewebe sich in winzige, kaum sichtbare Teilchen auflösen. Vermeiden Sie Blasen während der Trituration.
  5. Lassen Sie die übrig gebliebenen Partikel am Boden des Mikrozentrifugenrohrs durch Schwerkraft ausfallen. Ohne den Niederschlag an der Unterseite zu pfeifen, den Überstand in ein leeres 15 ml konisches Polypropylenrohr zu sammeln.
  6. VERdünnen Sie FBS/DNase I aus Schritt 3.3 (98:2) mit 1.000 l HBSS, um FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) zu erhalten. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten. Fügen Sie 1.000 L der neuen Mischung zu den übrig gebliebenen Partikeln im Mikrozentrifugenrohr hinzu. Trituieren Sie erneut und wiederholen Sie Schritt 3.5.
  7. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt noch einmal, um alle FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) zu verwenden.
  8. Sobald der gesamte Überstand innerhalb des 15 ml-Rohrs (von den Schritten 3.5, 3.7 und 3.8) gesammelt ist, verwenden Sie eine Tischzentrifuge, um den Überstand (ca. 3 ml) bei 100 x gfür 5 min herunterzudrehen. Entfernen Sie den Überstand, ohne die Pelletzellen an der Unterseite zu berühren.
  9. Waschen Sie das Zellpellet, indem Sie 2 ml DPM in das Rohr geben und drehen Sie es bei 100 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche 2x, um den Schmutz in den pelleted Zellen zu minimieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie immer frisches, erwärmtes DPM für die kultivierten Neuronen. Für die Waschschritte muss DPM nicht frisch sein, sondern sollte auf 37 °C vorgewärmt werden.
  10. Verdünnen Sie die Zellen mit frischem, warmem DPM und übertragen Sie sie in ein Mikrozentrifugenrohr. Die Menge an DPM für Verdünnung hängt von der Anzahl der Embryonen ab, die für die Gewebesektion verwendet werden. Verwenden Sie z. B. 150 l DPM, um die Zellen von zehn Embryonen zu verdünnen.
  11. Übertragen Sie 10 l Zellen in DPM in ein Mikrozentrifugenrohr. Mischen Sie sie mit 10 l von 0,4% Trypan blaufleck. Zählen Sie lebende (d. h. Trypan blue negative) Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
    HINWEIS: Verwenden Sie 30.000 Zellen für die Beschichtung pro Brunnen, um 1.000 Dopamin-Neuronen pro Brunnen zu erhalten. Wenn die Zelldichte höher als 30.000 Zellen pro 6 L ist, verdünnen Sie die Zellen vor der Beschichtung mit DPM weiter, so dass das Saatvolumen nicht weniger als 6 l beträgt.
  12. Ohne den Boden der Brunnen zu berühren, entfernen Sie das DPM von den Mikroinseln, die in Schritt 1.6 erstellt wurden.
  13. Um an jedem Brunnen eine reproduzierbare Zelldichte zu erhalten, mischen Sie die Zellen durch sanftePipettieren vor der Beschichtung im Brunnen. Mit einer 1–10-L-Mikropipette fügen Sie 6 L Zellen in die Mitte des Brunnens an der Stelle jeder ehemaligen Mikroinsel hinzu.
  14. Füllen Sie die leeren Brunnen an den Rändern der Platte mit 150 l Wasser oder 1x PBS, um die Verdunstung aus den Brunnen, die neuronale Kulturen enthalten, zu minimieren. Inkubieren Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 °C, 5%CO2 für 1 h.
  15. Nach 1 h entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator, fügen Sie 100 L DPM in jeden Brunnen mit Zellen hinzu und legen Sie sie wieder in den Inkubator.
  16. Zwei Tage nach der Beschichtung (Tag in vitro 2 oder DIV2) 25 l entfernen und 75 l frisches DPM hinzufügen, um das endgültige Medienvolumen auf 150 l zu bringen und eine Verdunstung so weit wie möglich zu vermeiden.
  17. Tauschen Sie die Hälfte des Mediums mit frischem DPM (d. h. entfernen Sie 75 l und fügen Sie 75 l frischeS DPM) bei DIV5 hinzu. Führen Sie nach DIV5 keine Medienänderungen durch.

4. Induktion von Synuclein-Aggregaten in primären embryonalen Dopamin-Neuronen durch Aussaat mit vorgeformten Fibrillen

Protokolle für die Beschaffung und Validierung von PFFs wurden in mehreren neueren Veröffentlichungen11,28,29,30sorgfältig beschrieben und diskutiert. Reinigen Sie nach jeder Arbeit mit PFFs die laminare Haube oder alle Geräte, die die PFFs mit 1% SDS kontaktiert haben könnten, dann mit 70% Ethanol31.

  1. Verdünnen Sie vor dem Experiment die PFFs mit 1x PBS auf eine Endkonzentration von 100 g/ml. Beschallen Sie die verdünnten PFFs in Mikrozentrifugenrohren mit einem Badbeschallgerät bei hoher Leistung mit Wasserbadkühlung bei 4 °C für 10 Zyklen, 30 s ON/30 s AUS.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Fibrillen richtig beschallt werden, um Fragmente von 50 nm Länge zu erzeugen. Die Größe der beschallten PFFs kann direkt anhand von Transmissionselektronenmikroskopbildern von PFFs gemessen werden, die von Patterson et al.30beschrieben werden. Beschallung kann wie oben beschrieben in einem Hochleistungsbad Beschallungsgerät erreicht werden. Alternativ kann ein Spitzenschallgerät30verwendet werden. Beschallte PFFs können bei -80 °C in kleinen Aliquots gelagert werden, um mehrere Gefrier-/Auftauzyklen zu vermeiden.
  2. Auf DIV8, fügen Sie 3,75 l von 100 g/ml PFFs pro Bohrung zu den 150 l Medium im Brunnen zu einer Endkonzentration von 2,5 g/ml hinzu. Verwenden Sie die gleiche Menge von 1x PBS für die Steuerungsgruppe.
  3. 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS vorbereiten und die Aliquots bei -20 °C lagern. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.
    HINWEIS: PFA ist giftig; tragen Sie eine Maske und Handschuhe während der Vorbereitung, arbeiten Sie immer unter einer laminaren Haube, und entsorgen Sie alle festen und flüssigen PFA-Abfälle gemäß den Anweisungen der Institution.
    1. 500 ml 1x PBS in einem 1 L-Schiff erwärmen. Legen Sie einen Rührstab in das Gefäß und setzen Sie das Gefäß auf einen Magnetrührer mit einer Heizfunktion. Stellen Sie die Temperatur zwischen 40–60 °C ein, um das Kochen zu verhindern und gleichzeitig die Lösung warm zu halten.
    2. 20 g PFA-Pulver unter der Haube in einem Einweg-Kunststoff-Messbehälter messen. Fügen Sie das PFA-Pulver vorsichtig in das mit 1x PBS gefüllte Gefäß ein. Beginnen Sie mit dem Rühren der Lösung.
    3. Fügen Sie 200 l 5 M Natriumhydroxid in die Lösung ein und rühren Sie das Rühren für ca. 15 min, bis sich das PFA vollständig auflöst.
    4. Nachdem die Lösung homogen erscheint, fügen Sie 168 l 5 M Chlorwasserstoff hinzu, um den pH-Wert auf 7 zu balancieren. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einwegfarbfesten pH-Indikatorstreifen.
    5. Entfernen Sie das Gefäß aus der Heizung und lassen Sie es auf RT abkühlen. Filtern Sie die Lösung und aliquot für die Lagerung bei -20 °C. Die Aliquots bei RT vor dem Gebrauch auftauen und danach nicht wieder einfrieren.
  4. Entfernen Sie auf DIV15 alle Medien aus den Brunnen durch Pipettieren. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l 4% PFA hinzu, um die Zellen zu fixieren und 20 min bei RT zu brüten. Nach der Inkubation entfernen Sie die PFA aus den Brunnen und fügen Sie 100 l 1x PBS zu jedem Brunnen hinzu, um die Zellen zu waschen. 1x PBS entfernen und 2x mehr waschen.
  5. Lassen Sie 100 l 1x PBS in jedem Brunnen, um eine Trocknung zu vermeiden. Bewahren Sie die Platte bei 4 °C auf, bis die Immunchemie durchgeführt wird.

5. Immunfluoreszenzfärbung und automatisierte Bildgebung von primären embryonalen Dopamin-Neuronen in 96 Brunnenplatten

  1. Entfernen Sie 1x PBS und permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 100 l von 0,2% Triton X-100 in PBS (PBST) pro Bohrkörper hinzufügen und bei RT für 15 min inkubieren.
  2. Entfernen Sie PBST und fügen Sie dem PBST 50 l von 5% normalem Pferdeserum (NHS) pro Brunnen hinzu. Um die unspezifische Antigenaktivität zu blockieren, inkubieren Sie bei RT für 1 h.
  3. Verdünnen Sie die primären Antikörper gegen TH und pS129-Syn (1:2.000) in 5% NHS in PBST. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l verdünnte Antikörper hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
  4. Entfernen Sie Antikörper und fügen Sie jedem Brunnen 100 L 1x PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. 1x PBS entfernen und 2x waschen.
  5. Um das Bleichen von fluoreszierenden Molekülen zu verhindern, beginnen Sie unter minimalen Lichtbedingungen zu arbeiten. Verdünnen Sie die sekundären fluoreszierend markierten Antikörper (1:400) in PBST. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l verdünnte Antikörper hinzu und inkubieren Sie bei RT 1 h.
  6. Entfernen Sie die Antikörperlösung und fügen Sie jedem Brunnen 100 L 1x PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. 1x PBS entfernen und 2x waschen.
  7. Entfernen Sie 1x PBS, fügen Sie 50 l von 200 ng/mL 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) pro Brunnen hinzu, um die Kerne der kultivierten Zellen zu färben und bei RT für 10 min zu brüten.
  8. Waschen Sie Zellen 3x mit 100 l 1x PBS für je 5 min. Halten Sie nach der letzten Wäsche jeweils 100 l 1x PBS in jedem Brunnen auf. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und lagern Sie sie bei 4 °C bis zur Bildgebung.
  9. Bild primäre embryonale Dopamin-Neuronen in einer 96 gut sichtbaren Platte mit einem high-content Plattenscanner (siehe Tabelle der Materialien) mit einem 10-fachen Objektiv ausgestattet.
  10. Passen Sie die Einstellungen basierend auf den Spezifikationen der 96 Well Platte an, wie Plattentyp, Hersteller, Größe, Abstand zwischen Brunnen sowie Art und Menge des Mediums.
  11. Wählen Sie den bildgebenden Bereich des Brunnens aus, um alle Zellen auf einer Mikroinsel abzudecken. Wählen Sie ein Beispiel gut aus, um den Autofokus anzupassen. Richten Sie den anfänglichen Fokus auf DAPI.
  12. Kalibrieren Sie die Erfassungszeit für jeden Fluoreszenzkanal, basierend auf der Intensität der Färbung in Kontrollbrunnen. Passen Sie die Parameter so an, dass man in PFF-behandelten Kontrollbrunnen deutlich Dopaminzellen unterscheiden kann, die pS129-Syn-Aggregate im Zellsoma enthalten, was eine eindeutige Quantifizierung von pS129--syn-positiven und pS129-syn-negativen Zellen ermöglicht.
    ANMERKUNG: Brunnen, die keine PFFs enthalten, sollten keine Färbung für pS129-Syn haben; Daher können diese Bohrungen als Negativkontrolle für die Einstellung der pS129-Syn-Intensität verwendet werden.
  13. Stellen Sie alle ausgewählten Brunnen mit einem 10-fachen Objektiv gleichzeitig für alle Kanäle mit Immunfluoreszenzfärbung mit genau den gleichen Parametern auf.
  14. Optional, Label-Synuclein-Einschlüsse in einer Teilmenge der Brunnen mit Antikörpern spezifisch für fadenförmigen - Synuclein zu bestätigen, dass Veränderungen in der Anzahl der pS129-syn-positive Einschlüsse spiegeln die Verringerung der Proteinakkumulation anstatt Hemmung der Phosphorylierung oder Dephosphorylierung von pS129-syn.
  15. Wiederholen Sie Schritt 5.3, der den pS129-Synsynsyn-Antikörper durch den Antikörper a-Synuclein-Filament (1:2.000) ersetzt. Bild das gefärbte aggregierte Synuclein wie in Schritt 5.13.

6. Bildanalyse mit hohem Inhalt

HINWEIS: Dieser Schritt wird mit der Open-Access-Software CellProfiler Version 3.15 und CellProfiler Analyst Version 2.2.1 durchgeführt. 27,32. Mit etwas Erfahrung können die analogen Bildanalyse-Pipelines jedoch in einer anderen Version oder einer ähnlichen Software eingestellt werden. Eine ausführliche Erläuterung finden Sie auf der Softwareseite (siehe Materialtabelle).

  1. Laden Sie die Software CellProfiler und CellProfileer Analyst herunter und installieren Sie sie.
  2. Öffnen Sie CellProfiler. Datei auswählen| Import| Pipeline aus Datei und Laden der bereitgestellten Beispielpipeline, TH_LB_V1.cpipe-Datei (siehe Ergänzende Dateien).
    HINWEIS: Die Beispielpipelines erfordern spezifische Anpassungen in Abhängigkeit von den Eigenschaften der erfassten Bilder und der Bildaufnahmeplattform. Example_Imageskann für die erste Testversion der Software verwendet werden.
  3. Laden Sie Bilder, die analysiert werden sollen, indem Sie sie in das Images-Modulziehen. Verwenden Sie Filteroptionen, um nur Bilddateien aus dem geladenen Ordner auszuwählen.
    1. Verwenden Sie das Metadatenmodul, um Gut-, Ansichts- und Kanalinformationen aus dem Bilddateinamen zu extrahieren. Klicken Sie auf das Lupensymbol und geben Sie den regulären Ausdruck ein, um Plate-, Nun-, Imaging-Site- und Channel-Informationen aus Dateinamen zu extrahieren.
      HINWEIS: Der reguläre Ausdruck hängt von der Dateibenennungskonvention des Plattenmikroskops ab. Wenn Sie auf das Fragezeichen neben der Lupe klicken, werden Details zur Syntax angezeigt.
    2. Wählen Sie unter NamesAndTypes-Modul die richtigen Kanalnummern für DAPI-, TH- und pS129--syn-Färbung aus (Standardkanäle 1, 2und 3). Wählen Sie im Modul Gruppen "Nein" aus.
  4. Verwenden Sie IdentifyPrimaryObjects-Module, um Dopamin-Neuronen mithilfe von TH-Färbung von Zellsoma zu segmentieren.
    HINWEIS: Bestimmte Werte erfordern eine anfängliche Optimierung basierend auf der Art und Weise, wie Platten gebeizt und abgebildet werden. Werden nachfolgende Platten in ähnlicher Weise verarbeitet, so sind keine oder nur minimale weitere Anpassungen erforderlich.
  5. Verwenden Sie das MeasureObjectIntensity-Modul, um Fluoreszenzintensitätsinformationen aus TH- und DAPI-Kanälen zu erfassen.
  6. Verwenden Sie das MeasureObjectSizeShape-Modul, um Größen- und Formfeatures von Segment-Dopamin-Neuronen zu messen.
  7. Verwenden Sie das MeasureTexture-Modul, um Textur-Feature-Informationen aus dem TH-Kanal aus segmentierten Dopamin-Neuronen zu messen.
  8. Verwenden Sie das ExportToDatabase-Modul, um Messungen in der Datenbank zu speichern.
    1. Namen Datenbankdatei nach dem Experimentbenennungsschema (z.B. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Wählen Sie Ausgabeordner für die Datenbankdatei aus. Die Datenbankdatei kann mehrere Gigabyte groß sein und sollte vorzugsweise im übergeordneten Ordner der Bilddateien gespeichert werden.
  9. Öffnen Sie CellProfiler Analyst, und wählen Sie die Datei V1_THCells.properties aus, die in Schritt 6.8 erstellt wurde. Offene Tools| Klassifier.
  10. Segmentierte Zellen in zwei Kategorien sortieren: positiv (d. h. korrekt segmentierte Dopamin-Neuronenkörper) und negativ (d. h. Segmentierung und Färbeartefakte) Siehe Abbildung 2A und 2B.
    1. Legen Sie die Anzahl der abgerufenen Zellen auf 50 zufällige Zellen fest, und klicken Sie auf Abrufen (dies lädt Bilder der in Schritt 6.4 segmentierten Zellen). Sortieren Sie mindestens 30 Zellen in jedem Lagerplatz, indem Sie sie in den entsprechenden Lagerplatz am unteren Rand des Fensters ziehen. Holen Sie sich bei Bedarf weitere Zellen ab.
    2. Wählen Sie im Dropdown-Menü Schnelles Sanftes Steigern mit 50 max Regeln verwenden und klicken Sie auf Zug.
    3. Legen Sie "Fetch" auf 50 positive Zellen fest, und drücken Sie Fetch, um TH-positive Zellen gemäß dem Klassifier zu erhalten (Abbildung 2A). Verwenden Sie das erhaltene Ergebnis, um die Qualität des trainierten Klassifiierers zu bewerten.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 6.10.1–6.10.3, indem Sie neue Beispielzellen zum Trainieren des Klassifiers hinzufügen, bis die Ergebnisse zufriedenstellend sind.
    5. Wählen Sie Erweitert| Regeln bearbeiten... und in einem neuen Fenster den gesamten Text (Strg+a) auswählen und kopieren Sie ihn (Strg-c) auf den Notizblock (Strg-v). Speichern als TH_rules.txt-Datei.
      HINWEIS: Abhängig von der Dichte der neuronalen Kultur und der Qualität der Färbung und Bildgebung ist dieser Schritt möglicherweise nicht erforderlich, da es möglich sein könnte, Parameter in Schritt 6.4 festzulegen, um nur TH-positive Zellen mit hoher Genauigkeit zu segmentieren. In diesem Fall ist kein ganzer TH_LB_V1.cpipe-Lauf erforderlich, und die richtigen Parameter der IdentifyPrimaryObjects-Module sollten direkt in das entsprechende Modul in TH_LB_V2.cpipeeingefügt werden.

figure-protocol-2
Abbildung 2: Quantifizierung von Dopamin-Neuronen und pS129-syn-positiven Dopamin-Neuronen mit CellProfiler Analyst Software basierend auf DAPI, TH, und pS129-Syn-Immunfluoreszenz. (A) TH-Zellen im positiven Behälter wurden basierend auf DAPI-Färbung (blau) ausgewählt, die mit einem kleinen Quadrat an der ersten Zelle markiert ist, die am Bild ausgewählt ist, und der umgebenden TH-Färbung (grau) bei Soma. (B) Nicht-Zell-Artefakte wurden in den negativen Behälter gelegt. (C) pS129-syn positive TH-Neuronen wurden auf der Grundlage einer großen Einbeziehung der pS129-Syn-Färbung (rot) ausgewählt, die mit einem kleinen Quadrat an der ersten Zelle markiert ist, die am Bild ausgewählt wurde, um die Kerne oder am Zellsoma. (D) TH-Zellen ohne solche pS129-Syn-Einschlüsse wurden in den negativen Behälter gelegt. Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Öffnen Sie CellProfiler, und wählen Sie Datei| Import| Pipeline aus Datei und Laden TH_LB_V2.cpipe-Datei. Wiederholen Sie die Schritte 6.3–6.7. Dieser Teil der Pipeline sollte mit TH_LB_V1.cpipe identisch sein.
  2. Verwenden Sie das FilterObjects-Modul, um nur echte TH-positive Zellen für die weitere Analyse zu übergeben.
    1. Wählen Sie den Filtermodus filtering mode auf Regeln. Wählen Sie in Regeln oder Klassifierdateinamen die Datei TH_rules.txt aus, die in Schritt 6.10.5 erstellt wurde.
    2. Legen Sie das Feld Klassennummer auf 1 fest, wenn TH-positive Zellen nach unten links sortiert wurden.
  3. Verwenden Sie das MeasureObjectIntensity-Modul, um Fluoreszenzintensitätsinformationen aus dem pS129-Kanal zu erfassen.
  4. Verwenden Sie das MeasureTexture-Modul, um Textur-Feature-Informationen aus DEM TH-Kanal aus gefilterten Zellen zu messen.
  5. Verwenden Sie das MeasureObjectSizeShape-Modul, um Größe und Shape-Features gefilterter Zellen zu messen.
  6. Verwenden Sie das ExportToDatabase-Modul, um Messungen in der Datenbank zu speichern.
    1. Benennen Sie die Datenbankdatei entsprechend mit Ihrem Experimentbenennungsschema (z. B. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Wählen Sie den Ausgabeordner für die Datenbankdatei aus.
  7. Öffnen Sie CellProfiler Analyst, und wählen Sie V2_THpos.properties-Datei aus.
    1. Sortieren Sie segmentierte Zellen in zwei Kategorien – pS129-syn positive und pS129-syn negative Zellen (Abbildung 2C,D).
    2. Legen Sie die Anzahl der abgerufenen Zellen auf 50 zufällige Zellen fest, und klicken Sie auf Abrufen (dies lädt Bilder von Zellen, die in Schritt 4 segmentiert sind). Sortieren Sie mindestens 30 Zellen in jedem Lagerplatz, indem Sie sie in den entsprechenden Lagerplatz am unteren Rand des Fensters ziehen.
    3. Wählen Sie im Dropdown-Menü Schnelles Sanftes Steigern mit 50 max Regeln oder Random Forest-Klassifikatoren aus. Klicken Sie auf Zug.
    4. Legen Sie "Fetch" auf 50 positive Zellen fest, und drücken Sie Fetch, um pS129-syn-positive Zellen gemäß Klassifier zu erhalten (Abbildung 2C). Legen Sie "Fetch" auf 50 negative Zellen fest, und drücken Sie Fetch, um pS129-syn negative Zellen gemäß Klassifier zu erhalten (Abbildung 2D). Bewerten Sie die Qualität des trainierten Klassifiierers.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 6.17.2–6.17.4, indem Sie neue Beispielzellen hinzufügen, um den Klassifier zu trainieren, bis die Ergebnisse zufriedenstellend sind.
  8. Klicken Sie auf Ergebnis Alle, um Ergebnisse Tabelle zusammenfassungsbezogene Anzahl von pS129-syn positive und negative Dopamin-Neuronen in jedem Brunnen.

Ergebnisse

Wenige Tage nach der Beschichtung (DIV1–DIV3) wurde eine Hellfeldmikroskopie durchgeführt, um die Gesundheit und homogene Ausbreitung der kultivierten Zellen und die Homogenität dieser Bedingungen an den einzelnen Brunnen zu bewerten (Abbildung 3). Kultivierte Mittelhirnzellen wurden homogen innerhalb der Mikroinsel verteilt, die vor der Beschichtung entstanden war (Abbildung 3A,B). Primäre Neuronen hatten sich homogen auf dem beschichteten Boden niedergelassen und neuronale Projektionen aufgestellt (Abbildung 3B). Ein kleiner Zellklumpen (Durchmesser kleiner als 150 m) wurde am Brunnen beobachtet und als Beispiel gezeigt (Abbildung 3C).

figure-results-1
Abbildung 3: Wenige Tage nach der Beschichtung (z. B. DIV3) wurde der Zustand der primären Mittelhirnkulturen mit der Hellfeldmikroskopie beobachtet. (A) Kultivierte Zellen verteilen sich über die Mitte des Brunnens innerhalb der PO-beschichteten Mikroinsel mit einem ungefähren Radius von 4,4 mm (dargestellt mit weißen Pfeilen), die durch Kratzen PO aus ca. 1 mm Brunnenumfang (mit schwarzen Pfeilen dargestellt) erzeugt werden. (B) Kultivierte Primärneuronen verteilten sich homogen innerhalb des Gebiets und neuronale Projektionen (markiert mit roten Pfeilspitzen) wurden beobachtet. (C) Ein Zellklumpen mit einem Durchmesser kleiner als 150 m ist mit blauen Pfeilspitzen gekennzeichnet. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Primäre Maus-Midbrain-Kulturen wurden mit Anti-TH- und Anti-PS129-Synsyn-Antikörpern immunisiert und nach 15 Tagen in vitro mit einem automatisierten Mikroskop abgebildet. Beschichtete Mikroinseln boten einen sperren Bereich für die Befestigung von Zellen in der Mitte von Brunnen (Abbildung 4A,B). Dopamin-Neuronen, die mit TH-Marker immunomarkiert sind, wurden in einer Monoschicht, getrennt voneinander, ohne Klumpen verteilt(Abbildung 4A' und 4B').

figure-results-2
Abbildung 4: Bei DIV15 wurden 800–1.000 Dopaminzellen von jeder Mikroinsel mit oder ohne PFF-Behandlung quantifiziert. Repräsentative Bilder embryonaler Midbrain-Kulturen, die mit Anti-TH- und Anti-pS129-Syn-Antikörpern immonuliert sind. (A, A', A'') Kontrollzellen ohne PFF-Behandlung. (B, B', B'') PFF-behandelte Zellen mit pS129-Syn-Einschlüssen. (C) Quantifizierung der TH-positiven Zellzahlen in Brunnen, die mit Fahrzeug (Kontrolle), PFFs oder PFFs mit 50 ng/mL GDNF behandelt werden. (D) Quantifizierung von pS129-Syn-Aggregaten in TH-positiven Zellen, die mit Fahrzeug (Kontrolle), PFFs oder PFFs mit 50 ng/mL GDNF behandelt werden. Die statistische Signifikanz wurde mit dem zufälligen Blockdesign ANOVA berechnet. **p < 0,01, n = 4 Einzelplatten (biologische Repliken), jeweils mit 3–6 Brunnen pro Behandlungsgruppe (technische Wiederholungen). Skalenbalken = 300 m für A, B; 50 m für A', B'; 25 m für A'', B''. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Während Kulturen ohne PFF-Behandlung kein pS129-Synsyn-Signal hatten (Abbildung 4A' und 4A''), entwickelten Kulturen, die mit '-Synuclein PFFs behandelt wurden, pS129-'syn positive Einschlüsse (Abbildung 4B' und 4B''). Die In-vitro-PFF-Behandlung für 7 Tage verursachte im Vergleich zu anderen experimentellen Gruppen keinen signifikanten Rückgang der Anzahl von TH-positiven Neuronen (Abbildung 4C). PFF-behandelte Kulturen hatten eine Population von 40% der pS129-syn positiven TH-positiven Dopamin-Neuronen. Die Behandlung mit positiver Kontrolle, GDNF, reduzierte den Prozentsatz der TH-positiven Dopamin-Neuronen mit pS129-syn positiven Einschlüssen (Abbildung 4D, siehe auch die Rohdaten und Beispielbilder in den Ergänzenden Dateien).

Ergänzende Dateien: Beispielpipelines für die Bildanalyse mit hohem Inhalt mit CellProfiler und den CellAnalyst-Softwarepaketen, Beispielbildern und Rohdaten für Abbildung 4E, F. (1-9) Example_Images. Öffnen Sie diese Bilder mit ImageJ oder CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Schritte 6.2–6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Schritte 6.11–6.18) Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Verbreitung der Lewy-Pathologie, von der pS129-Synsyn ein wichtiger Bestandteil ist, ist ein histopathologisches Kennzeichen von PD. Das Stoppen oder Verlangsamen der Anhäufung von aggregierten pS129-Synsynas kann die Degeneration von Dopaminneuronen und das Fortschreiten der Alphasynukulanopathie verlangsamen. Allerdings muss noch ein mechanistisches Verständnis darüber hergestellt werden, wie die pS129-Syn-Aggregation zum Untergang von Dopamin-Neuronen beiträgt. Beweise aus humanen postmortalen Studien an Hirnproben von Patienten in verschiedenen Stadien der Krankheit sowie beobachtung der pS129-syn positive Einbeziehung in transplantierte fetale Neuronen stark legt die Ausbreitung der Lewy Pathologie zwischen den Zellen16,17,33. Folglich wurde die prionartige Ausbreitung von pS129-Syn vor kurzem mit Hilfe von '-Synuclein PFFs9,10rekapituliert. Die Etablierung eines robusten, kostengünstigen und relativ hohen oder mittleren Durchsatzmodells der PS129-Syn-Verbreitung und -Akkumulation, insbesondere in Dopamin-Neuronen, kann die Suche nach neuartigen Behandlungen und Verbindungen, die diesen Prozess modifizieren, erheblich beschleunigen.

Da der Verlust von Dopamin-Neuronen ist die Hauptursache für motorische Symptome in PD und diese Zellen besitzen viele einzigartige Eigenschaften2,34,35, Modellierung der Prion-ähnliche Verbreitung von pS129-Syn in Dopamin-Neuronen ist die relevanteste Art von Modell aus der translationalen Perspektive. Protokolle, die Mikroinselkulturen embryonaler Midbrain-Neuronen auf 4 Brunnenplatten und halbautomatische Quantifizierung verwenden, wurden zuvor18beschrieben. Das hier beschriebene Protokoll wurde an 96 Brunnenplatten angepasst und ermöglicht eine weniger mühsame Vorbereitung von Mikroinseln, so dass ein erfahrener Forscher an einem Werktag bis zu vier Platten mit jeweils 60 Brunnen vorbereitet. Die Kultivierung von Dopamin-Neuronen in 96 Brunnenplatten ermöglicht das Testen von Medikamenten in geringeren Mengen und ermöglicht hohe Transduktionsraten mit Lentivirus-Vektoren. Es ist auch möglich, verschiedene Behandlungen zu kombinieren, um komplexere Experimente durchzuführen.

Vor der Anwendung von Behandlungen (einschließlich PFFs) sollte die Qualität der Kultivierung mit der Hellfeldmikroskopie überprüft werden. Wenn das Mikroskopiesystem keine CO2-Kammer mit Erhitzung nutzt, sollten die Zellen nicht mehr als ein paar Minuten außerhalb des Inkubators aufbewahrt werden, da primäre Maus-Dopamin-Neuronen empfindlich und leicht beansprucht sind. Aus dem gleichen Grund wird empfohlen, die erste Bildgebung nach 24 h Inkubation (zwischen DIV1-DIV3) zu machen. Die Zellen sollten mit den vorhandenen Zellkörpern am Leben zu sein und sich auf der Mikroinsel homogen ausbreiten. Primäre Neuronen hätten sich auf dem PO-beschichteten Boden niedergelassen und begonnen, neuronale Projektionen zu erstellen. Es ist möglich, kleine Zellklumpen (d. h. einen Durchmesser kleiner als 150–200 m) zu beobachten, die gebildet werden können, wenn der Triturierungsprozess nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird oder die Beschichtungsdichte höher ist als empfohlen. Diese kleinen Klumpen würden das Experiment nicht beeinflussen, es sei denn, sie sind mehr als ein paar pro Brunnen und/oder größer. Verklumpte Zellen machen es sehr schwierig, immunhistochemische Marker und einzelne Zellen während der Bildanalyse zu identifizieren. Es ist wichtig, solche Klumpen durch sorgfältige Beschichtung, Trituierung und Kontrolle der Beschichtungsdichte zu vermeiden. Wenn die Homogenität dieser Bedingungen an bestimmten Brunnen nicht beobachtet werden kann, schließen Sie diese defekten Brunnen nicht in das Experiment ein. Ein solcher Ausschluss sollte vor der Durchführung von Behandlungen erfolgen.

Darüber hinaus ermöglicht der Einsatz von 96 Wellplatten den komfortablen Einsatz von Mehrkanalpipetten bei Färbevorgängen und eine direkte Visualisierung mit automatischen Plattenmikroskopen, wodurch der Durchsatz weiter erhöht wird. Der Einsatz der automatisierten Bildquantifizierung ist für die Analyse der Daten von contentreichen Bildverarbeitungsplattformen unerlässlich. Zusätzlich zu der Fähigkeit, Tausende von Bildern aus jedem Experiment zu verarbeiten, gewährleistet es eine unvoreingenommene, identische Quantifizierung aller Behandlungsgruppen. Der für die Bildanalyse vorgeschlagene Workflow basiert auf einfachen Prinzipien der Segmentierung von Dopamin-Neuronen, der Filterung korrekt segmentierter Zellen durch überwachtes maschinelles Lernen und anschließender Quantifizierung von Phänotypen (pS129-syn positiv und pS129-syn negativ), wiederum durch überwachtes maschinelles Lernen. Obwohl mehrere verschiedene Ansätze für diese Aufgabe vorgesehen werden können, haben wir festgestellt, dass die Kombination von Segmentierung mit maschinellem Lernen aufgrund der hohen Beschichtungsdichte, der unterschiedlichen Formen von Dopaminneuronen und des Vorhandenseins stark gefärbter Neuriten die robusteste für Dopaminkulturen ist. Der vorgeschlagene Bildanalysealgorithmus wurde in CellProfiler und CellProfiler Analyst, Open Source, frei verfügbarer High-Content-Bildanalysesoftware26,27implementiert. Der Algorithmus könnte auch mit anderer Bildanalyse-Software implementiert werden, entweder Open Source (z.B. ImageJ/FIJI, KNIME) oder proprietär. Unserer Erfahrung nach opfern diese jedoch häufig Anpassungsfunktionen für eine einfache Bedienung und funktionieren daher möglicherweise nicht gut in komplizierten Analysen. Wir haben festgestellt, dass die Softwarepakete CellProfiler und CellProfiler Analyst besonders zuverlässige Ergebnisse liefern, indem sie eine beträchtliche Anzahl implementierter Algorithmen, extreme Flexibilität bei der Gestaltung von Workflows und gleichzeitige Handhabung und effiziente Verarbeitung von Bilddaten mit hohem Inhalt kombinieren.

Das beschriebene Protokoll könnte auch für die Quantifizierung anderer zellulärer Phänotypen angepasst werden, die durch Immunfärbung mit verschiedenen Antikörpern gekennzeichnet sind, wie z. B. Marker anderer neuronaler Populationen (z. B. DAT, GAD67, 5-HT usw.) und Proteinaggregate (z. B. Phospo-Tau, Ubiquitin). Mehrere fluoreszierende Marker könnten auch kombiniert werden, um mehrere Phänotypen zu unterscheiden (z. B. Zellen mit Einschlüssen in verschiedenen Reifestadien). Die automatisierte Klassifizierung mehrerer Phänotypen sollte auch in den beschriebenen Bildanalyse-Pipelines einfach zu implementieren sein, indem lediglich ein Kanal mit immunfluoreszierenden Bildern zusätzlicher Marker zu Messschritten hinzugefügt und Zellen in mehrere Abschnitte sortiert werden. Die gleichzeitige Nutzung mehrerer Marker würde jedoch die Optimierung der Immunfärbungs- und Bildgebungsbedingungen erfordern. Zusätzlich wird für eine bessere Qualität der Immunfluoreszenz-Bildgebung die Verwendung spezieller schwarzwandigen 96-Wellplatten empfohlen, die explizit für das Fluoreszenzmikroskop entwickelt wurden. Diese können jedoch erheblich teurer sein als Standard-Zellkulturplatten, die für die in unserem Protokoll beschriebene Analyse ausreichen.

Art und Qualität der genutzten PFFs sind für das Ergebnis der Experimente entscheidend. PFFs können sowohl die Robustheit des Assays als auch die Interpretation der Ergebnisse beeinflussen. Die Vorbereitungsbedingungen könnten die Aussaateffizienz von PFF beeinträchtigen, und in der Tat wurden PFF-"Stämme" mit unterschiedlichen physiologischen Eigenschaften36berichtet. Nichtsdestotrotz geht die Vorbereitung und Validierung von PFFs über den Rahmen dieses Artikels hinaus und wurde in mehreren Publikationen11,28,29,30beschrieben. Zusätzlich zum Vorbereitungsprotokoll sollten je nach den besonderen Versuchsbedingungen die Ursprungsarten von '-Synuclein in PFFs (z. B. Maus, Mensch) und die Verwendung von Wild-Typ oder mutiertem Protein (z. B. humanes A53T-Synuclein) berücksichtigt werden. Die Induktion der pS129-Syn-Akkumulation durch PFFs war nachweislich vom Alter der Kultur (d. h. Tagen in vitro) abhängig, wobei reifere Kulturen eine ausgeprägtere Induktion zeigten11. Dies ist wahrscheinlich auf die erhöhte Anzahl von neuronalen Verbindungen in reiferen Kulturen, und erhöhte .-Synuclein-Protein-Spiegel. In unseren Händen lieferte die Behandlung mit PFFs bei DIV8 die robustesten Ergebnisse, mit ausgeprägter Anhäufung von pS129-Syn bei Dopamin-Neuronensoma, ohne das neuronale Überleben zu gefährden. Das beschriebene Protokoll eignet sich gut für die Untersuchung von Behandlungen, die frühe Ereignisse modifizieren, die zur Aggregation von endogenem Synuclein führen, da wir pS129-syn positive Einschlüsse zu einem relativ frühen Zeitpunkt, 7 Tage nach der Impfung mit PFFs, quantifizieren. Zu diesem Zeitpunkt sind intrasomale Einschlüsse in einem signifikanten Zellanteil vorhanden und können leicht durch Immunfärbung unterschieden werden, während kein PFF-induzierter Zelltod beobachtet wird, was die Interpretation der Ergebnisse vereinfacht. Da sich die Morphologie und Zusammensetzung von PFF-induzierten Einschlüssen im Laufe der Zeit ändern kann12,13, könnte das beschriebene Protokoll grundsätzlich geändert werden, um reifere Einschlüsse durch Fixierung und Immunfärbung zu späteren Zeitpunkten zu untersuchen. Jedoch, Dopamin-Neuronen in kultur für länger als 15 Tage zu halten erfordert extreme Pflege, und könnte zusätzliche Variation enden, weil Zellen nicht unabhängig von PFF-Impfung überleben. Darüber hinaus erschweren erweiterte Kulturen die Behandlungspläne für Medikamente. Viele Verbindungen haben begrenzte oder nicht schlecht charakterisierte Stabilität im Zellkulturmedium, und die Auffüllung eines Medikaments ist nicht trivial, weil der vollständige Austausch von Medium das Überleben der Dopaminkulturen beeinträchtigt.

Die Phosphorylierung von Ser129 wird in PFF-basierten Modellen der Aggregation von Synuclein konsistent berichtet und kolokalisiert mit Markern von Fehlfaltung und Aggregation wie Thioflavin S, Ubiquitin oder konformen spezifischen Antikörpern11,12. In unseren Händen, Immunostaining für pS129-syn gibt auch das stärkste Signal mit dem niedrigsten Hintergrund und ist am einfachsten zu analysieren, so dass robuste Ergebnisse, wenn mehrere Behandlungen gescreent werden. Wichtig ist, dass die Immunfärbung mit pS129-Syn-Antikörpern keine PFFs erkennt, die außerhalb der Zellen verbleiben, was den Hintergrund signifikant reduziert. Es ist jedoch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Ser129-Phosphorylierung wahrscheinlich einer der frühesten Prozesse ist, die mit der Fehlfaltung von '-Synuclein verbunden sind und unter bestimmten Bedingungen unterschiedlich reguliert werden können. Daher sollten alle Befunde, die positive Auswirkungen auf pS129-Syn zeigen, durch andere Marker bestätigt werden.

Die statistische Analyse sollte entsprechend dem experimentellen Design erfolgen. Es ist wichtig, Experimente in mindestens drei unabhängigen biologischen Repliken durchzuführen (d. h. getrennte primäre neuronale Kulturen). Diese Repliken sollten auf verschiedenen Platten plattiert und unabhängig behandelt werden. Wir analysieren die Daten aus Replikationen auf verschiedenen Platten mit zufälligem Blockdesign ANOVA37, um die Kopplung von Daten für verschiedene experimentelle Platten zu berücksichtigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Prof. Kelvin Luk für seine großzügige Gabe von "Synuclein PFFs", Conjung Zheng für die Einrichtung und Kultivierung neuronaler Zellen und der Lichtmikroskopie-Einheit am Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki, für die Bildgebung immunobefleckter Zellen. Diese Arbeit wurde durch Stipendien von 3i-Regeneration von Business Finland (Finnische Innovationsagentur), Akademie Finnland#309489, #293392, #319195; Sigrid Juselius Stiftung und die gesetzlichen Kassen des Maj Institute of Pharmacology, PAS, Polen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,4 % Trypanblau-FärbungGibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA15250061
15 ml CELLSTAR Polypropylen-TubeGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland188261
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA10236276001
5 M HClN/AN/AMedienküche, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki
5 M NaOHN/AN/AMedienküche, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki
96-Well-ViewPlate (Schwarz)PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA6005182
99,5% Ethanol (EtOH)Altia Oyj, Rajamä ki, FinnlandN/A
AquaSil SilikonisierungsflüssigkeitThermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USATS-42799
Autoklaviertes 1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenN/AN/AMedienküche, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki
Bioruptor-BeschallungsgerätDiagenode, Lüttich, BelgienB01020001
Ca2+, Mg2+ frei Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA14175-053
CellProfiler und CellAnalyst SoftwarepaketeN/AN/Akostenlose Open-Source-Software
Centrifuge 5702Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland5702000019
CO2-InkubatorHeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USAN/A
ZählkammerBioRad Inc., Hercules, California, USA1450015
DeltaVision Ultra High Resolution Mikroskop mit Lufttisch und SchrankGE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA29254706
Deoxyribonuclease-I (Dnase I)Roche, Basel, Schweiz22098700
D-GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAG8769
DMEM/F12Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA21331– 020
Esel Anti-Maus AlexaFluor 488Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA21202
Esel Anti-Kaninchen AlexaFluor 647Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA31573
Esel Anti-Schaf AlexaFluor 488Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA11015
Dulbecco-PufferN/AN/AMedienküche, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA10500056
Fisherbrand Plain Economy PTFE Rührstäbchenfisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA11507582
ImageXpress Nano Automatisiertes BildgebungssystemMolecular Devices, San Jose, Kalifornien, USAN/A
L-GlutaminGibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA25030– 032
monoklonale Anti-Tyrosin-HydroxylaseMillipore, Merck KGaA, Darmstadt, deutschesMAB318
N2-SupplementGibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA17502– 048
Normal Horse SerumVector Laboratories Inc., Burlingame, Kalifornien, Vereinigte StaatenS-2000
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA158127
Paraformaldehydpulver, 95%Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA158127
pH-Fix, farbfixierte IndikatorstreifenMacherey-Nagel, Dü ren, Deutschland92110
Phospohat-Puffer-Kochsalzlösung (PBS)N/AN/AMedienküche, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki
Poly-L-OrnithinSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP4957
PrimocinInvivoGen, San Diego, Kalifornien, USAant-pm-1, ant-pm-2
Kaninchen monoklonales Anti-Alpha-Synuclein-FilamentAbcam, Cambridge, Vereinigtes Königreichab209538
Kaninchen monoklonales Anti-Phospho-serin129-alpha-synucleinAbcam, Cambridge, Vereinigtes Königreichab51253
RCT Basic, IKA MagnetrührerIKA®-Werke GmbH, Staufen, Deutschland3810000
rekombinanter humaner Glia-abgeleiteter neurotropher Faktor (hGDNF)PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA oder Prospec, Ness-Ziona, Israel450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
rekombinante Maus-Alpha-Synuclein Vorgeformte Fibrillen (PFFs)N/AN/AGeschenk vom Mitarbeiter, Prof. Kelvin C Luk
Research Stereomikroskop SystemOlympus Corporation, Tokio, JapanSZX10
Schaf polyklonale Anti-Tyrosin-HydroxylaseMillipore, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschab1542
TC 20 Automatisiert Cell CounterBioRad Inc., Hercules, Kalifornien, USA1450102
Triton X-100Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA11332481001
TrypsinMP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China2199700

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Alpha Synuclein Akkumulationpr formierte Fibrillenprim re Dopamin NeuronenImmunf rbungautomatisierte BildanalyseZellkulturPhospho Serin 129High Content ScreeningPoly L Ornithin BeschichtungFluoreszenzmikroskopie
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