Methodenartikel

Herstellung von Zero Mode Waveguides für die hochkonzentrierte Einzelmolekülmikroskopie

DOI:

10.3791/61154

⸱

12. Mai 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird eine Nanosphärenlithographiemethode zur parallelen Herstellung von Nullmoduswellenleitern beschrieben, bei denen es sich um Arrays von Nanoaperturen in einem metallbeschichteten Glasmikroskopie-Coverlip für die Einzelmolekülbildgebung bei nano- bis mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren handelt. Die Methode nutzt die Kolloidalkristall-Selbstorganisation, um eine Hohlleiterschablone zu erstellen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In der Einzelmolekülfluoreszenzenzymologie begrenzt die Hintergrundfluoreszenz von markierten Substraten in Lösung die Fluorophorkonzentration oft auf pico- bis nanomolare Bereiche, mehrere Größenordnungen weniger als viele physiologische Ligandenkonzentrationen. Optische Nanostrukturen, sogenannte Zero Mode Waveguides (ZMWs), bei denen es sich um Aperturen mit einem Durchmesser von 100-200 nm handelt, die in einem dünnen leitenden Metall wie Aluminium oder Gold hergestellt werden, ermöglichen die Abbildung einzelner Moleküle bei mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren, indem sie die Anregung des sichtbaren Lichts auf zeptoliterische effektive Volumina beschränken. Der Bedarf an teuren und spezialisierten Nanofabrikationsgeräten hat jedoch die weit verbreitete Verwendung von ZMWs ausgeschlossen. Typischerweise werden Nanostrukturen wie ZMWs durch direktes Schreiben mit Elektronenstrahllithographie erhalten, die sequenziell und langsam ist. Hier wird die kolloidale oder Nanosphärenlithographie als alternative Strategie verwendet, um Masken im Nanometerbereich für die Wellenleiterherstellung herzustellen. Dieser Bericht beschreibt den Ansatz ausführlich mit praktischen Überlegungen für jede Phase. Das Verfahren ermöglicht es, Tausende von Aluminium- oder Gold-ZMWs parallel mit endgültigen Wellenleiterdurchmessern und Tiefen von 100-200 nm zu machen. Es werden nur gängige Laborgeräte und ein thermischer Verdampfer für die Metallabscheidung benötigt. Indem ZMWs für die biochemische Gemeinschaft zugänglicher gemacht werden, kann diese Methode die Untersuchung molekularer Prozesse bei zellulären Konzentrationen und Raten erleichtern.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Einzelmolekültechniken wie Einzelmolekül-Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (smFRET) oder Einzelmolekül-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) sind leistungsfähige Werkzeuge für die molekulare Biophysik, die die Untersuchung dynamischer Bewegungen, Konformationen und Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle in Prozessen wie Transkription1,2,3, Translation4,5,6und vielen anderen ermöglichen7. Für smFRET ist die TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) eine gängige Methode, da viele angebundene Moleküle im Laufe der Zeit verfolgt werden können und die von TIR erzeugte evaneszente Welle auf einen 100-200-nm-Bereich neben dem Coverslip8beschränkt ist. Trotz dieser Beschränkung des Anregungsvolumens müssen jedoch noch interessante Fluorophore in pM- oder nM-Bereiche verdünnt werden, um Einzelmolekülsignale oberhalb der Hintergrundfluoreszenz9zu detektieren. Da die Michaelis-Menten-Konstanten zellulärer Enzyme typischerweise im Bereich von μM bis mM10 liegen,sind biochemische Reaktionen in Einzelmolekülstudien in der Regel viel langsamer als die in der Zelle. Zum Beispiel findet die Proteinsynthese bei 15-20 Aminosäuren pro Sekunde in E. coli11,12statt, während die meisten prokaryotischen Ribosomen in smFRET-Experimenten bei 0,1-1 Aminosäure pro Sekunde13übersetzen. In der Proteinsynthese zeigten Kristallstrukturen und smFRET an festgefahrenen Ribosomen, dass Transfer-RNAs (tRNAs) vor der tRNA-mRNA-Translokation Schritt14,15zwischen "hybriden" und "klassischen" Zuständen schwanken. Wenn jedoch physiologische Konzentrationen des Translokations-GTPase-Faktors EF-G vorhanden waren, wurde in smFRET 6 eine andere Konformation beobachtet, die zwischen dem hybriden und dem klassischen Zustandliegt. Die Untersuchung dynamischer molekularer Prozesse mit ähnlichen Geschwindigkeiten und Konzentrationen wie in der Zelle ist wichtig, bleibt aber eine technische Herausforderung.

Eine Strategie zur Erhöhung der fluoreszierenden Substratkonzentration ist die Verwendung metallbasierter, subsichtbarer Wellenlängenöffnungen, sogenannte Zero Mode Waveguides (ZMWs), um begrenzte Anregungsfelder zu erzeugen, die selektiv Biomoleküle anregen, die innerhalb der Aperturen lokalisiert sind16 (Abbildung 1). Die Öffnungen sind typischerweise 100−200 nm im Durchmesser und 100−150 nm in der Tiefe17. Oberhalb einer Cutoff-Wellenlänge bezogen auf die Größe und Form der Brunnen (λc ≈ 2,3-facher Durchmesser für kreisförmige Wellenleiter mit Wasser als dielektrischem Medium18)sind im Wellenleiter keine Ausbreitungsmoden erlaubt, daher der Begriff Nullmodus-Wellenleiter. Ein oszillierendes elektromagnetisches Feld, eine evaneszente Welle, exponentiell zerfallende Intensität, tunnelt jedoch immer noch eine kurze Strecke in den Wellenleiter18,19. Obwohl sie den evaneszenten TIR-Wellen ähneln, haben ZMW-evaneszente Wellen eine kürzere Zerfallskonstante, was zu einem effektiven Anregungsbereich von 10-30 nm innerhalb des Wellenleiters führt. Bei mikromolaren Konzentrationen fluoreszierend markierter Liganden sind nur ein oder wenige Moleküle gleichzeitig im Anregungsgebiet vorhanden. Diese Einschränkung des Anregungsvolumens und die daraus resultierende Reduktion der Hintergrundfluoreszenz ermöglicht die Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in biologisch relevanten Konzentrationen. Dies wurde auf viele Systeme20angewendet, einschließlich FCS-Messungen der Einzelproteindiffusion21,Einzelmolekül-FRET-Messungen von niedrigaffinen Liganden-Protein-22 und Protein-Protein-Interaktionen23und spektro-elektrochemische Messungen von einzelnen molekularen Umsatzereignissen24.

ZMWs wurden durch direktes Strukturieren einer Metallschicht mit Ionenstrahlfräsen25,26 oder Elektronenstrahllithographie (EBL)hergestellt,gefolgt von Plasmaätzen16,27. Diese maskenlosen Lithographiemethoden erzeugen Wellenleiter in Serie und erfordern in der Regel Zugang zu spezialisierten Nanofabrikationsanlagen, was eine weit verbreitete Einführung der ZMW-Technologie verhindert. Eine andere Methode, ultraviolette Nanoimprint-Lithographie-Lift-off28,verwendet eine Quarz-Diaform, um eine inverse ZMW-Schablone wie einen Stempel auf einen Widerstandsfilm zu drücken. Während diese Methode stromlinienförmiger ist, benötigt sie immer noch EBL für die Herstellung der Quarzform. Dieser Artikel stellt das Protokoll für eine einfache und kostengünstige vorgefertigte Herstellungsmethode vor, die kein EBL- oder Ionenstrahlfräsen erfordert und auf der engen Verpackung von Nanosphären basiert, um eine lithographische Maske zu bilden.

Die Nanosphären- oder "natürliche" Lithographie, die erstmals 1982 von Deckman und Dunsmuir29,30vorgeschlagen wurde, verwendet die Selbstorganisation monodisperser kolloidaler Partikel, die von Dutzenden von Nanometern bis zu Dutzenden von Mikrometern31reichen, um Vorlagen für die Oberflächenstrukturierung durch Ätzen und / oder Abscheiden von Materialien zu erstellen. Die zweidimensionalen (2D) oder dreidimensionalen (3D) erweiterten periodischen Anordnungen kolloidaler Partikel, die als kolloidale Kristalle bezeichnet werden, zeichnen sich durch eine helle Iriseszenz aus Streuung und Beugungaus 32aus. Obwohl diese Maskierungsmethode weniger weit verbreitet ist als Elektronenstrahl- oder Photolithographie, ist sie einfach, kostengünstig und leicht zu verkleinern, um Feature-Größen unter 100 nm zu erzeugen.

Die Selbstorganisation kolloidaler Partikel bestimmt den Erfolg der Verwendung kolloidaler Kristalle als Masken für die Oberflächenstrukturierung. Wenn die Größe und Form der Partikel homogen sind, können kolloidale Partikel leicht mit hexagonaler Packung selbst zusammengesetzt werden, angetrieben durch entropische Erschöpfung33. Die Wasserverdampfung nach der Tropfenbeschichtung ist ein effektiver Weg, um die kolloidalen Partikel zu sedimentieren, obwohl andere Methoden Tauchbeschichtung34, Spinbeschichtung35, elektrophoretische Abscheidung36und Konsolidierung an einer Luft-Wasser-Grenzfläche37umfassen. Das unten vorgestellte Protokoll basiert auf der Verdunstungssedimentationsmethode, die am einfachsten zu implementieren war. Die dreieckigen Zwischenstellen zwischen dicht gepackten Polystyrolperlen bilden Öffnungen, in denen ein Opfermetall plattiert wird, wodurch Pfosten entstehen (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 1). Kurzes Glühen der Perlen vor diesem Schritt passt die Form und den Durchmesser dieser Pfosten an. Die Perlen werden entfernt, eine letzte Metallschicht wird um die Pfosten herum abgelagert und dann werden die Pfosten entfernt. Nach den beiden Metallabscheidungsschritten auf die kolloidale Nanomaske, der Entfernung der Zwischenpfosten und der oberflächenchemischen Modifikation zur Passivierung und Anbindeung sind die ZMW-Arrays für die Einzelmolekülbildgebung einsatzbereit. Eine weitergehende Charakterisierung der optischen Eigenschaften des ZMW nach der Herstellung findet sich in einem begleitenden Artikel38. Neben einem thermischen Verdampfer zur Dampfabscheidung der Metalle sind keine Spezialwerkzeuge erforderlich.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Alle Schritte können im allgemeinen Laborbereich ausgeführt werden.

1. Reinigung von Glasabdeckungen

  1. Um eine saubere Oberfläche für die Verdunstungsablagerung kolloidaler Partikel zu schaffen, legen Sie 24 x 30 mm optische Borosilikatglasabdeckungen (0,16−0,19 mm Dicke) zur Reinigung in die gerillten Einsätze eines Coplinglas-Glasfärbeglases.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Abdecklippen aufrecht stehen und gut getrennt sind, damit alle Oberflächen während des Reinigungsvorgangs deutlich freigelegt werden.
  2. Gießen Sie genug Aceton in das Färbeglas, um die Decklippen zu bedecken, legen Sie die Abdeckung auf und beschallen Sie sie für 10 min bei 40 ° C.
  3. Gießen Sie das Aceton aus und spülen Sie die Abdecklippen aus, indem Sie das Färbeglas mit destilliertem H2O füllen und das Wasser ausgießen. Wiederholen Sie 2 weitere Male.
  4. Wiederholen Sie die Aceton-Beschallung (Schritte 1.2 und 1.3) noch einmal.
  5. Gießen Sie genug 200 mM KOH in das Glas, um die Deckrutsche abzudecken und beschallen Sie abgedeckt, für 20 min bei 40 ° C.
    HINWEIS: Der KOH ätscht das Glas leicht.
  6. Spülen Sie die Abdecklippen mit destilliertemH2O6 mal aus.
  7. Ethanol hinzufügen, um die Deckslippen abzudecken, den Deckel hinzufügen und 10 Minuten bei 40 °C beschallen.
  8. Spülen Sie die Abdecklippen mit destilliertemH2O3 mal aus.
  9. Nehmen Sie jeden Abdeckr am Rand mit einer sanften Zette auf und trocknen Sie die Abdeckrlips mit N2-Gas. Berühren Sie nur die Kanten des Abdeckungsrutsches. Legen Sie jeden der getrockneten, gereinigten Abdecklippen in eine einzelne saubere Petrischale.

2. Verdunstungsablagerung von Polystyrolperlen

  1. Um die kolloidale Kristallmaske für das ZMW-Array zu erstellen, zentrifugieren Sie 50 μL mit 1 μm Durchmesser, nicht funktionalisierte Polystyrolperlen (2,5% w/v in Wasser) bei 15.000 x g,25 °C für 5 min.
    HINWEIS: Vor dem Pipettieren der Perlen sollte die Stammlösung kurz vorgetext werden, falls sich die Perlen auf dem Boden der Flasche abgesetzt haben.
  2. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie so wenig Wasser wie möglich übrig.
    HINWEIS: Restwasser kann die Verdunstungseigenschaften der Ethanol-Resuspension39verändern, so dass das Entfernen einer kleinen Menge Perlen, um das gesamte Wasser zu entfernen, akzeptabel ist.
  3. Die Perlen aus Schritt 2.2 werden in 50 μL 1:400 TritonX-100:Ethanol Lösungsmittel resuspendiert. Mehrmals auf und ab pipetten, um die Perlen gründlich mit dem Lösungsmittel zu mischen.
    HINWEIS: TritonX-100: Ethanol-Lösungsmittel sollte nach Gebrauch mit Paraffinfolie versiegelt und einmal im Monat frisch zubereitet werden. Die Perlen neigen dazu, an den Seiten eines Kunststoffgefäßes zu haften, z. B. an einem Mikrozentrifugenröhrchen, also pipetten Sie entlang der Seiten, um sicherzustellen, dass alle Perlen wieder aufgewendet werden.
  4. Um eine Feuchtigkeitskammer für die Ablagerung einzurichten, legen Sie 6 Petrischalen mit jeweils einem Deckslip auf eine Bank in einer Linie mit leicht offenen Deckeln. Bewegen Sie in jeder Schüssel den Abdeckungsrutsch in den offenen Bereich, so dass die Abdeckungsrutsche der Umgebung ausgesetzt sind, wenn die Luftfeuchtigkeit im nächsten Schritt erhöht wird.
  5. Platzieren Sie ein Hygrometer und einen kleinen elektrischen Ventilator zentriert hinter den Petrischalen.
  6. Zeichnen Sie die beginnende relative Luftfeuchtigkeit (RH) im Labor auf. Füllen Sie ein 200 ml Becherglas mit 150−200 ml ~75 °C Wasser und legen Sie es hinter den Ventilator.
  7. Schalten Sie den Ventilator ein und bedecken Sie Petrischalen, Ventilator, Becher und Hygrometer mit einem umgekippten, transparenten Kunststoffbehälter (66 cm x 46 cm x 38 cm).
  8. Lassen Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer auf 70-75% ansteigen, was normalerweise 5-10 Minuten dauert.
    HINWEIS: Wenn der rh im Umgebungslabor niedrig ist (unter ~ 50%), lassen Sie die Kammer einen höheren RH erreichen, aber nicht höher als 80%, um den Feuchtigkeitsverlust während der Ablagerung auszugleichen (siehe unten).
  9. Wenn der relative Stand 70-75% erreicht, zeichnen Sie die relative Luftfeuchtigkeit auf und heben Sie den Kunststoffbehälter leicht an, um schnell Abdeckungen auf die Petrischalen zu legen, wodurch eine Überbenetzung der Abdecklippen verhindert wird.
    HINWEIS: Die Temperatur in der Kammer ist aufgrund der Befeuchtung etwas wärmer als die Raumtemperatur, typischerweise 25-26 ° C. Wenn Feuchtigkeit auf den Abdecklippen sichtbar ist, sind die Glasoberflächen zu nass. Ein kommerzielles Handschuhfach kann diesen Teil des Protokolls vereinfachen.
  10. Lassen Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer weiterhin auf 85% steigen. Zeichnen Sie an diesem Punkt die relative Luftfeuchtigkeit in der Feuchtigkeitskammer auf und pipetetten Sie 5 μL der Perlensuspension auf die Mitte jedes Abdecks.
  11. Schließen Sie die Kammer und die Petrischalen nach jeder Ablagerung, um den Feuchtigkeitsverlust zu minimieren. Ziel ist es, alle 6 Ablagerungen innerhalb von 2 Minuten zu beenden.
  12. Notieren Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer nach der Ablagerung.
    HINWEIS: Die relative Luftfeuchtigkeit nach der Abscheidung hilft zu messen, wie schnell feuchtigkeit während der Ablagerung verloren ging, was von den Umgebungsbedingungen im Labor abhängt. Für einen typischen erfolgreichen Lauf beginnt die Kammer vor der Ablagerung bei 85% RH und endet nach der Ablagerung bei 70-75% RH.
  13. Die Perlentröpfchen verteilen lassen und 5 min trocknen lassen.
    HINWEIS: Wenn die kolloidalen Kristalle viele Löcher oder mehrschichtige Regionen haben, war die Kammer wahrscheinlich zu feucht bzw. trocken. Stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit ein, bei der die Petrischalen geschlossen und die Ablagerungen begonnen werden sollen (siehe Abschnitt Ergebnisse für weitere Diskussionen zur Optimierung).

3. Perlenglühen zur Reduzierung der Porengröße in der kolloidalen Kristallschablone

  1. Um eine gleichmäßige Temperaturoberfläche für das Glühen der Polystyrolperlen zu schaffen, die die Zwischenkugel-Zwischenpunkte verengt und die Ecken der Zwischenabstande rundet, legen Sie eine flache, gefräste Aluminiumplatte auf eine Standard-Keramik-Heizplatte.
  2. Stellen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 107 °C ein, die Glasübergangstemperatur von Polystyrol40.
    HINWEIS: Um eine stabile und genaue Temperatur zu erhalten, wurde eine Thermoelementsonde in einem 2-3 mm breiten und 4-5 mm tiefen Loch in der Aluminiumplatte gehalten.
  3. Legen Sie einen Abdeckrlip mit der Perlenschablone auf die heiße Aluminiumplatte und glühen Sie für 20 s (siehe Diskussionsabschnitt für die Erklärung der Schmelzzeit).
  4. Entfernen Sie nach dem Erhitzen den Deckdeckel von der Aluminiumplatte und legen Sie ihn sofort auf eine andere Aluminiumoberfläche mit Raumtemperatur, um sie zu kühlen.
    HINWEIS: Es ist hilfreich, entweder die Abdecklippen leicht über den Rand der Platte hängen zu lassen oder flache Kanäle (siehe begleitendes Video) in die Platte zu fräsen, um die Aufnahme der Abdecklippen zu erleichtern.

4. Nanofabrikation von Aluminium-Zero-Mode-Wellenleitern mit der kolloidalen Kristallschablone

  1. Mit thermischer oder Elektronenstrahl-Verdunstungsabscheidung lagern Sie 300 nm Kupfer bei 2 Å/s über die kolloidale Kristallschablone ab, um Pfosten in den Zwischenablagen zwischen den Perlen zu erzeugen.
  2. Entfernen Sie überschüssiges Metall auf den Perlen, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit Klebeband drücken. Ziehen Sie das Klebeband langsam ab, um das Metall abzuziehen.
    HINWEIS: Einige kleine Flecken von reflektierendem überschüssigem Metall können nach dem Bandzug verbleiben, und diese können oft durch einen Strom vonN2-Gas entfernt werden. Wenn nach dem Bandzug erhebliche Flecken von reflektierendem überschüssigem Metall verbleiben, versuchen Sie, die Schablonen 2 Stunden lang in Toluol einzuweichen, um die Polystyrolperlen teilweise aufzulösen. Waschen Sie die Abdecklappen mit destilliertem Wasser, trocknen Sie sie mitN 2und wiederholen Sie den Bandzug. Das zusätzliche Einweichen sollte die Perlen nicht vollständig auflösen, da die Perlen dazu beitragen, die Pfosten vor Beschädigungen während des Bandzugs zu schützen.
  3. Um die Polystyrolperlen aufzulösen, legen Sie die Perlenschablonen in Toluol und weichen Sie sie über Nacht ein.
    ACHTUNG: Toluoldämpfe können giftig sein. Arbeiten Sie mit Toluol unter einer gut belüfteten Kapuze und tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und laborbeschichtet. Toluol sollte in belüfteten Schränken gelagert werden, die für brennbare Flüssigkeiten bestimmt sind.
  4. Nach der Toluol-Inkubation spülen Sie die Schablonen einmal mit Chloroform und zweimal mit Ethanol ab. Behandeln Sie an dieser Stelle vorsichtig die Abdeckungen, da die empfindlichen 200-300 nm hohen Metallpfosten jetzt freigelegt sind. Trocknen Sie die Schablonen mitN 2 und entfernen Sie Restpolymere und Verunreinigungen in einem Sauerstoffplasmareiniger für 30 min.
    ACHTUNG: Chloroforme Dämpfe können giftig sein. Arbeiten Sie mit Chloroform unter einer gut belüfteten Kapuze und tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel. Chloroform sollte in belüfteten Schränken fern von anderen brennbaren Lösungsmitteln gelagert werden.
  5. Mit thermischer oder Elektronenstrahl-Verdunstungsabscheidung 3 nm einer Titanadhäsionsschicht bei 1 Å/s abscheiden, gefolgt von 100−150 nm Aluminium bei 4 Å/s um und auf den Kupferpfosten.
    HINWEIS: Man kann eine dickere Verkleidung verwenden, um tiefere Führungen und eine bessere Dämpfung der Hintergrundfluoreszenz zu erhalten, aber dies verringert auch die Ausbeute nach dem Freilegen und Auflösen der Pfosten im nächsten Schritt (siehe Diskussionsabschnitt).
  6. Um die Metallpfosten aufzulösen, weichen Sie die Abdecklippen in Kupferätzmittel (Zitronensäure-basiert; Materialtabelle) für 2 h.
    ACHTUNG: Metallätzen kann Hautverbrennungen verursachen. Arbeiten Sie mit Ätzmitteln unter einer gut belüfteten Motorhaube und tragen Sie Schutzausrüstung. Waschen Sie die Hände nach der Handhabung gründlich. Metallätzmittel sollten in belüfteten Schränken gelagert werden, die für korrosive Flüssigkeiten bestimmt sind.
  7. Spülen Sie die Deckzettel mit destilliertem Wasser ab, trocknen Sie sie mit N2und polieren Sie die Oberfläche der Metallverkleidung vorsichtig mit Linsenpapier ab, um alle Pfosten freizulegen, die noch mit der Verkleidung bedeckt sind. Die Abdecks für weitere 2 h wieder in Kupferätzung geben, dann erneut mit destilliertem Wasser abspülen und mitN2 trocknen.
    HINWEIS: ZMW-Objektträger sollten in abgedeckten, sauberen Petrischalen aufbewahrt werden, um sie frei von Verunreinigungen zu halten.

5. Nanofabrikation von Gold-Nullmodus-Wellenleitern mit der kolloidalen Kristallschablone

HINWEIS: Die Methode zur Herstellung von Gold-ZMWs (Ergänzende Abbildung 1), die das Protokoll zur Herstellung von Aluminium-ZMWs widerspiegelt, wird in diesem Abschnitt bereitgestellt.

  1. Mit thermischer oder Elektronenstrahlverdunstungsabscheidung 3 nm einer Titanadhäsionsschicht bei 1 Å/s abscheiden, gefolgt von 300 nm Aluminium bei 4 Å/s.
  2. Entfernen Sie überschüssiges Metall auf den Perlen, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit Klebeband drücken. Ziehen Sie das Klebeband langsam ab, um das Metall abzuziehen.
  3. Um die Polystyrolperlen aufzulösen, legen Sie die Perlenschablonen in Toluol und weichen Sie sie über Nacht ein.
  4. Nach der Toluol-Inkubation spülen Sie die Schablonen einmal mit Chloroform und zweimal mit Ethanol ab. Trocknen Sie die Schablonen mitN 2 und entfernen Sie reste Polymerverunreinigungen in einem Sauerstoffplasmareiniger für 30 min.
  5. Mit thermischer oder Elektronenstrahlverdunstungsabscheidung lagern Sie 100-150 nm Gold bei 5 Å / s um und auf den Aluminiumpfosten ab.
  6. Um die Metallpfosten aufzulösen, weichen Sie die Abdeckel in Aluminiumätzmittel (auf Phosphorsäurebasis; Materialtabelle) für 1 h.
  7. Spülen Sie die Deckzettel mit destilliertem Wasser ab, trocknen Sie sie mit N2und polieren Sie die Oberfläche der Metallverkleidung vorsichtig mit Linsenpapier ab, um alle Pfosten freizulegen, die noch mit der Verkleidung bedeckt sind. Legen Sie die Abdeckel für 1 h wieder in Aluminiumätzen, dann erneut mit destilliertem Wasser abspülen und mitN2 trocknen.
    HINWEIS: ZMW-Dias sollten in abgedeckten, sauberen Petrischalen aufbewahrt werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Selbstorganisation der kolloidalen Polystyrolpartikel durch Verdunstungssedimentation (Schritte 2.1−2.13) kann zu einer Reihe von Ergebnissen führen, da sie eine Kontrolle der Lösungsmittelverdampfungsrate erfordert. Da die Ablagerungen jedoch schnell sind (10-15 min pro Runde), kann das Verfahren schnell für unterschiedliche Umgebungsbedingungen im Labor optimiert werden. Abbildung 3A zeigt eine wohlgeformte kolloidale Schablone nach Ablagerung und Verdampfung. Makroskopisch ist der Ber...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für die kolloidale Selbstorganisation (Protokollabschnitt 2) beschleunigt die Verwendung von Ethanol anstelle von Wasser als Suspensionslösungsmittel den Verdampfungsprozess, so dass die Schablonen in 2−3 min nach der Abscheidung fertig sind und nicht wie bei den vorherigen Methoden48,49 in 1−2h. Das hier vorgestellte Verdunstungssedimentationsprotokoll ist auch einfacher als frühere Sedimentationsprotokolle, die die Kontrolle von Oberflächenneigung, Temperatur u...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch nihfinanzierte R01GM080376, R35GM118139 und NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 an Y.E.G. und durch ein NIAID-Prädoktoranden-NRSA-Stipendium F30AI114187 an R.M.J.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1. Glasdeckglas Reinigung
AcetonSigma322011 L
Coplin GlasfärbeglasFisher Scientific08-817Färbeglas mit 8 Rillen und geformtem Glasdeckel
DeckgläserVWR48404-46724 mm x 30 mm (Nr.1½, rechteckig)
EthanolSigmaE70231 L
KOHSigma30603Kaliumhydroxid
PetrischalenFisherScientific R80115TS100 mm Durchmesser, 15 mm tief
SonicatorBransonZ245143Tisch-Ultraschallreiniger, 5510
2. Verdunstungsabscheidung von Polystyrolperlen
durchsichtig VorratsbehälterFisher Scientific50-110-822226 x 18 x 15 Zoll
TischventilatorO2CoolFD05001AJeder kleine Tischventilator (~5 Zoll) funktioniert
GlasbecherFisher Scientific02-555-25B250 mL
FeuchtigkeitsmesserFisher Scientific11-661-19
MikrozentrifugenröhrchenFisher Scientific21-402-9031,5 mL
Mikrokugeln aus PolystyrolPolysciences18602-151,00 & Mikro; m Durchmesser, nicht funktionalisiert
Triton X-100 deturgentSigmaX100100 mL
3. Perlenglühen zur Reduzierung der Porengröße in der kolloidalen Kristallschablone
AluminiumplatteFisher ScientificAA11062RYKundenspezifisch im eigenen Haus auf 14 cm x 14 cm
KeramikkochplatteFisher ScientificHP8885710013 x 8,2 x 3,8 Zoll.
TemperaturreglerMcMaster-Carr38615K71Temperatur ablesen mit Thermoelementfühler
ThermoelementfühlerMcMaster-Carr9251T93Typ K, Oberflächenfühler
4/5. Nanofabrikation von Nulltakt-Wellenleitern unter Verwendung des kolloidalen Kristall-Templates
Aluminium-ÄtzmittelTyp A
AluminiumpelletsKurt J. LeskerEVMAL40QXHBFür die Elektronenstrahlverdampfung
ChloroformSigma2883061 L
Kupfer-Ätzmittel49-1
KupferpelletsKurt J. LeskerEVMCU40QXQAFür die Elektronenstrahlverdampfung
GoldpelletsKurt J. LeskerEVMAUXX40GFür die Elektronenstrahlverdampfung
LinsenpapierThorlabsMC-5
PlasmareinigerHarrick PlasmaPDC-32G
KlebebandHeftklammernMMM119
DünnschichtabscheidungssystemKurt J. LeskerPVD-75Thermisches Verdampfungssystem für den Tisch funktioniert auch
TitanpelletsKurt J. LeskerEVMTI45QXQAFür die Elektronenstrahlverdampfung
ToluolSigma2445111 L
Representative results
COMSOL Multiphysics Modeling SoftwareCOMSOL, Inc.
Dual-View-SpektralsplitterPhotometrics, Inc.

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001(2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797(2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401(2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301(2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06(2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011(2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229(2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888(2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964(2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800(2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418(2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 8/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Colloidal crystal patterns, optical micrographs, grain structure, diffraction patterns, scale bars.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Colloidal crystal diffraction patterns and SEM images; microscopy analysis of photonic structures.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Schlagwörter

Nanosphere LithographyColloidal LithographyThermal Evaporative DepositionAluminum WaveguidesCopper PostsAtomic Force MicroscopySingle Molecule FRETHumidity Chamber

Verwandte Artikel