Bioengineering

Herstellung von Zero Mode Waveguides für die hochkonzentrierte Einzelmolekülmikroskopie

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154

Kevin Y. Chen¹, Ryan M. Jamiolkowski¹, Alyssa M. Tate¹, Shane A. Fiorenza², Shawn H. Pfeil², Yale E. Goldman¹

¹Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ²Department of Physics, West Chester University

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Summary

Hier wird eine Nanosphärenlithographiemethode zur parallelen Herstellung von Nullmoduswellenleitern beschrieben, bei denen es sich um Arrays von Nanoaperturen in einem metallbeschichteten Glasmikroskopie-Coverlip für die Einzelmolekülbildgebung bei nano- bis mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren handelt. Die Methode nutzt die Kolloidalkristall-Selbstorganisation, um eine Hohlleiterschablone zu erstellen.

Abstract

In der Einzelmolekülfluoreszenzenzymologie begrenzt die Hintergrundfluoreszenz von markierten Substraten in Lösung die Fluorophorkonzentration oft auf pico- bis nanomolare Bereiche, mehrere Größenordnungen weniger als viele physiologische Ligandenkonzentrationen. Optische Nanostrukturen, sogenannte Zero Mode Waveguides (ZMWs), bei denen es sich um Aperturen mit einem Durchmesser von 100-200 nm handelt, die in einem dünnen leitenden Metall wie Aluminium oder Gold hergestellt werden, ermöglichen die Abbildung einzelner Moleküle bei mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren, indem sie die Anregung des sichtbaren Lichts auf zeptoliterische effektive Volumina beschränken. Der Bedarf an teuren und spezialisierten Nanofabrikationsgeräten hat jedoch die weit verbreitete Verwendung von ZMWs ausgeschlossen. Typischerweise werden Nanostrukturen wie ZMWs durch direktes Schreiben mit Elektronenstrahllithographie erhalten, die sequenziell und langsam ist. Hier wird die kolloidale oder Nanosphärenlithographie als alternative Strategie verwendet, um Masken im Nanometerbereich für die Wellenleiterherstellung herzustellen. Dieser Bericht beschreibt den Ansatz ausführlich mit praktischen Überlegungen für jede Phase. Das Verfahren ermöglicht es, Tausende von Aluminium- oder Gold-ZMWs parallel mit endgültigen Wellenleiterdurchmessern und Tiefen von 100-200 nm zu machen. Es werden nur gängige Laborgeräte und ein thermischer Verdampfer für die Metallabscheidung benötigt. Indem ZMWs für die biochemische Gemeinschaft zugänglicher gemacht werden, kann diese Methode die Untersuchung molekularer Prozesse bei zellulären Konzentrationen und Raten erleichtern.

Introduction

Einzelmolekültechniken wie Einzelmolekül-Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (smFRET) oder Einzelmolekül-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) sind leistungsfähige Werkzeuge für die molekulare Biophysik, die die Untersuchung dynamischer Bewegungen, Konformationen und Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle in Prozessen wie Transkription¹^,²^,³, Translation⁴^,⁵^,⁶und vielen anderen ermöglichen⁷. Für smFRET ist die TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) eine gängige Methode, da viele angebundene Moleküle im Laufe der Zeit verfolgt werden können und die von TIR erzeugte evaneszente Welle auf einen 100-200-nm-Bereich neben dem Coverslip⁸beschränkt ist. Trotz dieser Beschränkung des Anregungsvolumens müssen jedoch noch interessante Fluorophore in pM- oder nM-Bereiche verdünnt werden, um Einzelmolekülsignale oberhalb der Hintergrundfluoreszenz⁹zu detektieren. Da die Michaelis-Menten-Konstanten zellulärer Enzyme typischerweise im Bereich von μM bis mM^{10 liegen,}sind biochemische Reaktionen in Einzelmolekülstudien in der Regel viel langsamer als die in der Zelle. Zum Beispiel findet die Proteinsynthese bei 15-20 Aminosäuren pro Sekunde in E. coli¹¹^,¹²statt, während die meisten prokaryotischen Ribosomen in smFRET-Experimenten bei 0,1-1 Aminosäure pro Sekunde¹³übersetzen. In der Proteinsynthese zeigten Kristallstrukturen und smFRET an festgefahrenen Ribosomen, dass Transfer-RNAs (tRNAs) vor der tRNA-mRNA-Translokation Schritt¹⁴^,¹⁵zwischen "hybriden" und "klassischen" Zuständen schwanken. Wenn jedoch physiologische Konzentrationen des Translokations-GTPase-Faktors EF-G vorhanden waren, wurde in smFRET 6 eine andere Konformation beobachtet, die zwischen dem hybriden und dem klassischen Zustand^liegt. Die Untersuchung dynamischer molekularer Prozesse mit ähnlichen Geschwindigkeiten und Konzentrationen wie in der Zelle ist wichtig, bleibt aber eine technische Herausforderung.

Eine Strategie zur Erhöhung der fluoreszierenden Substratkonzentration ist die Verwendung metallbasierter, subsichtbarer Wellenlängenöffnungen, sogenannte Zero Mode Waveguides (ZMWs), um begrenzte Anregungsfelder zu erzeugen, die selektiv Biomoleküle anregen, die innerhalb der Aperturen lokalisiert sind¹⁶ (Abbildung 1). Die Öffnungen sind typischerweise 100−200 nm im Durchmesser und 100−150 nm in der Tiefe¹⁷. Oberhalb einer Cutoff-Wellenlänge bezogen auf die Größe und Form der Brunnen (λ_c ≈ 2,3-facher Durchmesser für kreisförmige Wellenleiter mit Wasser als dielektrischem Medium¹⁸⁾sind im Wellenleiter keine Ausbreitungsmoden erlaubt, daher der Begriff Nullmodus-Wellenleiter. Ein oszillierendes elektromagnetisches Feld, eine evaneszente Welle, exponentiell zerfallende Intensität, tunnelt jedoch immer noch eine kurze Strecke in den Wellenleiter¹⁸^,¹⁹. Obwohl sie den evaneszenten TIR-Wellen ähneln, haben ZMW-evaneszente Wellen eine kürzere Zerfallskonstante, was zu einem effektiven Anregungsbereich von 10-30 nm innerhalb des Wellenleiters führt. Bei mikromolaren Konzentrationen fluoreszierend markierter Liganden sind nur ein oder wenige Moleküle gleichzeitig im Anregungsgebiet vorhanden. Diese Einschränkung des Anregungsvolumens und die daraus resultierende Reduktion der Hintergrundfluoreszenz ermöglicht die Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in biologisch relevanten Konzentrationen. Dies wurde auf viele Systeme²⁰angewendet, einschließlich FCS-Messungen der Einzelproteindiffusion^21,Einzelmolekül-FRET-Messungen von niedrigaffinen Liganden-Protein-22 und Protein-Protein-Interaktionen²³und spektro-elektrochemische Messungen von einzelnen molekularen Umsatzereignissen²⁴.

ZMWs wurden durch direktes Strukturieren einer Metallschicht mit Ionenstrahlfräsen²⁵^,²⁶ oder Elektronenstrahllithographie (EBL)^hergestellt,gefolgt von Plasmaätzen¹⁶,²⁷. Diese maskenlosen Lithographiemethoden erzeugen Wellenleiter in Serie und erfordern in der Regel Zugang zu spezialisierten Nanofabrikationsanlagen, was eine weit verbreitete Einführung der ZMW-Technologie verhindert. Eine andere Methode, ultraviolette Nanoimprint-Lithographie-Lift-off^28,verwendet eine Quarz-Diaform, um eine inverse ZMW-Schablone wie einen Stempel auf einen Widerstandsfilm zu drücken. Während diese Methode stromlinienförmiger ist, benötigt sie immer noch EBL für die Herstellung der Quarzform. Dieser Artikel stellt das Protokoll für eine einfache und kostengünstige vorgefertigte Herstellungsmethode vor, die kein EBL- oder Ionenstrahlfräsen erfordert und auf der engen Verpackung von Nanosphären basiert, um eine lithographische Maske zu bilden.

Die Nanosphären- oder "natürliche" Lithographie, die erstmals 1982 von Deckman und Dunsmuir²⁹^,³⁰vorgeschlagen wurde, verwendet die Selbstorganisation monodisperser kolloidaler Partikel, die von Dutzenden von Nanometern bis zu Dutzenden von Mikrometern³¹reichen, um Vorlagen für die Oberflächenstrukturierung durch Ätzen und / oder Abscheiden von Materialien zu erstellen. Die zweidimensionalen (2D) oder dreidimensionalen (3D) erweiterten periodischen Anordnungen kolloidaler Partikel, die als kolloidale Kristalle bezeichnet werden, zeichnen sich durch eine helle Iriseszenz aus Streuung und Beugung^{aus 32}aus. Obwohl diese Maskierungsmethode weniger weit verbreitet ist als Elektronenstrahl- oder Photolithographie, ist sie einfach, kostengünstig und leicht zu verkleinern, um Feature-Größen unter 100 nm zu erzeugen.

Die Selbstorganisation kolloidaler Partikel bestimmt den Erfolg der Verwendung kolloidaler Kristalle als Masken für die Oberflächenstrukturierung. Wenn die Größe und Form der Partikel homogen sind, können kolloidale Partikel leicht mit hexagonaler Packung selbst zusammengesetzt werden, angetrieben durch entropische Erschöpfung³³. Die Wasserverdampfung nach der Tropfenbeschichtung ist ein effektiver Weg, um die kolloidalen Partikel zu sedimentieren, obwohl andere Methoden Tauchbeschichtung³⁴, Spinbeschichtung³⁵, elektrophoretische Abscheidung³⁶und Konsolidierung an einer Luft-Wasser-Grenzfläche³⁷umfassen. Das unten vorgestellte Protokoll basiert auf der Verdunstungssedimentationsmethode, die am einfachsten zu implementieren war. Die dreieckigen Zwischenstellen zwischen dicht gepackten Polystyrolperlen bilden Öffnungen, in denen ein Opfermetall plattiert wird, wodurch Pfosten entstehen (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 1). Kurzes Glühen der Perlen vor diesem Schritt passt die Form und den Durchmesser dieser Pfosten an. Die Perlen werden entfernt, eine letzte Metallschicht wird um die Pfosten herum abgelagert und dann werden die Pfosten entfernt. Nach den beiden Metallabscheidungsschritten auf die kolloidale Nanomaske, der Entfernung der Zwischenpfosten und der oberflächenchemischen Modifikation zur Passivierung und Anbindeung sind die ZMW-Arrays für die Einzelmolekülbildgebung einsatzbereit. Eine weitergehende Charakterisierung der optischen Eigenschaften des ZMW nach der Herstellung findet sich in einem begleitenden Artikel³⁸. Neben einem thermischen Verdampfer zur Dampfabscheidung der Metalle sind keine Spezialwerkzeuge erforderlich.

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Protocol

HINWEIS: Alle Schritte können im allgemeinen Laborbereich ausgeführt werden.

1. Reinigung von Glasabdeckungen

Um eine saubere Oberfläche für die Verdunstungsablagerung kolloidaler Partikel zu schaffen, legen Sie 24 x 30 mm optische Borosilikatglasabdeckungen (0,16−0,19 mm Dicke) zur Reinigung in die gerillten Einsätze eines Coplinglas-Glasfärbeglases.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Abdecklippen aufrecht stehen und gut getrennt sind, damit alle Oberflächen während des Reinigungsvorgangs deutlich freigelegt werden.
Gießen Sie genug Aceton in das Färbeglas, um die Decklippen zu bedecken, legen Sie die Abdeckung auf und beschallen Sie sie für 10 min bei 40 ° C.
Gießen Sie das Aceton aus und spülen Sie die Abdecklippen aus, indem Sie das Färbeglas mit destilliertem H₂O füllen und das Wasser ausgießen. Wiederholen Sie 2 weitere Male.
Wiederholen Sie die Aceton-Beschallung (Schritte 1.2 und 1.3) noch einmal.
Gießen Sie genug 200 mM KOH in das Glas, um die Deckrutsche abzudecken und beschallen Sie abgedeckt, für 20 min bei 40 ° C.
HINWEIS: Der KOH ätscht das Glas leicht.
Spülen Sie die Abdecklippen mit destilliertem_H2O6 mal aus.
Ethanol hinzufügen, um die Deckslippen abzudecken, den Deckel hinzufügen und 10 Minuten bei 40 °C beschallen.
Spülen Sie die Abdecklippen mit destilliertem_H2O3 mal aus.
Nehmen Sie jeden Abdeckr am Rand mit einer sanften Zette auf und trocknen Sie die Abdeckrlips mit N2-Gas. Berühren Sie nur die Kanten des Abdeckungsrutsches. Legen Sie jeden der getrockneten, gereinigten Abdecklippen in eine einzelne saubere Petrischale.

2. Verdunstungsablagerung von Polystyrolperlen

Um die kolloidale Kristallmaske für das ZMW-Array zu erstellen, zentrifugieren Sie 50 μL mit 1 μm Durchmesser, nicht funktionalisierte Polystyrolperlen (2,5% w/v in Wasser) bei 15.000 x g,25 °C für 5 min.
HINWEIS: Vor dem Pipettieren der Perlen sollte die Stammlösung kurz vorgetext werden, falls sich die Perlen auf dem Boden der Flasche abgesetzt haben.
Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie so wenig Wasser wie möglich übrig.
HINWEIS: Restwasser kann die Verdunstungseigenschaften der Ethanol-Resuspension³⁹verändern, so dass das Entfernen einer kleinen Menge Perlen, um das gesamte Wasser zu entfernen, akzeptabel ist.
Die Perlen aus Schritt 2.2 werden in 50 μL 1:400 TritonX-100:Ethanol Lösungsmittel resuspendiert. Mehrmals auf und ab pipetten, um die Perlen gründlich mit dem Lösungsmittel zu mischen.
HINWEIS: TritonX-100: Ethanol-Lösungsmittel sollte nach Gebrauch mit Paraffinfolie versiegelt und einmal im Monat frisch zubereitet werden. Die Perlen neigen dazu, an den Seiten eines Kunststoffgefäßes zu haften, z. B. an einem Mikrozentrifugenröhrchen, also pipetten Sie entlang der Seiten, um sicherzustellen, dass alle Perlen wieder aufgewendet werden.
Um eine Feuchtigkeitskammer für die Ablagerung einzurichten, legen Sie 6 Petrischalen mit jeweils einem Deckslip auf eine Bank in einer Linie mit leicht offenen Deckeln. Bewegen Sie in jeder Schüssel den Abdeckungsrutsch in den offenen Bereich, so dass die Abdeckungsrutsche der Umgebung ausgesetzt sind, wenn die Luftfeuchtigkeit im nächsten Schritt erhöht wird.
Platzieren Sie ein Hygrometer und einen kleinen elektrischen Ventilator zentriert hinter den Petrischalen.
Zeichnen Sie die beginnende relative Luftfeuchtigkeit (RH) im Labor auf. Füllen Sie ein 200 ml Becherglas mit 150−200 ml ~75 °C Wasser und legen Sie es hinter den Ventilator.
Schalten Sie den Ventilator ein und bedecken Sie Petrischalen, Ventilator, Becher und Hygrometer mit einem umgekippten, transparenten Kunststoffbehälter (66 cm x 46 cm x 38 cm).
Lassen Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer auf 70-75% ansteigen, was normalerweise 5-10 Minuten dauert.
HINWEIS: Wenn der rh im Umgebungslabor niedrig ist (unter ~ 50%), lassen Sie die Kammer einen höheren RH erreichen, aber nicht höher als 80%, um den Feuchtigkeitsverlust während der Ablagerung auszugleichen (siehe unten).
Wenn der relative Stand 70-75% erreicht, zeichnen Sie die relative Luftfeuchtigkeit auf und heben Sie den Kunststoffbehälter leicht an, um schnell Abdeckungen auf die Petrischalen zu legen, wodurch eine Überbenetzung der Abdecklippen verhindert wird.
HINWEIS: Die Temperatur in der Kammer ist aufgrund der Befeuchtung etwas wärmer als die Raumtemperatur, typischerweise 25-26 ° C. Wenn Feuchtigkeit auf den Abdecklippen sichtbar ist, sind die Glasoberflächen zu nass. Ein kommerzielles Handschuhfach kann diesen Teil des Protokolls vereinfachen.
Lassen Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer weiterhin auf 85% steigen. Zeichnen Sie an diesem Punkt die relative Luftfeuchtigkeit in der Feuchtigkeitskammer auf und pipetetten Sie 5 μL der Perlensuspension auf die Mitte jedes Abdecks.
Schließen Sie die Kammer und die Petrischalen nach jeder Ablagerung, um den Feuchtigkeitsverlust zu minimieren. Ziel ist es, alle 6 Ablagerungen innerhalb von 2 Minuten zu beenden.
Notieren Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer nach der Ablagerung.
HINWEIS: Die relative Luftfeuchtigkeit nach der Abscheidung hilft zu messen, wie schnell feuchtigkeit während der Ablagerung verloren ging, was von den Umgebungsbedingungen im Labor abhängt. Für einen typischen erfolgreichen Lauf beginnt die Kammer vor der Ablagerung bei 85% RH und endet nach der Ablagerung bei 70-75% RH.
Die Perlentröpfchen verteilen lassen und 5 min trocknen lassen.
HINWEIS: Wenn die kolloidalen Kristalle viele Löcher oder mehrschichtige Regionen haben, war die Kammer wahrscheinlich zu feucht bzw. trocken. Stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit ein, bei der die Petrischalen geschlossen und die Ablagerungen begonnen werden sollen (siehe Abschnitt Ergebnisse für weitere Diskussionen zur Optimierung).

3. Perlenglühen zur Reduzierung der Porengröße in der kolloidalen Kristallschablone

Um eine gleichmäßige Temperaturoberfläche für das Glühen der Polystyrolperlen zu schaffen, die die Zwischenkugel-Zwischenpunkte verengt und die Ecken der Zwischenabstande rundet, legen Sie eine flache, gefräste Aluminiumplatte auf eine Standard-Keramik-Heizplatte.
Stellen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 107 °C ein, die Glasübergangstemperatur von Polystyrol⁴⁰.
HINWEIS: Um eine stabile und genaue Temperatur zu erhalten, wurde eine Thermoelementsonde in einem 2-3 mm breiten und 4-5 mm tiefen Loch in der Aluminiumplatte gehalten.
Legen Sie einen Abdeckrlip mit der Perlenschablone auf die heiße Aluminiumplatte und glühen Sie für 20 s (siehe Diskussionsabschnitt für die Erklärung der Schmelzzeit).
Entfernen Sie nach dem Erhitzen den Deckdeckel von der Aluminiumplatte und legen Sie ihn sofort auf eine andere Aluminiumoberfläche mit Raumtemperatur, um sie zu kühlen.
HINWEIS: Es ist hilfreich, entweder die Abdecklippen leicht über den Rand der Platte hängen zu lassen oder flache Kanäle (siehe begleitendes Video) in die Platte zu fräsen, um die Aufnahme der Abdecklippen zu erleichtern.

4. Nanofabrikation von Aluminium-Zero-Mode-Wellenleitern mit der kolloidalen Kristallschablone

Mit thermischer oder Elektronenstrahl-Verdunstungsabscheidung lagern Sie 300 nm Kupfer bei 2 Å/s über die kolloidale Kristallschablone ab, um Pfosten in den Zwischenablagen zwischen den Perlen zu erzeugen.
Entfernen Sie überschüssiges Metall auf den Perlen, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit Klebeband drücken. Ziehen Sie das Klebeband langsam ab, um das Metall abzuziehen.
HINWEIS: Einige kleine Flecken von reflektierendem überschüssigem Metall können nach dem Bandzug verbleiben, und diese können oft durch einen Strom von_N2-Gas entfernt werden. Wenn nach dem Bandzug erhebliche Flecken von reflektierendem überschüssigem Metall verbleiben, versuchen Sie, die Schablonen 2 Stunden lang in Toluol einzuweichen, um die Polystyrolperlen teilweise aufzulösen. Waschen Sie die Abdecklappen mit destilliertem Wasser, trocknen Sie sie mit_{N 2}und wiederholen Sie den Bandzug. Das zusätzliche Einweichen sollte die Perlen nicht vollständig auflösen, da die Perlen dazu beitragen, die Pfosten vor Beschädigungen während des Bandzugs zu schützen.
Um die Polystyrolperlen aufzulösen, legen Sie die Perlenschablonen in Toluol und weichen Sie sie über Nacht ein.
ACHTUNG: Toluoldämpfe können giftig sein. Arbeiten Sie mit Toluol unter einer gut belüfteten Kapuze und tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und laborbeschichtet. Toluol sollte in belüfteten Schränken gelagert werden, die für brennbare Flüssigkeiten bestimmt sind.
Nach der Toluol-Inkubation spülen Sie die Schablonen einmal mit Chloroform und zweimal mit Ethanol ab. Behandeln Sie an dieser Stelle vorsichtig die Abdeckungen, da die empfindlichen 200-300 nm hohen Metallpfosten jetzt freigelegt sind. Trocknen Sie die Schablonen mit_{N 2} und entfernen Sie Restpolymere und Verunreinigungen in einem Sauerstoffplasmareiniger für 30 min.
ACHTUNG: Chloroforme Dämpfe können giftig sein. Arbeiten Sie mit Chloroform unter einer gut belüfteten Kapuze und tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel. Chloroform sollte in belüfteten Schränken fern von anderen brennbaren Lösungsmitteln gelagert werden.
Mit thermischer oder Elektronenstrahl-Verdunstungsabscheidung 3 nm einer Titanadhäsionsschicht bei 1 Å/s abscheiden, gefolgt von 100−150 nm Aluminium bei 4 Å/s um und auf den Kupferpfosten.
HINWEIS: Man kann eine dickere Verkleidung verwenden, um tiefere Führungen und eine bessere Dämpfung der Hintergrundfluoreszenz zu erhalten, aber dies verringert auch die Ausbeute nach dem Freilegen und Auflösen der Pfosten im nächsten Schritt (siehe Diskussionsabschnitt).
Um die Metallpfosten aufzulösen, weichen Sie die Abdecklippen in Kupferätzmittel (Zitronensäure-basiert; Materialtabelle) für 2 h.
ACHTUNG: Metallätzen kann Hautverbrennungen verursachen. Arbeiten Sie mit Ätzmitteln unter einer gut belüfteten Motorhaube und tragen Sie Schutzausrüstung. Waschen Sie die Hände nach der Handhabung gründlich. Metallätzmittel sollten in belüfteten Schränken gelagert werden, die für korrosive Flüssigkeiten bestimmt sind.
Spülen Sie die Deckzettel mit destilliertem Wasser ab, trocknen Sie sie mit N₂und polieren Sie die Oberfläche der Metallverkleidung vorsichtig mit Linsenpapier ab, um alle Pfosten freizulegen, die noch mit der Verkleidung bedeckt sind. Die Abdecks für weitere 2 h wieder in Kupferätzung geben, dann erneut mit destilliertem Wasser abspülen und mit_{N2 trocknen.}
HINWEIS: ZMW-Objektträger sollten in abgedeckten, sauberen Petrischalen aufbewahrt werden, um sie frei von Verunreinigungen zu halten.

5. Nanofabrikation von Gold-Nullmodus-Wellenleitern mit der kolloidalen Kristallschablone

HINWEIS: Die Methode zur Herstellung von Gold-ZMWs (Ergänzende Abbildung 1), die das Protokoll zur Herstellung von Aluminium-ZMWs widerspiegelt, wird in diesem Abschnitt bereitgestellt.

Mit thermischer oder Elektronenstrahlverdunstungsabscheidung 3 nm einer Titanadhäsionsschicht bei 1 Å/s abscheiden, gefolgt von 300 nm Aluminium bei 4 Å/s.
Entfernen Sie überschüssiges Metall auf den Perlen, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit Klebeband drücken. Ziehen Sie das Klebeband langsam ab, um das Metall abzuziehen.
Um die Polystyrolperlen aufzulösen, legen Sie die Perlenschablonen in Toluol und weichen Sie sie über Nacht ein.
Nach der Toluol-Inkubation spülen Sie die Schablonen einmal mit Chloroform und zweimal mit Ethanol ab. Trocknen Sie die Schablonen mit_{N 2} und entfernen Sie reste Polymerverunreinigungen in einem Sauerstoffplasmareiniger für 30 min.
Mit thermischer oder Elektronenstrahlverdunstungsabscheidung lagern Sie 100-150 nm Gold bei 5 Å / s um und auf den Aluminiumpfosten ab.
Um die Metallpfosten aufzulösen, weichen Sie die Abdeckel in Aluminiumätzmittel (auf Phosphorsäurebasis; Materialtabelle) für 1 h.
Spülen Sie die Deckzettel mit destilliertem Wasser ab, trocknen Sie sie mit N₂und polieren Sie die Oberfläche der Metallverkleidung vorsichtig mit Linsenpapier ab, um alle Pfosten freizulegen, die noch mit der Verkleidung bedeckt sind. Legen Sie die Abdeckel für 1 h wieder in Aluminiumätzen, dann erneut mit destilliertem Wasser abspülen und mit_{N2 trocknen.}
HINWEIS: ZMW-Dias sollten in abgedeckten, sauberen Petrischalen aufbewahrt werden.

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Representative Results

Die Selbstorganisation der kolloidalen Polystyrolpartikel durch Verdunstungssedimentation (Schritte 2.1−2.13) kann zu einer Reihe von Ergebnissen führen, da sie eine Kontrolle der Lösungsmittelverdampfungsrate erfordert. Da die Ablagerungen jedoch schnell sind (10-15 min pro Runde), kann das Verfahren schnell für unterschiedliche Umgebungsbedingungen im Labor optimiert werden. Abbildung 3A zeigt eine wohlgeformte kolloidale Schablone nach Ablagerung und Verdampfung. Makroskopisch ist der Bereich der Perlen kreisförmig, mit Grenzen, die durch einen undurchsichtigen, mehrschichtigen Perlenring definiert sind. Die durchscheinenden, aber nicht weißen Bereiche im Bild sind die gewünschten Einschichtbereiche. Abbildung 3B zeigt eine kolloidale Schablone, die in einer übermäßig feuchten Umgebung verpackt war (80% RELATIVE Luftfeuchtigkeit bei geschlossenen Petrischalen). Diese Schablonen neigen dazu, keine saubere kreisförmige Grenze zu haben und mehrschichtige Ranken zu haben, die sich nach außen erstrecken. Die Abscheidung ist akzeptabel und kann in nachfolgenden Phasen verwendet werden, aber die Löcher im Gitter reduzieren die Anzahl der nutzbaren ZMW-Array-Bereiche für die Einzelmolekül-Bildgebung. Abbildung 3C zeigt eine kolloidale Schablone, die in einer zu trockenen Umgebung verpackt war (65% RH bei geschlossenen Petrischalen). Diese Vorlagen sind in der Regel kleiner im Durchmesser im Vergleich zu den idealen, gut verteilten Vorlagen. Die Abscheidung kann verwendet werden, aber die mehrschichtigen, weißen Bereiche, die nach innen streifen, reduzieren die für die Bildgebung nutzbare Fläche. Daher empfehlen wir nicht, mehr als 6 Ablagerungen gleichzeitig durchzuführen, da Ablagerungen gegen Ende des Prozesses bei einer niedrigeren Luftfeuchtigkeit auftreten, wenn die Kammer geöffnet und geschlossen wird. Abbildung 3D zeigt das Regenbogenmuster, das durch Beugung des reflektierten Lichts aus dem Polystyrolkristall erzeugt wird. Dieses Muster kann verwendet werden, um den Erfolg und die Qualität der Kristallpackung mit dem Auge zu bestätigen. Abbildung 3E,F zeigt Rasterkraftmikroskopie (AFM) Bilder von gut verpackten kolloidalen Schablonen. Die Defekte zwischen den Körnern entstehen durch Verklemmen während der Verdunstungssedimentation⁴¹, und verschiedene Körner können mit einem 10-fachen Objektiv gesehen werden. So kann die Untersuchung der Kolloidablagerungen mit einem Low-Power-Lichtmikroskop auch zur Beurteilung der Packung verwendet werden.

Nach der Abscheidung von Kupfer auf die geglühten kolloidalen Schablonen (Schritt 4.1) sollte das Regenbogenbeugungsmuster noch sichtbar sein und durch die reflektierende Metallbeschichtung der Oberseiten der Perlen verstärkt werden (Abbildung 4A,B). Die Schablonen verlieren das reflektierende Regenbogenbeugungsmuster nach dem Scotch-Bandzug (Schritt 4.2), der überschüssiges Kupfer entfernt(Abbildung 4C). Abbildung 4D,E zeigt AFM-Bilder eines typischen Feldes von Kupferpfosten nach Metallabscheidung. Die Defekte zwischen den kolloidalen Kristallkörnern in Abbildung 3E sind in den Kupferpfostenbildern als größere Kupferbereiche sichtbar. Die Analyse von AFM-Bildern zeigt, dass bei einer Kupferabscheidungsdicke von 300 nm die späteren Kupferpfosten durchschnittlich 255 nm(Abbildung 4F)in der Höhe und 121 nm im Durchmesser (Abbildung 4G) aufweisen.

Die Abscheidung der Aluminiumverkleidung (Schritt 4.5), wo sich die Perlen befanden, und auf den Kupferpfosten und die anschließende Auflösung der Pfosten (Schritte 4.6 und 4.7) führen zu den in Abbildung 5A−Cgezeigten Aluminium-ZMWs . Defekte zwischen den kolloidalen Kristallkörnern sind als größere Öffnungen sichtbar (Abbildung 5B). Der durchschnittliche Abstand zwischen den ZMW-Zentren in Abbildung 5C beträgt 559 nm, was mit dem Abstand übereinstimmt, der durch die sechseckige Nahpackungsgeometrie der 1 μm-Kügelchen festgelegt wird ( Die Verwendung von Equation 1 Polystyrolschablonen, die für 20 s geglüht wurden, führt zu Wellenleitern, die durchschnittlich 118 nm im Durchmesser haben (Abbildung 5D, E), die mit den Pfostendurchmessern übereinstimmen und ausreichend klein sind, um die Ausbreitung des sichtbaren Lichts zu unterbrechen. Ein Höhenprofil eines Hohlleiters aus Abbildung 5D zeigt ebenfalls, dass er ~120 nm tief ist.

Einzelmolekül-FRET wurde in den ZMWs durchgeführt, um die Funktionalität zu testen (Abbildung 6A). Ein typisches Feld von ZMWs für die Bildgebung ist in Abbildung 6Bdargestellt, das >3000 Wellenleiter in einem Sichtfeld von 40 x 80 μm enthält. Die ZMWs wurden zunächst mit den zuvor beschriebenen Protokollen⁴²^,⁴³passiviert. Kurz gesagt, die Aluminium-ZMWs wurden mit Poly(vinylphosphonsäure) passiviert, um die Aluminiumverkleidung zu beschichten, gefolgt von Methoxy-terminiertem Polyethylenglykol (PEG), das mit Biotin-terminiertem PEG dotiert wurde, um die Glasböden der ZMWs zu beschichten. Gold-ZMWs können mit thiol-derivatisiertem PEG passiviert werden, um die Goldhülle zu beschichten, gefolgt von einer ähnlichen PEG-Behandlung für die Glasböden. Strömungskammern, ~20 μL Volumen, wurden dann für die Einzelmolekülbildgebung^{konstruiert 44}. Die Einzelmolekül-FRET-Bildgebung der DNA-Duplexe wurde wie zuvor beschrieben^{durchgeführt 38}. Kurz gesagt, 100 pM−1 nM Cyanin-3/Cyanin-5 (Cy3/Cy5), biotinylierte DNA-Duplexe (33 Basenpaarlänge) wurden für 10 min in Strömungskanälen inkubiert, die mit Streptavidin funktionalisiert waren (5 min Inkubation, 0,5 mg/ml Lösung). Die Konzentration der markierten Makromoleküle kann titriert werden, um eine Belastung der Wellenleiter mit einem Molekül von ~ 20% zu erreichen, was zu <5% Wellenleitern führt, die mit mehr als einem Molekül beladen sind, basierend auf der verteilten Poisson-Belastung (die meisten Wellenleiter, ~ 75%, haben keine Moleküle)⁴⁵. Ungebundene DNA wurde mit nukleasefreiem Duplexpuffer weggespült, gefolgt von Beleuchtungspuffer (0,3% [w/v] Glucose, 300 μg/ml Glucoseoxidase, 120 μg/ml Katalase und 1,5 mM Trolox [6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carbonsäure]). Nicht biotinylierte Cy5-markierte DNA-Duplexe (33 Basenpaarlänge) waren im Beleuchtungspuffer bei 0, 50, 100 und 500 nM als Hintergrundfluorophore in Lösung vorhanden. Einzelmolekül-FRET-Spuren aus den immobilisierten Cy3/Cy5-Duplex-DNA-Molekülen wurden mit einem speziell angefertigten TIRF-Mikroskop aufgezeichnet, das an Epifluoreszenzbedingungen angepasst war. Filme wurden mit einem 1,48 numerischen Apertur (NA) 100x Ölimmersionsobjektiv mit abwechselnder Anregung von 532 nm und 640 nm (100 ms Belichtung) und einem Dual-View-Spektralsplitter aufgenommen, um Cy3- und Cy5-Emission gleichzeitig auf einer elektronenvervielfachenden ladungsgekoppelten Gerätskamera (EMCCD) aufzuzeichnen. Einzelmolekül-FRET-Spuren mit einstufigen Bleichmitteln im Cy5-Kanal waren in allen Konzentrationen von cy5-Umgebung nachweisbar (Abbildung 6C-F). Im Vergleich dazu wären einzelne Moleküle nur in TIRF-Beleuchtung mit pM bis niedrigen nM-Lösungsfluorophorkonzentrationen^{nachweisbar 46}.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Nullmodus-Wellenleiter. Diagramm des ZMW-Arrays mit erweitertem Querschnittsdiagramm eines einzelnen ZMW auf der rechten Seite. Einzelne fluoreszierend markierte Enzyme von Interesse (braunes Ribosom mit rotem Kreis zur Darstellung von Fluoreszenzfarbstoff), die chemisch immobilisiert sind (über die mRNA in diesem Beispiel) zum Glasboden der ZMWs (typischerweise funktionalisiert mit biotinyliertem PEG), können mit einem typischen laserbasierten Epifluoreszenzmikroskopie-Setup abgebildet werden. Das 532 nm Anregungslicht (grüne Pfeile) wird aufgrund der geringen Größe der Apertur (100−200 nm Durchmesser) an der Glas-Metall-Grenze reflektiert, aber eine sich nicht ausbreitende evaneszente Welle, die exponentiell in der Intensität zerfällt, ist im ZMW vorhanden. Daraus ergibt sich eine effektive Beleuchtungstiefe von 10−30 nm (Grünschattierung in der Öffnung). Einzelne fluoreszierende Liganden (blaue tRNAs mit grünen Kreisen als fluoreszierende Tags) bei nM- bis μM-Konzentrationen werden hinzugefügt. Ein einzelner Ligand, der in die Öffnung diffundiert und mit dem Enzym interagiert, wird ohne prohibitive Hintergrundfluoreszenz abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der kolloidalen Vorlagenmethode, die zur Herstellung von Aluminium-ZMW-Arrays entwickelt wurde. Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von 1 μm werden auf einem gereinigten Glasdeckel abgeschieden und selbst montiert, wie in Abschnitt 2 des Protokolls beschrieben. Die Perlen werden dann geglüht, um die Porengrößen zu reduzieren (Abschnitt 3), gefolgt von Kupferablagerung und Perlenauflösung in Toluol. Aluminium wird um und auf den Kupferpfosten abgelagert, die dann selektiv weggeätzt werden, um eine sechseckige Anordnung von Nanoaperturen zu hinterlassen (Abschnitt 4). Für die letzten drei Schritte werden Rechts neben den Planansichten Querschnittsansichten bereitgestellt, um die Breiten und Höhen der Kupferpfosten und Aluminium-ZMWs anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse aus der Verdunstungsablagerung von Kolloiden. (A) Beispiel für eine optimale Kolloidablagerung. (B) Beispiel für eine akzeptable Kolloidablagerung, bei der die Bedingungen feuchter (80 % relative Luftfeuchtigkeit) als ideal waren. Löcher in der Kristallmonoschicht sind sichtbar. (C) Beispiel für eine akzeptable Kolloidablagerung, bei der die Bedingungen trockener (65 % relative Luftfeuchtigkeit) als optimal waren. Die einschichtigen Bereiche sind leicht durchscheinend, während mehrschichtige Bereiche weiß und undurchsichtig sind (Umfang und Streifen nach innen). (D) Ein kolloidaler Kristall, der mit weißem Licht beleuchtet wird, um die Regenbogenbeugung der Kristalle hervorzuheben. (E) AFM-Bild (Tapping-Sonde AFM in Luft) einer Monoschicht aus sechseckig verpackten Polystyrolperlen aus einer erfolgreichen Kolloidabscheidung (Skalenbalken = 10 μm). (F) Erweitertes AFM-Bild von verpackten Perlen (Maßstabsbalken = 2 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Makroskopische und mikroskopische Aufnahmen von ZMW-Schablonen nach Kupferabscheidung. (A) Bild von Objektträgern nach physikalischer Verdampfung von Kupfer auf den Perlenschablonen. (B) Regenbogenbeugungsmuster aus Perlenschablonen nach Kupferablagerung. (C) Bild einer Schablone (rechts) nach einem Bandzug, um überschüssiges Kupfer und das Band zu entfernen (links). (D) AFM-Bild von Kupferpfosten nach Bandzug und vollständiger Auflösung der Polystyrolperlen (Skalenbalken = 5 μm). (E) AFM-Bild mit höherer Vergrößerung von Panel D (Maßstabsbalken = 2 μm). (F) Histogramm der Kupferpfostenhöhen (definiert als maximale Höhenmessung innerhalb jedes Pfostens), n = 534. (G) Histogramm der Kupfer-Post-Feret-Durchmesser, n = 201. Der Feretdurchmesser ist der maximale Abstand zwischen zwei parallelen Linien, die tangential zur Pfostengrenze verlaufen (quantifiziert in Bild J⁴⁷). Um Partikel für die Analyse zu identifizieren, wurde eine Schwelle auf halbem Weg zwischen der Oberseite der Verkleidung und der unteren Glasoberfläche verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Makroskopische und mikroskopische Aufnahmen von Aluminium-ZMWs. (A) Bild von Objektträgern nach physikalischer Verdunstungsablagerung von 150 nm Aluminium um und auf den Kupferpfosten. (B) AFM-Bild von Aluminium-ZMWs nach der Auflösung (Skalenbalken = 5 μm). (C) Bild mit höherer Vergrößerung von Panel B (Maßstabsleiste = 0,2 μm). (D) Typisches Tiefenprofil eines einzelnen ZMW aus Panel C. Profil entnommen aus der grünen Linie in Panel C. (E) Histogramm der ZMW Feret Durchmesser, n = 240. Feret-Durchmesser wurden wie in Abbildung 4gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Einzelmolekül-FRET-Bildgebung in ZMWs. (A) Schematische (nicht maßstabsgetreue) Einzelmolekül-FRET-Bildgebung von Cy3, Cy5-markierten DNA-Duplexen in ZMWs mit Cy5-markierten Duplexen im Hintergrund. (B) Beispielfeld von ZMWs unter Weißlichtbeleuchtung (Skalenbalken = 10 μm). (C−F) Einzelmolekül-FRET-Aufnahmen von DNA-Duplexen, die in den ZMWs in Gegenwart von 0 (C), 50 (D), 100 (E)und 500 nM (F) Cy5-markierten Duplexen in Lösung immobilisiert wurden. Für jede Konzentration zeigt das obere Panel die Cy3 (grün) und Cy5 (rot) Fluoreszenzintensität unter 532 nm Laserbeleuchtung (FRET-Bildgebung), das mittlere Panel zeigt die Cy5-Fluoreszenzintensität unter 640 nm Laserbeleuchtung (direkte Akzeptoranregung) und das niedrigste Panel zeigt die FRET-Effizienz ( Equation 2 ) berechnet aus den rohen Cy3 ( I_D) und Cy5 (I_A) Fluoreszenzintensitäten. Während der Bildgebung wechselte die Anregungswellenlänge alle 100 ms zwischen 532 und 640 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Schematische Darstellung der kolloidalen Vorlagenmethode, die zur Herstellung eines Gold-ZMW-Arrays entwickelt wurde. Das Protokoll zur Herstellung eines Gold-ZMW-Arrays ist analog zum Protokoll zur Herstellung eines Aluminium-ZMW-Arrays (Abbildung 2). Anstatt Kupfer auf die Polystyrolperlen abzuscheiden, wird Aluminium abgeschieden. Nach dem Auflösen der Perlen in Toluol wird Gold anstelle von Aluminium auf den Pfosten abgelagert. Aluminiumpfosten werden dann selektiv geätzt, um ein goldenes ZMW-Array zu hinterlassen. Für die letzten drei Schritte werden Rechts neben den Planansichten Querschnittsansichten zur Verfügung gestellt, um die Breiten und Höhen der Aluminiumpfosten und Gold-ZMWs anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 2: Finite-Elemente-Modellierung der elektromagnetischen Feldausbreitung in ZMWs. (A−D) Querschnitte der Größe des zeitgemittelten Poynting-Vektors (W/m²) durch einen Wellenleiter aus einer nicht gerenderten Schablone (A,C) und einer geglühten Schablone (B,D). Linear polarisierte elektromagnetische ebenen Wellen (1 W verteilt über die Fläche des Objektträgers) bei den in der Abbildung aufgeführten Wellenlängen (400 nm oder 1.000 nm) wurden auf die Unterseite projiziert, und der niedrigste (fundamentale) Modus, der die niedrigste Wellenzahl aufweist, wurde mit Hilfe einer Modellierungssoftware (Table of Materials) mit der Finite-Elemente-Methode zur Lösung von Maxwells Gleichungen und geeigneten Randbedingungen berechnet. Die Grenzen der Wellenleiter wurden als perfekte elektrische Leiter angenommen, was durch Aluminium- oder Goldwände gut angenähert wird. Der Querschnitt aus der unannealierten Hohlleiterschablone wurde durch die sechseckige Packung von Kreisen mit 1 μm Durchmesser bestimmt, und die dreizackigen Spitzen aus der resultierenden dreieckigen Form wurden auf ~ 60 nm Breite abgeschnitten, um eine realistische physikalische Blende zu modellieren. Der Querschnitt aus den geglühten Schablonen wurde als Kreis von 130 nm Durchmesser angenähert. Beide Hohlleiter hatten eine Tiefe von 130 nm, ähnlich der Hülltiefe nach der Herstellung. (E,F) Zusätzlich zu den Anregungswellenlängen von 400 nm und 1.000 nm wurden die Modelle bei 100 Anregungswellenlängen gelöst, die gleichmäßig zwischen 400 nm und 1.000 nm verteilt waren, und der effektive Modenindex (definiert als Equation 3 , wobei k_z die Wellenzahl im Wellenleiter ist, die aufgrund der Einschränkung in der Querebene verringert wird, und k die Anregungslichtwellenzahl im Vakuum) gegen die Anregungswellenlänge für die dreieckigen (E) und kreisförmigen (F) Wellenleiter aufgezeichnet wurde. Bei kürzeren Wellenlängen werden höhere Modi angeregt und der effektive Modusindex steigt (der maximale effektive Modusindex ist 1, was der Grenzfall ist, in dem sich die elektromagnetische Ebene ungebunden in der Querdimension bewegt). Die effektiven Cutoff-Wellenlängen der Wellenleiter wurden als die Wellenlänge geschätzt, bei der der effektive Modusindex auf 0 fällt. Beachten Sie, dass die Kreisförmige Führung λ_Cutoff = 221 nm aus der Finite-Elemente-Modellierung (F) mit der theoretischen Vorhersage der Cutoff-Wellenlänge eines kreisförmigen Wellenleiters übereinstimmt (λ_{Cutoff, analytisch} = 1,7d = 221 nm, wobei d der Wellenleiterdurchmesser ist). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse aus der Au ZMW-Fertigung. (A) Makroskopisches Bild von Gold-ZMW-Arrays. (B−D) AFM-Bilder von Aluminiumpfosten aus einer Perlenschablone, die nicht geglüht wurde (B),einer Vorlage, die bei 107 °C für 20 s (C)geglüht wurde, und einer Vorlage, die bei 107 °C für 25 s (D)geglüht wurde. (E) AFM-Bild von Gold-ZMWs nach Auflösung von Aluminiumpfosten. (F) AFM-Bild mit höherer Vergrößerung des Panels E.(G) Typisches Tiefenprofil eines golden ZMW. Profil aus der grünen Linie in Feld F (Maßstabsbalken = 1 μm in B, C, Dund F; 5 μm in E). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Für die kolloidale Selbstorganisation (Protokollabschnitt 2) beschleunigt die Verwendung von Ethanol anstelle von Wasser als Suspensionslösungsmittel den Verdampfungsprozess, so dass die Schablonen in 2−3 min nach der Abscheidung fertig sind und nicht wie bei den vorherigen Methoden^48,^{49 in 1−2}h. Das hier vorgestellte Verdunstungssedimentationsprotokoll ist auch einfacher als frühere Sedimentationsprotokolle, die die Kontrolle von Oberflächenneigung, Temperatur und Luftvolumen über der Suspension⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹erfordern. Die in diesem Protokoll verwendete Partikelvolumenfraktion beträgt 2,4%, höher als die 0,2−0,5%, die in früheren Sedimentationsmethoden⁴⁸verwendet wurden, die Kolloide in Wasser-Glycerin-Gemischen für viel längere Absetzzeitskalen resuspendierten. Die Qualität der Ablagerungen ist jedoch robust gegenüber Veränderungen der Partikelvolumenfraktion, wobei frühere Studien ergeben haben, dass sie zwischen 2-10%⁴⁹^,50^,⁵¹variiert werden kann. Die Korngrößen der kolloidalen Kristalle, die bei einer erfolgreichen Abscheidung aus diesem Protokoll erhalten wurden, sind 20-30 μm breit, größer als Körner aus früheren Sedimentationsmethoden (typischerweise mehrere hundert Nanometer im Gesamtbereich)⁴⁸^,⁴⁹. Makroskopisch sind die etwa 2 cm im Durchmesser der kolloidalen Monoschicht auch vergleichbar mit den 1 cm großen Flächen, die mit früheren Verfahren erzeugt wurden⁴⁹. Die große Größe der bei diesem Verfahren hergestellten kolloidalen Kristallschablonen ermöglicht es auch, auf jedem ZMW-Objektträger 3−5 getrennte Strömungskammern 44 mit einer Breite von jeweils etwa 3−4 mm zu erstellen. So können an jedem Objektträger mehrere unabhängige Einzelmolekülexperimente durchgeführt werden.

Das Glühen der kolloidalen Perlenschablonen (Protokollabschnitt 3) nach der Selbstmontage ist ein einfacher, aber entscheidender Schritt, um die Hintergrundfluoreszenz mit den ZMWs ausreichend zu reduzieren. Wie die ergänzende Abbildung 2 zeigt, beträgt die effektive Grenzwellenlänge für einen Wellenleiter mit dem dreieckigen Querschnitt aus einer nicht gerenderten Schablone 894 nm. Im Vergleich dazu beträgt die effektive Cutoff-Wellenlänge für einen kreisförmigen Wellenleiter mit einem Durchmesser von 130 nm aus einer geglühten Schablone 221 nm, wie sowohl analytisch (1,7-facher Durchmesser der Führung¹⁸⁾als auch numerisch bestimmt. Die Verwendung kleinerer Perlen für die Abscheidung könnte auch die Größe der Schablonenporen reduzieren, aber die Wellenleiter würden dann näher als 200 nm angeordnet, was um die Beugungsgrenze des sichtbaren Lichts liegt. Weiterhin würden die Wellenleiter im Querschnitt dreieckig bleiben, was zu einer unsymmetrischen Leistungsausbreitung durch den Wellenleiter führt (Ergänzende Abbildung 2A−D). Ein Nachteil des Glühschritts ist, dass die Variabilität der Schmelzzeit zu Schwankungen des Hohlleiterdurchmessers führen kann, so dass ein genaues Timing dazu beiträgt, die Variationen zwischen den Chargen zu minimieren. Die Zwischen zwischengesetzten Zwischen zwischen 25 s beginnen sich zu glühenden Zeiten zu schließen, und die Pfostendurchmesser nehmen zwischen 20-25 s nicht sehr stark ab (Ergänzende Abbildung 3B−D). Ein schneller Test für den Interstice-Verschluss besteht darin, zu überprüfen, ob geglühte Schablonen immer noch ein Regenbogenbeugungsmuster erzeugen, wenn sie mit Licht beleuchtet und in einem Winkel betrachtet werden. Wenn nicht, hat sich die Mehrheit der Zwischen zwischen stellte wahrscheinlich geschlossen. Der Zusammenhang zwischen Glühzeit und typischen Porendurchmessern wurde bereits früher vorgestellt³⁸.

Nach Erreichen der gewünschten Porengröße während des Glühschritts wird Kupfer (Schritt 4.1) auf die Schablonen abgeschieden, um einen Schatten der Maske zu erzeugen. Es ist wichtig, die Sichtlinienabscheidung zu verwenden, wobei sich das Metall der Schablone so senkrecht wie möglich nähert. Daher trägt die Erhöhung des Abstands zwischen der Probe und der Metallquelle sowie die Sicherstellung, dass sich die Platte, die die Schablonen hält, nicht dreht, wie dies bei einigen Dampfabscheidungsmaschinen automatisch geschieht, dazu bei, die laterale Abscheidung von Metall auf dem Polystyrolsubstrat zu minimieren. Es ist jedoch eine gewisse seitliche Abscheidung unvermeidlich, die die Größe des interstitiellen Lochs und damit den Pfostenquerschnitt reduziert, wenn mehr Metall abgeschieden wird⁵². Dies führt zu pyramidenförmigen Metallpfosten anstelle von prismenartigen Strukturen⁵².

Da die Kupferpfosten wahrscheinlich pyramidenförmig und nicht prismenförmig sind, bedeckt die Aluminiumablagerung (Schritt 4.5) auf den Pfosten auch einige der geneigten Seiten und blockiert die Zugänglichkeit des Kupferätzens für einige der Pfosten. So wurde der Objektivpapier-Buffing-Schritt (Schritt 4.7 oder 5.7) nach dem ersten Einweichen in Ätzen hinzugefügt, um alle noch mit Aluminium bedeckten Kupferpfosten mechanisch zu stören. Das Abscheiden von mehr Kupfer, um höhere Pfosten zu erzeugen, macht die Pfosten auch anfälliger für mechanische Störungen während des Linsenpapiers. Es sollten jedoch nicht mehr als 500 nm Kupfer abgelagert werden, da das Ziel der Abscheidung darin besteht, das interstitielle Loch an der 500 nm-Mittellinie der 1 μm-Perlen zu projizieren.

Eine weitere mögliche Schwierigkeit ist das unbeabsichtigte Entfernen der Aluminiumverkleidung während des Linsenpapiers (Schritt 4.7 oder 5.7). Es wurde festgestellt, dass der Verlust der Aluminiumverkleidung während des Polierens nach dem Hinzufügen des Glühschritts häufiger wurde, wahrscheinlich aufgrund erhöhter Polystyrolrückstände, die die Aluminiumhaftung an Glas beeinträchtigen können (Protokollabschnitt 3). Das nächtliche Toluol-Einweichen (Schritt 4.3 oder 5.3) nach dem Bandzug löste dieses Problem jedoch. Im AFM-Bild in Abbildung 4Esind einige Restringe aus Polystyrol zwischen den Pfosten zu sehen, aber die Aluminiumverkleidung widerstand in Schritt 4.7 immer noch mehreren Buffs. Wenn der Verlust der Aluminiumverkleidung nach dem nächtlichen Toluoleinweichen ein Problem bleibt, kann eine RCA-1-Wäsche (Standard Clean-1), piranha-Wäsche oder eine weitere Sauerstoffplasmareinigung zu Schritt 4.4 oder 5.4 hinzugefügt werden. Diese Waschschritte können auch nach dem letzten Ätzschritt (Schritt 4.7 oder 5.7) und vor der Passivierung hinzugefügt werden, um die ZMWs weiter zu reinigen.

Die Leistung der ZMWs in Einzelmolekül-FRET-Experimenten war ähnlich wie bei ZMWs, die mit EBL hergestellt wurden. In einer früheren Studie^53, in der Einzelmolekül-FRET auf Cy3-markierter einzelsträngiger DNA mit Cy5-markiertem DNA-Helikase-Loader-Protein in Lösung (die gleiche Donor-Akzeptor-Anordnung wie in Abbildung 6A)durchgeführt wurde, waren FRET-Ereignisse bei 100 nM Cy5-Hintergrund deutlich erkennbar, bei 1 μM weniger klar (niedrigeres Akzeptor-Spurensignal zu Rauschen) und bei 10 μM nicht erkennbar. Wir stellen fest, dass eine frühere Studie mit kommerziellen ZMWs berichtete, dass Einzelmolekül-FRET-Akzeptorsignale bei Hintergrundkonzentrationen von bis zu 1 mM⁵⁴höher waren als wir und andere frühere Studien⁴²^,⁵³ mit intern hergestellten ZMWs erreicht haben. Eine weitere Erörterung der Signal-zu-Hintergrund-Performance zwischen ZMWs findet sich in Jamiolkowski et al.³⁸. Die unspezifische Wechselwirkung der fluoreszierenden Probe mit den ZMW-Oberflächen⁵³ ist eine häufige Herausforderung, die den Zugang zu höheren Konzentrationen einschränkt, insbesondere wenn die diffundierende fluoreszierende Spezies in Lösung ein großes Makromolekül ist. Studien mit ZMWs zu komplexen biochemischen Systemen wie der Translation haben typischerweise die Konzentrationen freier fluoreszierender Substrate auf 100−250 nM⁵⁵^,⁵⁶^,⁵⁷^,⁵⁸begrenzt. Unabhängig von der beabsichtigten Anwendung der ZMWs wird wahrscheinlich eine Optimierung der Passivierungsmethoden für verschiedene Systeme erforderlich sein, um ein akzeptables Signal zu Rauschen bei hohen Konzentrationen aufrechtzuerhalten.

Insgesamt erfordert die hier vorgestellte Methode keine speziellen Fähigkeiten oder Ausrüstung, ermöglicht die parallele Herstellung vieler Schablonen auf einmal und kann angepasst werden, um ZMWs in verschiedenen Metallen herzustellen. In dieser Arbeit wurden Kupfer und Aluminium durch Aluminium bzw. Gold ersetzt, um Gold-ZMW herzustellen (Ergänzende Abbildung 3). Dies ist vorteilhaft für Labore, die Passivierungsmethoden aus Gold anstelle von Aluminium verwenden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Gold-ZMWs die Emission für Fluorophore erhöhen, die im roten Bereich des sichtbaren Spektrums absorbieren, während Aluminium-ZMWs die Emission für Fluorophore erhöhen, die im grünen Bereich absorbieren⁵⁹. In Zukunft könnte die fluoreszierende Signalintensität von ZMWs, die mit diesem Verfahren hergestellt werden, durch Ätzen in das Glas unterhalb der ZMW-Metallverkleidung mit HF¹⁶^,²⁶^,⁶⁰erhöht werden. Dadurch entfernen sich die immobilisierten Biomoleküle weiter von den Metallwänden, die Fluorophore abschrecken können⁶¹. Darüber hinaus gibt es eine maximale Beleuchtungsintensität unterhalb des Eingangs der Öffnung, und dies wurde zuvor genutzt, um die Einzelmolekülemission²⁶^,⁶⁰zu erhöhen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch nihfinanzierte R01GM080376, R35GM118139 und NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 an Y.E.G. und durch ein NIAID-Prädoktoranden-NRSA-Stipendium F30AI114187 an R.M.J.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone	Sigma	32201	1 L
Coplin glass staining jar	Fisher Scientific	08-817	Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	Potassium hydroxide
Petri dishes	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator	Branson	Z245143	Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 in.
Desk fan	O2Cool	FD05001A	Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker	Fisher Scientific	02-555-25B	250 mL
Humidity meter	Fisher Scientific	11-661-19
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	21-402-903	1.5 mL
Polystyrene microspheres	Polysciences	18602-15	1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate	Fisher Scientific	AA11062RY	Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller	McMaster-Carr	38615K71	Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe	McMaster-Carr	9251T93	Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant	Transene	Type A
Aluminum pellets	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	For electron beam evaporation
Chloroform	Sigma	288306	1 L
Copper etchant	Transene	49-1
Copper pellets	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	For electron beam evaporation
Gold pellets	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	For electron beam evaporation
Lens paper	Thorlabs	MC-5
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Scotch tape	Staples	MMM119
Thin film deposition system	Kurt J. Lesker	PVD-75	Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	For electron beam evaporation
Toluene	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter	Photometrics, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.