Einfacher Nachweis der primären Cilia durch Immunfluoreszenz

Zusammenfassung

Primäre Zilien sind extrazelluläre Strukturen, die mit dem Centriole verbunden sind. Der primäre Ziliennachweis durch immunfluoreszierende Färbung ist ein relativ einfaches Verfahren, das zu extrem hochwertigen Bildern führt. In diesem Protokoll wurden Fibroblasten, die primäre Zilien exdrücken, fixiert, immungefärbt und in einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop abgebildet.

Zusammenfassung

Primäre Zilien werden während des Zellzyklusfortschritts dynamisch reguliert, insbesondere während der G0/G1-Phasen des Zellzyklus, die vor der Mitose resoorbiert werden. Primäre Zilien können mit hochentwickelten Methoden visualisiert werden, einschließlich Transmissionselektronenmikroskopie, 3D-Bildgebung oder mit Software zur automatischen Detektion von Primärzilien. Jedoch, immunfluoreszierende Färbung der primären Zilien ist erforderlich, um diese Methoden durchzuführen. Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur einfachen Detektion von primären Zilien in vitro durch Färbung von acetyliertem Alpha-Tubulin (Axonem) und Gamma-Tubulin (Basalkörper). Dieses immunfluoreszierende Färbeprotokoll ist relativ einfach und führt zu qualitativ hochwertigen Bildern. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie vier Zelllinien (C2C12, MEF, NHLF und Hautfibroblasten), die primäre Zilien exdrücken, mit einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop fixiert, immungefärbt und abgebildet wurden.

Einleitung

Primäre Zilien sind sensorische, einsame, membrangebundene, nichtmotile Strukturen, die mit dem Mutterzenriole der Zelle assoziiert sind. Primäre Zilien sind auf den meisten Wirbeltierzellen mit Ausnahme von roten Blutkörperchen, Adipozyten¹und Hepatozyten²gefunden. Primäre Zilien werden als läntiges Axonem gebildet, das aus Mikrotubuli besteht, deren Hauptbestandteil das -Tubulin ist. Das Axonem wächst aus dem Basalkörper, der aus dem Tubulin strukturiert ist. Die Länge der primären Zilien variiert zwischen 2–10 m; jedoch können sich seine Abmessungen während der Glykolation, des Hungers, der Hypoxie, des zytotoxischen ....

Protokoll

1. Zubereitung von Kulturmedien, Lösungen und Gerichten

1. Autoclave die Abdeckungen (22 x 22 mm). Bereiten Sie 6 Brunnenplatten vor. Fetales Rinderserum (FBS) und Antibiotikum Penicillin/Streptomycin auftauen und das Kulturmedium auf Raumtemperatur (RT) erwärmen. Trypsin-EDTA verwenden (0,25%) und 1x PBS (Phosphat gepufferte Saline mit Kalzium und Magnesium) um die Zellen zu durchführen.
2. Frisches 4% Paraformaldehyd (PFA) in dH₂O (800 mg PFA in 20 ml dH₂O) zubereiten. Die PFA muss für jedes Experiment frisch vorbereitet werden. Die Lösung bei 55 °C 30 min in der Haube umrühren und erhitzen. Abkühlen bei RT. 1 M Natriumhydroxid hi....

Ergebnisse

Die immunfluoreszierende Färbung der primären Zilien ist ein relativ einfaches Verfahren, das zu qualitativ hochwertigen Bildern führt. In diesen Experimenten wurden Fibroblasten, die primäre Zilien exdrücken, fixiert, immungefärbt und in einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop nach dem oben beschriebenen Protokoll abgebildet. Das primäre Cilium wurde mit Acetylat-Tubulin und -Tubulin nachgewiesen. Die Bewertung der primären Zilien kann auf verschiedenen Ebenen durchgeführt werden und jede Änderung in dieser Hin.......

Diskussion

Mehrere Autoren haben verschiedene Methoden für den Nachweis von primären Zilien beschrieben, manchmal auch verschiedene Fixierungsmethoden beschreiben, die ihre Erkennung beeinflussen können^6,20,21,22. Unabhängig davon ist es schwierig, ein vollständiges und einfaches Protokoll für die Erkennung zu finden. Die Verfügbarkeit einer solchen Methode wäre zweifellos eine große Hilfe für die Untersu.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-Well-Platte	TPP	92406	Abmessungen 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')? Fragment Ziege Anti-Kaninchen IgG
Anti-Tubulin & Gamma;	Sigma-Aldrich	T5192	Polyklonales Kaninchen Anti-Maus IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (Maus)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Maus IgG (ganzes Molekül) F(ab′)2 Fragmente– Cy3-Antikörper, hergestellt in Schafen
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco&akut; s Modifizierter Adler&akut; Thermo	Scientific	11960044	Hoher Glukosegehalt, kein Glutamin, Gibco
Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	D8662	mit MgCl2 und CaCl2, sterilfiltriert, Geeignet für Zellkulturen
Fötales Rinderserum	Thermo Scientific	16000044	sterilgefiltert, Gibco
L-Glutamin	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	embryonaler Fibroblast der Maus
Monoklonaler anti-acetylierter Tubulin-Antikörper	Sigma-Aldrich	T7451	Monoklonaler anti-acetylierter Tubulin-Antikörper, hergestellt in der Maus
NHLF	Lonza	CC-2512	Primäre Lungenfibroblasten (human)
Normales Ziegenserum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127-500G	Pulver
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10.000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin pro ml in 0,9 % NaCl, sterilfiltriert
ProLong Diamond Antifade Eindeckmittel	Thermo Scientific	P36961
Hautfibroblasten	Freundlicherweise geschenkt von der Karlsuniversität, Medizinische Fakultät in Hradec Krá Liebend&eakute;.
Quadratische Deckgläser	Thermo Scientific	22X22-1,5	Borosilikatglas, 22x22mm, quadratisch
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0,25%)	Thermo Scientific	25200072	sterilgefiltert, Gibco

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