Methodenartikel

Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

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DOI:

10.3791/61167

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10. Mai 2020

 ,  , 
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Präsentiert wird ein Protokoll zur Isolierung von humanen und tierischen ventrikulären Kardiomyozyten aus vibratomegeschnittenen Myokardscheiben. Hohe Erträge von kalziumtoleranten Zellen (bis zu 200 Zellen/mg) können aus kleinen Gewebemengen (<50 mg) gewonnen werden. Das Protokoll gilt für Myokard, das bis zu 36 h kalten Ischämien ausgesetzt ist.

Zusammenfassung

Die Isolierung ventrikulärer Herzmyozyten aus tierischen und menschlichen Herzen ist eine grundlegende Methode in der Herzforschung. Tierische Kardiomyozyten werden häufig durch koronare Perfusion mit Verdauungsenzymen isoliert. Die Isolierung menschlicher Kardiomyozyten ist jedoch eine Herausforderung, da menschliche Myokardproben in der Regel keine koronare Perfusion zulassen und alternative Isolationsprotokolle zu schlechten Erträgen lebensfähiger Zellen führen. Darüber hinaus sind humane Myokardproben selten und nur regelmäßig in Einrichtungen mit Herzchirurgie vor Ort verfügbar. Dies erschwert die Übersetzung von Befunden von tierischen in menschliche Kardiomyozyten. Hier wird ein zuverlässiges Protokoll beschrieben, das eine effiziente Isolierung ventrikulärer Myozyten von menschlichem und tierischem Myokard ermöglicht. Um das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zu erhöhen und gleichzeitig die Zellschädigung zu minimieren, werden aus Myokardproben mit einem Vibram eine Dicke von 300 m dicke Myokardscheiben erzeugt. Gewebescheiben werden dann mit Protease und Kollagenase verdaut. Rattenmyokard wurde verwendet, um das Protokoll zu bestimmen und die Erträge lebensfähiger, kalziumtoleranter Myozyten durch strömungszytometrische Zellzählung zu quantifizieren. Der Vergleich mit der häufig verwendeten Gewebe-Chunk-Methode zeigte signifikant höhere Erträge von stabförmigen Kardiomyozyten (41,5 x 11,9 vs. 7,89 x 3,6 %, p < 0,05). Das Protokoll wurde in versagendes und nicht versagendes menschliches Myokard übersetzt, wo die Erträge ähnlich waren wie bei Rattenmyokard und wiederum deutlich höher als bei der Gewebe-Chunk-Methode (45,0 x 15,0 vs. 6,87 x 5,23 Zellen/mg, p < 0,05). Insbesondere mit dem vorgelegten Protokoll ist es möglich, eine angemessene Anzahl lebensfähiger menschlicher Kardiomyozyten (9–200 Zellen/mg) aus minimalen Gewebemengen (<50 mg) zu isolieren. So ist die Methode auf gesundes und versagendes Myokard sowohl von menschlichen als auch tierischen Herzen anwendbar. Darüber hinaus ist es möglich, erregbare und kontraktile Myozyten aus menschlichen Gewebeproben zu isolieren, die bis zu 36 h in kalter kardioplegischer Lösung gelagert werden, was die Methode besonders nützlich für Laboratorien in Einrichtungen ohne Herzchirurgie vor Ort macht.

Einleitung

Eine wegweisende Technik, die den Weg zu wichtigen Einblicken in die Kardiomyozytenphysiologie geebnet hat, ist die Isolierung lebender ventrikulärer Kardiomyozyten von intakten Herzen1. Isolierte Kardiomyozyten können verwendet werden, um normale zelluläre Struktur und Funktion zu studieren, oder die Folgen von In-vivo-Experimenten; zum Beispiel, um Veränderungen in der zellulären Elektrophysiologie oder Anregungs-Kontraktionskopplung in Tiermodellen von Herzerkrankungen zu bewerten. Darüber hinaus können isolierte Kardiomyozyten für Zellkultur, pharmakologische Interventionen, Gentransfer, Tissue Engineering und viele andere Anwendungen verwendet werden. Effiziente Methoden zur Kardiomyozytenisolation sind daher von grundlegender Bedeutung für die Grundlagen- und Translational-Herzforschung.

Kardiomyozyten von kleinen Säugetieren, wie Nagetieren, und von größeren Säugetieren, wie Schweinen oder Hunden, werden häufig durch koronare Perfusion des Herzens mit Lösungen isoliert, die rohe Kollagenatonse und/oder Proteasen enthalten. Dies wurde als die "Goldstandard"-Methode für die Kardiomyozytenisolation beschrieben, was zu Erträgen von bis zu 70% der lebensfähigen Zellen2führt. Der Ansatz wurde auch mit menschlichen Herzen verwendet, was zu akzeptablen Kardiomyozytenerträgen3,4,5. Da jedoch eine koronare Perfusion nur möglich ist, wenn das intakte Herz oder ein großer Myokardkeil mit einem koronaren Herzzweig zur Verfügung steht, sind die meisten menschlichen Herzproben aufgrund ihrer geringen Größe und des Mangels an geeigneter Gefäße für diesen Ansatz nicht geeignet. Daher ist die Isolierung menschlicher Kardiomyozyten eine Herausforderung.

Menschliche Myokardproben bestehen meist aus Gewebestücken variabler Größe (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm bis 2 x 2 x 2 cm), die durch endomyocardiale Biopsien6, septale Myektomien7, VAD-Implantationen8oder aus explantierten Herzen9. Die häufigsten Verfahren für die Kardiomyozytenisolation beginnen mit dem Hacken des Gewebes mit einer Schere oder einem Skalpell. Zell-zu-Zell-Kontakte werden dann durch Eintauchen in kalziumfreie oder kalziumarme Puffer gestört. Es folgen mehrere Verdauungsschritte mit Rohenzymextrakten oder gereinigten Enzymen wie Proteasen (z.B. Trypsin), Kollagenase, Hyaluronidase oder Elastase, was zu einem Zerfall der extrazellulären Matrix und der Befreiung von Kardiomyozyten führt. In einem letzten, kritischen Schritt muss eine physiologische Kalziumkonzentration sorgfältig wiederhergestellt werden, oder zelluläre Schäden können aufgrund des Calcium-Paradoxons10,11,12auftreten. Dieser Isolationsansatz ist praktisch, aber in der Regel ineffizient. Eine Studie ergab beispielsweise, dass fast 1 g Myokardgewebe erforderlich waren, um eine ausreichende Anzahl von Kardiomyozyten zu erhalten, die für nachfolgende Experimente geeignet sind13. Ein möglicher Grund für niedrige Erträge ist die relativ harte Methode, das Gewebe zu hacken. Dies kann besonders kardiomyozyten an den Klodrändern beschädigen, obwohl diese Myozyten am ehesten durch enzymatische Verdauung freigesetzt werden.

Ein weiterer Aspekt, der die Isolationseffizienz und -qualität der aus menschlichen Proben gewonnenen Zellen beeinflussen kann, ist die Dauer der Gewebeischämie. Die meisten Protokolle nennen kurze Transportzeiten ins Labor als Voraussetzung für gute Ergebnisse. Dies beschränkt die Untersuchung von humanventrikulären Kardiomyozyten auf Laboratorien mit nahe gelegenen Herzchirurgie-Einrichtungen. Zusammen behindern diese Einschränkungen die Überprüfung wichtiger Erkenntnisse von Tiermodellen in menschlichen Kardiomyozyten. Verbesserte Isolationsprotokolle, die hohe Kardiomyozytenausbeuten aus kleinen Gewebemengen ermöglichen, vorzugsweise ohne schwerwiegende Schäden nach längeren Transportzeiten, sind daher wünschenswert.

Beschrieben wird hier ein Isolationsprotokoll, das auf der enzymatischen Verdauung dünner Myokardgewebescheiben basiert, die mit einem Vibratom14,15erzeugt werden. Wir zeigen, dass die Isolierung von Gewebescheiben viel effizienter ist als die von Gewebestücken, die mit einer Schere gehackt werden. Die beschriebene Methode ermöglicht nicht nur hohe Erträge lebensfähiger menschlicher Kardiomyozyten aus kleinen Mengen Myokardgewebe, sondern ist auch auf Proben anwendbar, die in kalter kardioplegischer Lösung bis zu 36 h gelagert oder transportiert werden.

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Protokoll

Alle Versuche mit Ratten wurden vom Tierschutz- und Einsatzausschuss Mittelfranken, Bayern, genehmigt. Die Entnahme und Verwendung menschlicher Herzgewebeproben wurde von den Institutionellen Fachkollegien der Universität Erlangen-Nürnberg und der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. Die Studien wurden gemäß den Richtlinien der Helsinki-Erklärung durchgeführt. Die Patienten gaben ihre schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage vor der Gewebeentnahme ab.

Weibliche Wistar-Ratten (150–200 g) wurden kommerziell erhalten, durch Injektion von 100 mg/kg Thiopental-Natrium intraperitoneal anentäbt und durch Zervixdislokation, gefolgt von Thorakotomie und Exzision des Herzens eingeschläfert. Menschliche Herzgewebeproben wurden aus dem linksventrikulären apikalen Kern während der Implantation mechanischer Hilfsvorrichtungen, aus der Septalmyektomie, aus der Tetralogie der Fallot-Korrekturchirurgie oder von der freien linksventrikulären Wand von explantierten Herzen entnommen. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung aus dem menschlichen ventrikulären Gewebe. Die Isolierung von Rattenkardiomyozyten wurde entsprechend durchgeführt, jedoch mit verschiedenen Enzymen (siehe Tabelle der Materialien). Ein schematischer Workflow des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Herstellung von Puffern, Lösungen und Enzymen

  1. Bereiten Sie Puffer und Lösungen vor, wie in Tabelle 1aufgeführt.
  2. Aufwärmlösungen 1, 2, 3 und die modifizierte Tyrodes Lösung auf 37 °C. Bewahren Sie die Schneidlösung bei 4 °C bis zum Gebrauch auf.
    HINWEIS: Für 1–2 Myokardscheiben werden insgesamt ca. 15 ml, 8 ml und 5 ml der Lösungen 1, 2 und 3 für die Isolierung in einer 35 mm Gewebekulturschale benötigt. Skalieren Sie entsprechend für gleichzeitige Myozytenisolationen in mehreren Gerichten. Schneidlösung kann eingefroren und bei -20 °C für mehrere Monate gehalten werden.
  3. Wiegen Sie 1 mg Proteinase XXIV (siehe Materialtabelle) in ein vorgechilltes 15 ml Zentrifugenrohr und lagern Sie es bis zur Verwendung auf Eis. Dies dient der Verarbeitung eines Beispiels. Skalieren Sie den Betrag entsprechend. Mischen Sie die Proteinase und Kollagenase nicht.
  4. Wiegen Sie 8 mg Kollagennase CLSI (siehe Materialtabelle)in ein vorgechilltes 15 ml Zentrifugenrohr und lagern Sie bis zur Verwendung auf Eis. Dies dient der Verarbeitung eines Beispiels. Skalieren Sie den Betrag entsprechend. Mischen Sie die Proteinase und Kollagenase nicht.
    VORSICHT: Tragen Sie eine Gesichtsmaske oder arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube, um das Einatmen von Enzympulver zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Enzymaktivität kann in verschiedenen Losen variieren. Daher kann die optimale Konzentration abweichen und sollte mit jedem neu erworbenen Enzym bestimmt werden16.

2. Lagerung und Transport von Myokardgewebe

  1. Menschliche Herzproben in gekühlter 4 °C Schneidlösung lagern und transportieren (Tabelle 1).
  2. Verwenden Sie die gleiche Lösung für die weitere Gewebeverarbeitung und Vibratome-Slicing.
    HINWEIS: Biopsien und chirurgische Herzproben sollten sofort bei 4 °C auf die Schneidlösung übertragen werden und können dann vor Anwendung dieses Protokolls bei 4 °C für maximal 36 h gelagert oder transportiert werden.

3. Verarbeitung und Schneiden des Gewebes

HINWEIS: Das Protokoll für das Schneiden von Gewebefolgt Fischer et al.15.

  1. Trimmen des Gewebeblocks
    VORSICHT: Menschliches Herzgewebe ist potenziell infektiös. Verwenden Sie immer Schutzkleidung und befolgen Sie die Sicherheitsvorschriften Ihrer Institution. Behandeln Sie gebrauchte Klingen sorgfältig und entsorgen Sie sie in Sicherheitsbehältern.
    1. Die Probe in eine 100 mm Gewebekulturschale geben, die mit 20 ml Kaltschnittlösung gefüllt ist, und auf einer gekühlten 4 °C-Platte aufbewahren.
    2. Entfernen Sie überschüssiges fibrotisches Gewebe und Epikardialfett mit einem Skalpell. Bei einer transmuraalen Probe Trabekulae und Gewebeschichten in der Nähe des Endokards entfernen.
      HINWEIS: Fibrotisches Gewebe ist steif und erscheint weiß. Fett ist in der Regel weich und erscheint weiß bis gelb. Trabeculae- und Endokardgewebeschichten lassen sich anhand ihrer lockeren Gewebezusammensetzung und einer bündnisfreien Faserausrichtung im Vergleich zu Myokard der Epikardenschichten identifizieren
    3. Für eine optimale Vibrambearbeitung rechteckige Gewebeblöcke von ca. 8 mm x 8 mm x 8 mm mit einem Skalpell aus einer größeren Gewebeprobe schneiden. Für kleinere Biopsien überspringen Sie diesen Schritt und bewegen Sie sich zur Agarose-Einbettung.
  2. Einbettung von Herzgewebe in Niedrigschmelzpunkt-Agarose
    1. 400 mg Niedrigschmelzpunkt-Agarose in 10 ml Schneidlösung in einem Glasbecher kochen.
      VORSICHT: Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrillen, um Verbrennungen zu vermeiden. Behandeln Sie heißeglaswaren geräte nur mit Wärmeschutzverschleiß.
    2. Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit dem heißen, gelösten Agarosegel. Versiegeln Sie die Spritze und lassen Sie die Agarose in einem 37 °C-Wasserbad für mindestens 15 min ausbaquiern.
    3. Verwenden Sie Zangen, um die getrimmte Herzprobe oder Biopsie in eine saubere 35 mm Gewebekulturschale mit dem Nachteilen des Epikardiens zu legen und überschüssige Flüssigkeit mit einem sterilen Tupfer zu entfernen.
    4. Gießen Sie die ausgeglichene Agarose (Schritt 3.2.2) über das Gewebe, indem Sie die Spritze entleeren. Sichern Sie das Gewebe gegen Bewegung mit Zange, während Sie die Agarose gießen. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig in Agarose eingetaucht ist.
    5. Die Schale sofort auf Eis legen und die Agarose 10 min erstarren lassen.
  3. Schneiden des Myokards
    1. Montieren Sie eine neue Rasierklinge am Klingenhalter des Vibratom und kalibrieren Sie das Vibratom, indem Sie die Z-Ablenkung der Klinge nach Möglichkeit einstellen.
      HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet ein Vibratom mit einem infrarotunterstützten Kalibriergerät, um das Blatt in einer horizontalen Position mit minimaler Z-Ablenkung auszurichten (gemessene Durchbiegung <0,1 m).
    2. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Agarose-Gewebeblock zu verbrauchen, der auf den Probenhalter des Vibratom passt. Um die Stabilität zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass das Gewebe noch ausreichend in Agarose (Agarose-Ränder von 8 mm) getaucht ist.
    3. Befestigen Sie den Agaroseblock mit einer dünnen Schicht Cyanoacrylatkleber und sanftem Druck am Probenhalter.
    4. Legen Sie den Probenhalter mit dem Gewebe in das Vibrambad. Füllen Sie das Bad mit Schneidlösung und halten Sie bei 4–6 °C während der gesamten Verarbeitung mit zerkleinertem Eis, in den äußeren Kühltank des Vibrames gefüllt.
    5. Erzeugen Sie 300 m dicke Scheiben mit einer Vorgeschwindigkeit von 0,1 mm/s, einer Oszillationsfrequenz von 80 Hz, einer seitlichen Amplitude von 1,5 mm und einem Klingenwinkel von 15°. Halten Sie beim Umgang mit den Scheiben die Agarose anstelle des Gewebes selbst, um Gewebeschäden zu vermeiden. Bewahren Sie die Scheiben in der Schneidlösung bei 4 °C bei Bedarf maximal 2 h auf.
      HINWEIS: Kardiomyozyten sind parallel zum Epikardium ausgerichtet. Daher ist es wichtig, parallel zum Epikardi um übermäßigen Myozytenschaden zu schneiden. Es wird empfohlen, die ersten 1–3 Scheiben zu verwerfen, da für die Isolierung nur einheitliche Scheiben mit konstanter Dicke verwendet werden sollten. Bei kleinen Gewebebiopsien jedoch nur die erste Scheibe wegwerfen.
    6. Überprüfen Sie die Cardiomyozytenausrichtung unter einem Standard-Lichtmikroskop mit einer Vergrößerung von 40-100x.

4. Gewebeverdauung

  1. Die Wärmeplatte auf den Laborschüttler legen und auf 37 °C erwärmen. Starten Sie den Labor-Shaker bei 65 Rpm.
  2. Die Proteinase (in Schritt 1.3) in 2 ml Lösung 1 (Schritt 1.1 und 1.2) auflösen und bei 37 °C bis zur Verwendung inkubieren. Mischen Sie die Proteinase und Kollagenase nicht.
  3. Die Kollagenase (in Schritt 1.4) in 2 ml Lösung 1 (Schritt 1.1 und 1.2) auflösen und bei 37 °C bis zur Verwendung inkubieren. Mischen Sie die Proteinase und Kollagenase nicht.
    VORSICHT: Tragen Sie Schutzbrillen und Handschuhe, da gelöste Enzyme Haut- und Augenverletzungen verursachen können.
  4. Calciumchlorid (CaCl2) der kollagennasehaltigen Lösung (in Schritt 4.3) zu einer Endkonzentration von 5 m hinzufügen.
  5. Verwenden Sie Zangen, um eine Gewebescheibe aus dem Vibram-Bad in eine saubere 60-mm-Gewebekulturschale zu übertragen, die mit 5 ml vorgekühlter Schneidlösung (Schritt 1.1 und 1.2) gefüllt ist, und auf Eis zu bleiben.
  6. Entfernen Sie die Agarose vorsichtig mit Klinge oder Zange aus dem Myokardgewebe.
    HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßige Spannung und Scherbelastung der Myokardscheiben, da sie die Kardiomyozyten beschädigen können.
  7. Um die erste Wäsche durchzuführen, legen Sie eine saubere 35 mm Gewebekulturschale auf die Wärmeplatte und füllen Sie sie mit 2 ml vorgewärmter (37 °C) Lösung 1. 1:2 Myokardscheiben mit Zange auf die vorbereitete Schale übertragen. Aspirieren Sie die Lösung mit einer 1 ml Pipette und führen Sie die Waschschritte 2x durch, um Reste der Schneidlösung zu entfernen.
    HINWEIS: Die Herzscheiben nicht ansaugen. Die Lösungen und die Scheiben sollten auf der rührigen Wärmeplatte bei einer konstanten Temperatur von 35 °C bleiben. Stellen Sie bei Bedarf die Temperatur der Wärmeplatte ein.
  8. Lösung 1 aus der Schale nehmen und 2 ml der Proteinase-Lösung hinzufügen (Schritt 4.2). 12 min auf der Wärmeplatte bei 65 R/min inkubieren.
  9. 2x mit 2 ml vorgewärmter Lösung 1 (37 °C) waschen.
  10. Lösung 1 aus der Schale nehmen und 2 ml Kollagenaselösung hinzufügen (Schritte 4.3 und 4.4). Mindestens 30 min auf der Wärmeplatte bei 65 Umdrehungen pro Minute inkubieren.
  11. Prüfen Sie nach kostenlosen individuellen Myozyten bei 30, 35, 40 min usw., indem Sie die Schale unter ein Lichtmikroskop stellen. Arbeiten Sie schnell, um eine signifikante Kühlung der Lösung zu vermeiden.
    HINWEIS: Die erforderliche Verdauungszeit kann je nach Gewebekonstitution und Dem Grad der Fibrose variieren. Sobald das Gewebe beim sanftgezogenen sanftgezogen enden wird und sich leicht löst, ist die optimale Verdauungszeit erreicht. Wenn genügend Gewebe zur Verfügung steht, können mehrere Scheiben parallel zu unterschiedlichen Verdauungszeiten verdaut werden.
  12. Wenn das Gewebe verdaut wird und einzelne Myozyten sichtbar sind (Schritt 4.11), 2x mit 2 ml vorgewärmter Lösung 2 (37 °C) waschen und mit 2 ml wieder füllen.

5. Gewebedissoziation

  1. Dissoziieren Sie die verdauten Gewebescheiben mit Zangen, indem Sie die Fasern vorsichtig auseinander ziehen.
  2. Sorgfältige Pipette mehrmals mit einer Einweg-Pasteur-Pipette (Öffnungsdurchmesser >2 mm).
    HINWEIS: Der Einsatz von Zangen und Pipetten kann mechanische Beanspruchung verursachen und Kardiomyozytenschäden verursachen. Es ist jedoch ein entscheidender Schritt für die Trennung der Zellen. Verwenden Sie feine Zangen, um Zellschäden zu minimieren und die Scheiben sorgfältig zu kleineren Stücken zu trennen.
  3. Prüfen Sie die befreiten stabförmigen Kardiomyozyten unter dem Lichtmikroskop.

6. Wiedereinführung der physiologischen Kalziumkonzentration

  1. Erhöhen Sie langsam die Kalziumkonzentration von 5 m auf 1,5 mM, während Sie bei 35 °C auf der Wärmeplatte aufregen. Verwenden Sie 10 mM und 100 mM CaCl2 Stofflösungen. Empfohlene Schritte: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 m. Lassen Sie die Zellen sich in 5 min Inkubationsintervallen zwischen jedem Schritt an die erhöhten Kalziumspiegel anpassen.
  2. Entfernen Sie unverdaute Gewebestücke vorsichtig mit Zangen oder filtern Sie die Zellsuspension durch ein Nylongewebe mit 180 m Porengröße am Ende der Kalziumzunahme.

7. Entfernung des mechanischen Entkopplungsmittels

  1. Stoppen Sie die Rührung und entfernen Sie langsam ein Drittel der Lösung (ca. 700 l) von der Oberseite mit einer 1.000 l Pipette. Vermeiden Sie das Streben der Kardiomyozyten.
    HINWEIS: Wenn unverdautes Gewebe entfernt wurde, sammeln sich die Kardiomyozyten in der Mitte der Schale an, was das Absehnen einer zellfreien Lösung erleichtert. Wenn nicht, übertragen Sie die Zelllösung in ein 15 ml Zentrifugenrohr und lassen Sie die Zellen 10 min bei 35 °C sedimentieren, dann 700 l des Überstandes aspirieren und entsorgen, die Zellen wieder aussetzen, in eine 35 mm Gewebekulturschale zurückübertragen und mit Schritt 7.2 fortfahren.
  2. Fügen Sie 700 l Lösung 3 in die Zellen, setzen Sie die Agitation auf der Wärmeplatte fort und brüten sie 10 min.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 und 7.2.
  4. Übertragen Sie die Lösung auf ein 15 ml Zentrifugenrohr und lassen Sie die Kardiomyozyten für mindestens 10 min und maximal 30 min bei Raumtemperatur sedimentieren oder bei 50 x g für 1 min drehen. Entfernen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie ihn in modifizierter Tyrodes Lösung oder dem gewünschten Experimentierpuffer wieder auf.
    HINWEIS: Cardiomyozyten können in modifizierter Tyrodes Lösung (Tabelle 1) mehrere Stunden bei 37 °C und 5%CO2 vor Gebrauch gelagert werden.
  5. Überprüfen Sie die Zellqualität mit einem Standard-Lichtmikroskop mit 40- und 200-facher Vergrößerung.
    HINWEIS: Etwa 30–50% der Kardiomyozyten sollten stabförmig, glatt ohne Membranbs sein und klare Querstreifen aufweisen. Nur 5–10% der lebensfähigen Zellen sollten spontane Kontraktionen zeigen.

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Ergebnisse

Um die Isolationseffizienz zu überprüfen, wurde das Protokoll mit Rattenmyokard verwendet und die resultierende Anzahl lebensfähiger Myozyten wurde mit den Zahlen verglichen, die durch Isolierung durch koronare Perfusion und durch Isolierung von kleinen Gewebestücken (Chunk-Isolation, Abbildung 2). Chunk Isolation und Isolierung von Gewebescheiben wurden von den gleichen Herzen durchgeführt. Für die Isolierung durch koronare Perfusion wurde jedoch das ganze Herz verwendet. Die koronare Perfu...

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Diskussion

Obwohl die Isolation lebender Kardiomyozyten vor mehr als 40 Jahren etabliert wurde und immer noch eine Voraussetzung für viele experimentelle Ansätze in der Herzforschung ist, bleibt sie eine schwierige Technik mit unvorhersehbaren Ergebnissen. Die Kardiomyozytenisolation durch Perfusion der Herzkranzgefäße mit Enzymlösung wird häufig für Herzen von Kleintieren verwendet und liefert eine große Anzahl lebensfähiger Zellen. Dies erfordert jedoch ein relativ komplexes System und Fachwissen. Darüber hinaus sind die meisten ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Andreas Dendorfer vom Walter-Brendel-Zentrum für Experimentelle Medizin, LMU München, für die Hilfe beim Schneideprotokoll. Für die Bereitstellung menschlicher Myokardgewebeproben danken wir Ghazali Minabari und Christian Heim von der Klinik für Herzchirurgie, Universitätsklinikum Erlangen, Hendrik Milting vom Erich & Hanna Klessmann Institut, Ruhr-Universität Bochum und Muhannad Alkassar von der Klinik für Kinderkardiologie, Universitätsklinikum Erlangen. Für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie danken wir Simon Völkl und Kollegen vom Translational Research Center (TRC), Universitätsklinikum Erlangen. Wir danken auch Lorenz McCargo und Celine Grüninger vom Institut für Zell- und Molekularphysiologie Erlangen für die hervorragende technische Unterstützung.

Unterstützt wurde diese Arbeit vom DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung), vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) am Universitätsklinikum der Universität Erlangen-Nürnberg und dem Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemicals
2,3-butandionmonoximCarl Roth3494.1Reinheit>99%
RinderserumalbuminCarl Roth163.2
CaCl2Carl Roth5239.2
KreatinmonohydratAlfa AesarB250009
GlucoseMerck50-99-7
HEPESCarl Roth9105.3
KClCarl RothP017.1
KH2PO4Carl Roth3904.2
L-GlutaminsäureFluka Biochemica49450
Agarose mit niedrigem SchmelzpunktCarl Roth6351.5
MgCl2 x 6H2OCarl RothA537.1
MgSO4Sigma AldrichM-7506
NaClCarl Roth9265.1
NaHCO3Carl Roth8551.2
ParaformaldehydSigma AldrichP6148
TaurinSigma AldrichT8691
Dyes
Di-8-ANEPPSThermo FisherScientific D3167
Fluo-4 AMThermo Fisher ScientificF14201
FluoVoltThermo Fisher ScientificF10488
Enzyme
Kollagenase CLS Typ IWorthingtonLS004196Wird für menschliches Gewebe in einer Dosis von 4 mg/ml
verwendet (Aktivität: 280 U/mg)
Kollagenase CLS Typ IIWorthingtonLS004176Wird für Rattengewebe in einer Dosis von 1,5 mg/ml
(Aktivität 330 U/mg) verwendetProtease
XIVSigma AldrichP8038Wird für Rattengewebe in einer Dosis von 0,5 mg/ml
(Aktivität ≥ 3,5 U/mg) verwendetProteinase
XXIVSigma AldrichP5147Zur Verwendung für menschliches Gewebe bei 0,5 mg/ml
(Aktivität: 7-14 U/mg)
Material
Cell Analyzer (LSR Fortessa)BD Bioscience649225
Zentrifugenröhrchen, 15 mLCorning430790
Zentrifugenröhrchen, 50 mLCorning430829
Compact ShakerEdmund Bü hlerKS-15 B SteuerungRührrichtung: horizontal
Einweg-Pasteur-Pipetten aus KunststoffCarl RothEA65.1Für die Zellverreibung werden nur Pipetten mit einem Innenspitzendurchmesser ≥ 2 mm
PinzetteFST11271-30
HeatblockVWRBARN88880030
Nylon Netzfilter, 180 & micro; mMerckNY8H04700
TC Dish 100, StandardSarstedt83.3902
TC Dish 35, StandardSarstedt83.3900
TC Dish 60, StandardSarstedt83.3901
Vibratome (VT1200S)Leica1491200S001Inklusive VibroCheck zur infrarotgestützten Korrektur der z-Auslenkung

Referenzen

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