Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatisering van bio-atoomkrachtmicroscoopmetingen op honderden C. albicans-cellen

Published: April 2, 2021 doi: 10.3791/61315
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 4, 3,5, 2
1ITAV-CNRS, Université de Toulouse, CNRS, Toulouse, France, 2LAAS-CNRS, Université de Toulouse, CNRS, Toulouse, France, 3ENCB, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Mexico City, Mexico, 4TBI, Université de Toulouse, CNRS, INRA, INSA, Toulouse, France, 5CIC, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Mexico City, Mexico
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol heeft als doel afm-metingen op honderden microbiële cellen te automatiseren. Eerst worden microben geïmmobiliseerd in PDMS-stempelmicrostructuren en vervolgens worden krachtspectroscopiemetingen automatisch uitgevoerd op honderden geïmmobiliseerde cellen.

Abstract

De in dit artikel gepresenteerde methode is gericht op het automatiseren van Bio-AFM experimenten en het registreren van krachtcurves. Met deze methode is het mogelijk om krachtencurven op 1000 cellen automatisch in 4 uur vast te leggen. Om een analysetijd van 4 uur te behouden, wordt het aantal krachtcurven per cel teruggebracht tot 9 of 16. De methode combineert een op Jython gebaseerd programma en een strategie voor het assembleren van cellen op gedefinieerde patronen. Het programma, geïmplementeerd op een commerciële Bio-AFM, kan de tip centreren op de eerste cel van de array en vervolgens automatisch van cel naar cel bewegen terwijl krachtcurves op elke cel worden opgenomen. Met behulp van deze methodologie is het mogelijk om toegang te krijgen tot de biofysische parameters van de cellen, zoals hun stijfheid, hun kleefeigenschappen, enz. Met de automatisering en het grote aantal geanalyseerde cellen heeft men toegang tot het gedrag van de celpopulatie. Dit is een doorbraak op het gebied van Bio-AFM, waar tot nu toe slechts enkele tientallen cellen gegevens zijn geregistreerd.

Introduction

Dit werk biedt een methodiek om met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM) automatische krachtmetingen uit te voeren op honderden levende cellen. Het biedt ook een methode om microben te immobiliseren op een PDMS-microgestructureerde stempel die compatibel is met AFM-experimenten die in een vloeibare omgeving worden uitgevoerd.

Bio-AFM is een zeer gespecialiseerde technologie die is ontworpen voor toepassingen in de biologie en vervolgens wordt gebruikt om levende cellen te bestuderen. Het vereist een getrainde ingenieur die één cel tegelijk kan analyseren. In deze omstandigheden is het aantal verschillende cellen dat kan worden geanalyseerd vrij klein, typisch 5 tot 10 cellen in 4-5 uur. De hoeveelheid krachtmetingen die op een enkele cel zijn geregistreerd, is echter meestal erg hoog en kan gemakkelijk 1000 bereiken. Het huidige paradigma van AFM-krachtmetingen op levende cellen is dus het registreren van honderden krachtcurven (FCs) maar op een beperkt aantal cellen.

Statistisch gezien is deze benadering twijfelachtig en roept de kwestie van de representativiteit van de steekproef op. Het is bijvoorbeeld moeilijk om de heterogeniteit van een celpopulatie te evalueren door slechts een paar cellen te meten, zelfs als er honderden metingen op deze paar cellen worden geregistreerd. Het is echter op basis van dit paradigma dat er grote vooruitgang is geboekt op het gebied van biofysica, microbiologie en nanogeneeskunde1,2,3. Inderdaad, nanometeranalyse op de schaal van enkele cellen heeft nieuwe informatie opgeleverd over cellulaire nanomechanica, over de organisatie van transmembrane-eiwitten of het werkingsmechanisme van antimicrobiële of antikankergeneesmiddelen4,5,6,7. Onlangs zijn echter verschillende biomechanische tests met hoge doorvoer op cellen naar voren gekomen8, waaruit blijkt dat de wetenschappelijke gemeenschap geïnteresseerd is in het veranderen van dit paradigma en toegang tot de heterogeniteit van de celpopulatie. Deze tests zijn allemaal gebaseerd op microfluïdische systemen om cellen te vervormen en optisch hun vervorming onder spanning te meten om een indirecte meting van hun totale oppervlakteelasticiteit te verkrijgen8. Een belangrijk probleem met deze methoden is echter dat ze monoparametrisch zijn: alleen celelasticiteit kan worden onderzocht. Bovendien staan ze het meten van de mechanische parameters van aanhangende cellen niet toe, wat beperkend kan zijn voor de studies van niet-circulerende zoogdiercellen of biofilms bijvoorbeeld.

Door de teams van S. Scheuring9 en M. Favre10zijn benaderingen met afm ontwikkeld. Scheuring et al. geïmmobiliseerde cellen op fibronectinepatronen9, waardoor individuele cellen de vorm van het patroon moesten aannemen9. Vervolgens bracht dit team de mechanische eigenschappen van een paar cellen in kaart om gemiddelde gegevens te definiëren, representatief voor 14 tot 18 cellen. De door Farve c.s. uitgevoerde ontwikkeling was gericht op het multiplexen van de metingen door parallel te lopen met de AFM-vrijdragende10. Voor zover wij weten heeft dit werk in de multiplexing richting niet geleid tot metingen op levende cellen.

Een interessante aanpak voorgesteld door het team van Dujardin presenteert een geautomatiseerde AFM die cellen kan identificeren en in beeld kan brengen aan de onderkant van op maat gemaakte putten. Hoewel deze methode geen analyse van een grote populatie cellen mogelijk maakt, maakt het het mogelijk om automatisch verschillende omstandigheden in elke put te testen11.

Ons doel in dit werk is ambitieuzer, omdat we ten minste 1000 cellen wilden meten om toegang te krijgen tot geen gemiddelde cel, maar integendeel de heterogeniteit tussen cellen. De strategie die we hier hebben ontwikkeld om toegang te krijgen tot celpopulatie heterogeniteit met behulp van AFM is gebaseerd op de analyse van honderden cellen waarop een beperkt aantal krachtcurves wordt geregistreerd. In vergelijking met de "klassieke" benadering van het registreren van een groot aantal krachtcurven op een beperkt aantal cellen, moet deze benadering als complementair worden beschouwd, aangezien deze niet dezelfde informatie verschaft. Inderdaad, hoewel de typische methode het mogelijk maakt om individuele celoppervlak heterogeniteit te onderzoeken, met behulp van onze aanpak, zijn we in staat om toegang te krijgen tot de volledige celpopulatie heterogeniteit. Om dit doel te bereiken, hebben we een methode gecombineerd die microben (hier de gistsoort Candida albicans) direct immobiliseert in de putten van een PDMS microgestructureerde stempel12, en ontwikkelt een origineel programma voor het automatisch verplaatsen van de AFM-tip van cel naar cel13 en het meten van de mechanische eigenschappen van elke cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Microbiële celkweek

  1. Cellen uit een glycerolvoorraad revivificeren.
    OPMERKING: C. albicans worden bij -80 °C opgeslagen in glycerolvoorraden, op knikkers.
    1. Pluk een marmer in de bouillon van -80 °C en wrijf het op gist pepton dextrose (YPD) agar. Kweek de cellen gedurende 2 dagen bij 30 °C, vóór vloeibare teelt.
  2. Bereid vloeibare culturen voor.
    1. Vul een kweekbuis met 5 ml steriele YPD-bouillon en voeg een enkele kolonie C. albicans-cellen toe, gekweekt op de YPD-agarplaat.
    2. Kweek de kweek in statische omstandigheden gedurende 20 uur op 30 °C voordat u ze oogst met centrifugeren (4000 x g, 5 min). Gooi het supernatant weg en elimineer het als biogevaarlijk afval.
    3. Was de pellets 2x met 10 ml acetaatbuffer (8 mM natriumacetaat, 1 mM CaCl2,1 mM MnCl2, pH 5,2). Centrifugeer (4000 x g, 5 min) tussen het wassen door.
    4. Resuspendeer de pellet in 2 ml acetaatbuffer en gebruik deze oplossing voor celimmobilisatie op de PDMS-stempel.
      OPMERKING: Deze suspensie kan niet worden opgeslagen en moet vers worden bereid voor sectie 3.

2. PDMS-stempelvoorbereiding

  1. Silicium master schimmel voorbereiding
    1. Teken de gewenste microstructuren met behulp van CAD-software (Computer Assisted Design).
      OPMERKING: De ontworpen putten moeten even groot zijn als de microbe om te vangen. Het ontwerp moet een grote matrix van putten 100 x 100 op lijst bieden. Het is het beste om verschillende arrays te maken met enigszins verschillende maten rond de gemiddelde grootte van de microbe.
    2. Als er een schone kamer beschikbaar is, volgt u de stappen 2 tot en met 12 van het eerder gepubliceerde protocol12. Anders kan silicium master schimmel worden verkregen van commerciële cleanroom faciliteiten.
  2. PDMS stempellijsten
    1. Bereid 55 g PDMS-prepolymeeroplossing met een mengsel van 10 tot 1, massaverhouding, PDMS-oligomeren en uithardingsmiddel (Tabel van materialen).
    2. Meng en ontgas deze oplossing onder vacuüm (in het bereik van 10-1-10-2 bar) totdat alle gevangen bellen uit de PDMS-oplossing zijn verwijderd (5−10 min).
    3. Giet 20 g van de ontgaste oplossing opnieuw op de siliconen mastervorm en ontgassing (in het bereik van 10-1-10-2 bar).
      OPMERKING: De stempeldikte moet ongeveer 2−3 mm zijn.
    4. Wanneer alle bellen zijn verwijderd, moet u het PDMS gedurende 1 uur op 80 °C aansnonderen.
    5. Snijd de PDMS microgestructureerde stempel met een scalpel (0,5 x 1,5 cm2) in een richting parallel aan de zichtbare microstructuurarrays.
    6. Schil de stempel van de siliconen master schimmel.
    7. Breng de stempel terug om de microstructuren aan de bovenkant tentoon te stellen en deponeer deze op een glazen glijbaan. Zorg ervoor dat de microstructuren naar boven gericht zijn, weg van de glazen glijbaan. Lijn de microstructuren die op de stempel te zien zijn uit met de zijkant van de glazen glijbaan, die later als referentie zal dienen voor de automatiseringsprocedure van de AFM.
      OPMERKING: In dit stadium is de PDMS-stempel klaar voor celimmobilisatie. De PDMS-stempels kunnen enkele maanden op de siliconen mastervorm worden bewaard. Wanneer alle PDMS uit de master mal wordt verwijderd, kan een nieuwe PDMS stempel opnieuw op de master mold worden gegoten (om de master mold veilig te houden, is het mogelijk om deze te repliceren in polyurethaan)14.

3. Monstervoorbereiding

  1. Celimmobilisatie
    1. Centrifugeer (500 x g, 5 min) 600 μL van de geresuspendeerde celoplossing om de buffer van de cellen te scheiden.
    2. Pipet 200 μL van het supernatant vanaf stap 3.1.1 op de PDMS-stempel en ontgas onder vacuüm (in het bereik van 10-1-10-2 bar) gedurende ongeveer 40 minuten.
      OPMERKING: Deze stap is belangrijk om de celimmobilisatie in de putten te verbeteren. Moleculen uit de gistcelwand, aanwezig in het supernatant, worden waarschijnlijk afgezet op het PDMS-oppervlak tijdens deze pre-bevochtigingsstap. Deze moleculen verbeteren hoogstwaarschijnlijk de hechting van de cellen en dragen bij aan de toename van de vulsnelheid van de stempel.
    3. Verwijder na 40 minuten, met een pipet, de buffer van het PDMS-oppervlak en deponeer met een pipet 200 μL van de celoplossing vanaf stap 1.2.4 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Plaats de cellen in de microstructuren van de stempel door convectieve/capillaire assemblage. Verdeel daarvoor handmatig 200 μL celsuspensie over de stempel met behulp van een glazen schuif in beide richtingen met een hoek tussen 30 en 50°. Het kan nodig zijn om de glazen schuif meerdere keren op de stempel door te geven om een hoge vulsnelheid te bereiken.
      OPMERKING: Een volledige beschrijving van deze methode is beschikbaar13.
    5. Verwijder de celsuspensie met een pipet. Was de stempel 3x met 1 ml acetaatbuffer, pH 5,2 om de cellen te verwijderen die niet vastzaten.
    6. Droog de achterkant van de stempel met behulp van stikstofstroom, om ervoor te zorgen dat de stempel zich aan de droge petrischaal hecht.
    7. Deponeer ten slotte de PDMS-stempel gevuld met cellen in een petrischaal (tabel met materialen) en vul deze met 2 ml acetaatbuffer om de cellen in vloeibaar medium te houden.
  2. De stempel drukken op het AFM-podium
    1. Centreer het podium om 0:0 bij het starten van AFM-operaties.
    2. Kalibreer de gevoeligheid en veerconstante van de cantilever op glas en in water zoals beschreven in Unsay et al.15
    3. Neem de Petrischaal met de stempel en plaats deze in de AFM Petrischaalhouder.
    4. Lijn de stempelrand loodrecht op de petrischaalhouder Y-as uit.
      OPMERKING: Een aanvaardbare kantelhoek is minder dan 5° zoals afgebeeld in figuur 1.
    5. Plaats de AFM-kop op het podium en zorg ervoor dat de stappenmotoren voldoende zijn uitgeschoven om te voorkomen dat de punt op de stempel crasht.

4. Uitvoeren van het AFM-programma

LET OP: Het AFM-programma wordt aangeboden als Aanvullend Materiaal (AutomatipSoftware2019.pdf). Het vereist een JPK-Bruker AFM Nanowizard II of III uitgerust met een gemotoriseerd podium en JPK desktop software versie 4.3. Het programma is ontwikkeld onder Jython (versie gebaseerd op python 2.7)

  1. Gegevensverwerving
    1. Centreer de AFM-tip boven op de linkerhoek van de 4,5 x 4,5 μm2 putten (overeenkomend met de celgrootte) met behulp van de optische microscoop van de AFM. Als een andere putgrootte nodig is, centreer dan in de linkerbovenhoek van de gewenste putten.
    2. Voer een 64 x 64 krachtkaart uit (Z-bereik = 4 μm, tipsnelheid = 90 μm·s-1, toegepaste kracht 3 tot 5 nN) over een oppervlakte van 100 x 100 μm². Selecteer De modus Geforceerd toewijzen in het vervolgkeuzevak Meetmodus. Voer in het force control mapping panel de volgende parameters in: Rel. Setpoint = 3 tot 5 nN; z lengte 4 μm; Z-beweging: constante duur; verleng de tijd: 0.01s; ext. vertraging:0; Retr-vertraging: 0, vertragingsmodus: constante kracht, samplefrequentie 2048 Hz; Z gesloten lus uitvinken; Raster: check Vierkant beeld, Snel 100 μm, langzaam: 100μm, X offset: 0 μm; Y offset: 0 μm; rasterhoek: 0 graden; Pixels: 64x64; pixelverhouding: 1:1
      OPMERKING: Een typisch resultaat wordt weergegeven in figuur 2. Deze afbeelding helpt bij het meten en verifiëren van de toonhoogte tussen twee putten.
    3. Let op de coördinaten van het midden van de put linksboven (W1) en van de put linksonder (zie W2 op figuur 2). Maak hiervoor een vierkante doos rond de put. De coördinaat van het midden van de doos verschijnt op het linkerpaneel van de AFM-software in x,y coördinatenvakken.
    4. Om de automatiseringssoftware te openen (Automatip_scan.py): klik in de JPK-desktopsoftware op vooruit in het bovenste balkmenu en selecteer open het script. Selecteer in het venster dat wordt geopend het pad naar het scriptbestand in Aanvullende gegevens (Automatip_scan.py).
    5. Implementeer W1- en W2-coördinatenwaarden in de sectie Invoervak van hetJython-script( figuur3). Voer de W1-coördinaten in de variabele P1-regel 239 van het script en de W2-coördinaten in de variabele P2-regel 241 in. 
      OPMERKING: De putten die als begincoördinaten (W1 en W2) zijn geselecteerd, mogen niet te dicht bij de rand van het scangebied liggen. Anders zou het centreeralgoritme niet correct worden uitgevoerd omdat het de hoogte op het PDMS-oppervlak aan elke kant van de put moet meten. Zie bijvoorbeeld figuur 4.
    6. Wijs de toonhoogtewaarde toe aan de toonhoogtevariabele regel 245 van het script.
    7. Voer de putdimensie in de variabele Ws-regel 248 in. Dit is bekend van het ontwerp van de putpatronen en kan worden gecontroleerd op dezelfde afbeelding als die wordt gebruikt om de toonhoogte te verifiëren (figuur 2).
    8. Schrijf het pad naar de opslagmap in regel 251 om de gegevens op de gewenste plaats op te slaan.
    9. Stel de totaleArea variabele lijn 254 in op het wensmultieve veelvoud "n" van 100 μm (dat is het maximale scangebied van de gebruikte AFM). Het totale aantal putten dat zal worden onderzocht, kan worden berekend met behulp van deze waarde en de toonhoogte: maximaal scangebied/toonhoogte*n2.
      OPMERKING: In het voorbeeld van figuur 3worden 9 gebieden van 100 x 100μm 2 geanalyseerd.
    10. Stel de krachtcurvematrix, rij en kolom (3, 3 of 4, 4) in, die per put worden geregistreerd in de variabele lijn 257 van numScans.
      OPMERKING: In het voorbeeld van figuur 3wordt voor elke put een matrix van 3 x 3 = 9 FCs geregistreerd.
    11. Voer het programma uit. Klik op de startknop.
      OPMERKING: Het programma voert eerst automatisch een centreeralgoritme uit om het centrum van W1- en W2-putten beter te bepalen (stap 1). Vervolgens wordt automatisch de Force Curves (FCs) matrix op elke put van het eerste scangebied (stap 2) ver verkrijgt. Wanneer alle putten van dat gebied worden onderzocht, verplaatst het script automatisch de AFM-tip naar de eerste put van het volgende scangebied. De punt wordt ingetrokken, de microscoopfase verplaatst zich naar het volgende gebied, de punt wordt opnieuw benaderd op de stempel en het centreeralgoritme wordt opnieuw uitgevoerd om automatisch opnieuw te centreren op de eerste put (1') van dat gebied (stap 3). Het eerste gebied wordt gedefinieerd door de gebruiker, het tweede, bevindt zich aan de rechterkant enz. totdat n is bereikt. n+1 gebied is onder n, n+2 aan de linkerkant van n+1, etc. tot 2n is bereikt. 2n+1 bevindt zich onder 2n, en 2n+2 bevindt zich aan de rechterkant op 2n, enz. Wereldwijd kronkelt de punt door het totale gebied. Stap 2 en 3 worden automatisch herhaald totdat het totale aantal "n2" scangebieden is onderzocht. Figuur 5 geeft het stroomschema van het programma aan. Het duurt ~ 4 uur om het programma te voltooien.
  2. Gegevensanalyse
    1. Voer het python-script "Bestanden kopiëren" uit (Copy_files_L.py, geleverd in aanvullende gegevens) om de FCs-bestanden in één map te ordenen. Dit script is ontwikkeld met Python 2.7 en de SciPy module. Gebruik Visual Studio Code-software om het python-script te openen. Invoerpad naar de algemene map (regel 67 van het script in aanvullende gegevens) en waar het wordt opgeslagen (regel 73).
    2. Open de AFM-software voor gegevensverwerking om de krachtcurven te analyseren. Selecteer in het bovenste menu Bestanddeoptie 'batch spectroscopiecurven openen'.
    3. Selecteer in het batchverwerkingsvenster het proces dat wordt geleverd in Aanvullende gegevens (StiffnessProcess.jpk-proc-force). Selecteer de laatste stap van het proces en klik op Keep and Apply to All. Alle krachtcurves krijgen dezelfde behandeling.
      OPMERKING: Het proces gebruikt de kalibratie van de FCs-bestanden om de afbuigcurven om te zetten in krachtcurven gekalibreerd in Newton; een data smoothing algoritme wordt toegepast (gemiddelde van 3 opeenvolgende punten); de basislijn wordt vertaald naar rust op de nulas; het contactpunt wordt geëxtrapoleerd en de FC wordt gecompenseerd om het contactpunt op coördinaat te plaatsen (0,0); het buigen van de cantilever wordt afgetrokken naar de FCs, de retract slope wordt gemonteerd. Aan het einde van de databehandeling genereert de software een bestand met een tabel die voor elke FCs geeft: de naam, Young Modulus, contactpunt, hechtingskracht, hellingen, enz.
    4. Herhaal de stappen 4.2.1 tot en met 4.2.3 voor alle experimenten. Wees voorzichtig met het opslaan van de gegevens in verschillende mappen (d.w.z.: "...\TREATED\" en "...\UNTREATED\")
    5. Gebruik het R-script in Aanvullende gegevens om histogrammen en boxplots te plotten en ANOVA-statistische behandelingen uit te voeren.
      1. Als u het R-script (DataAnalisys.R) wilt openen, gebruikt u R-studiosoftware en laadt u de bestanden met de informatie die is geëxtraheerd met de gegevensverwerkingssoftware (.tsv).
      2. Gebruik in het omgevingsvenster de knop Gegevensset importeren, selecteer in de weergegeven lijst de optie selecteren uit tekst (readr) en selecteer in het nieuwe venster de knop Browser en zoek het bestand .tsv.
      3. Zodra het bestand is geladen, selecteert u de kolommen (stijfheid en hechting) die voor de analyse moeten worden opgenomen. Druk op Ctrl+Alt+Rom alle code uit te voeren.
        OPMERKING: Het script werkt met 4 datasets, overweeg twee experimenten met zowel onbehandelde als behandelde cellen. Het is mogelijk om blokken van het script uit te voeren en te zien hoe de variabelen veranderen afhankelijk van de uitgevoerde functies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We gebruikten het beschreven protocol om het effect van caspofungine op de biofysische eigenschappen van de opportunistische menselijke ziekteverwekker C. albicans in zijn gistvorm te analyseren. Caspofungine is een laatste kans antischimmel molecuul gebruikt wanneer andere geneesmiddelen zijn niet effectief vanwege de weerstandsmechanismen cellen ontwikkelen zich in de richting van antischimmelmiddelen. Het werkingsmechanisme is gebaseerd op de remming van de subeenheid Fks2 van het complex fks1/Fks2 die verantwoordelijk is voor de ß glucan-synthese. Aangezien ß glucanen een belangrijk onderdeel zijn van de schimmelcelwand16,17, verwachtten we wijziging van de biofysische eigenschappen van de celwand: stijfheid en hechting.

Figuur 6 toont typische histogrammen die worden verkregen wanneer al het bovenstaande protocol wordt toegepast. Het rode histogram vertegenwoordigt de stijfheidsherpartitie geregistreerd op 957 inheemse cellen en de blauwe op 574 caspofungine behandelde cellen. De eerste interessante observatie is dat beide histogrammen een bimodale verdeling van de waarden aantonen. Deze observatie is alleen mogelijk omdat we honderden cellen hebben gemeten. Op kleinere monsters observeren onderzoekers meestal een enkele verdeling en missen ze de populatie heterogeniteit. 17,18 jaar

De tweede opmerking betreft het effect van caspofungine. Het vermindert wereldwijd de stijfheid van de cellen terwijl er nog steeds twee subpopulaties bestaan. In een laatste stap biedt het voorgestelde protocol een ANOVA-vergelijking van de inheemse en behandelde cellen zoals weergegeven in figuur 7. Het toont aan dat de twee aandoeningen een verschillende stijfheid hebben en dat dit verschil zeer significant is (p-waarde < 0,001). Deze waarde wordt bereikt dankzij het grote aantal geanalyseerde cellen en geeft een groter vertrouwen in de verkregen resultaten.

De hechting is ook geëxtraheerd uit de automatisch geregistreerde gegevens en we ontdekten dat de hechtingskracht tussen de kale punt en inheemse cellen 0,64 ± 0,6 nN was. In dit geval werden ook twee subpopulaties gevonden: de eerste heeft een gemiddelde hechtkracht van 0,7 ± 1,4 nN, terwijl de tweede van 4,5 ± 1,5 nN. De behandeling met caspofungine had onvoorspelbare effecten op de hechting. In het ene experiment werd geen effect waargenomen, maar in een ander experiment veroorzaakte caspofungine een afname van de hechting aan de punt en een vermindering van de populatieadhesie heterogeniteit. Deze resultaten zijn ontleend aan Proa et al.13, waar ze in totaliteit worden gepresenteerd.

Figure 1
Figuur 1: Acceptabele positie van de microgestructureerde stempel op het AFM-podium.
De kantelhoek op de linkerfoto's (tot 5°) kan door het programma worden afgehandeld, maar de kanteling aan de rechterkant is belangrijk (10°). Dit cijfer is gewijzigd van13. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Typische AFM-afbeelding van een gevulde PDMS-stempel met de begincoördinaten als W1 en W2, de grootte van het scangebied (Δ2),de kantelhoek (θ).
Dit cijfer is gewijzigd van13. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Gebruikersinvoersectie van het script.
P1 en P2 verwijst naar de coördinaten van put 1 (W1) en put 2 (W2) van figuur 2. De andere parameters zijn de toonhoogte in μm, de putgrootte in μm (Ws), het directorypad voor het opslaan van de gegevens, het totale vierkante gebied dat door de geautomatiseerde AFM zal worden onderzocht (totalArea is de lengte in μm van de zijkant van het totale vierkante gebied) en het aantal krachtcurven per put (numScans). Alle units zijn in μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Optische afbeelding die een voorbeeld geeft van waardevolle (groene stippen) initiële putten.
Het zwarte vierkant vertegenwoordigt het scangebied en de rode vlekken, initiële putten die beter kunnen worden weggegooid. Dit cijfer is gewijzigd van13. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Programmastroomdiagram met de 5 stappen die de AFM automatisch uitvoert. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Histogrammen van de mediane stijfheidswaarden.
(A, B) De mediane resultaten per cel weergeven voor native en caspofungin behandelde cel. Dit cijfer is gewijzigd van13. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Boxplots waarin native en behandeld met caspofunginecellen worden vergeleken.
De 3 sterren vertegenwoordigen een betekenis van p<0.001. Het vak vertegenwoordigt 90% van de resultaten, de centrale lijn is de mediaanwaarde en de verticale balken vertegenwoordigen het bereik van alle gegevens. Dit cijfer is gewijzigd van13. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Afhankelijkheid van waarden van tijdspositie.
Histogrammen in het midden zijn de oorspronkelijke gegevens die zijn onderverdeeld in de verschillende subgroepen die overeenkomen met de opgerichte subpopulaties (blauw/geel). (A,B) Toon de aanwezigheid van de twee subpopulaties op elk uur in het experiment. (C,D) de inspringingsposities weergeven; op elke positie is het mogelijk om de aanwezigheid van de subpopulaties (blauw/geel) te zien. Subgroeporganisatie werd gedaan met behulp van het k-means-algoritme. Dit cijfer is gewijzigd van13. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Het veilige gebied.
Een gebied, binnen de PDMS-put, is gedefinieerd als het gebied waar de piramidale punt de putrand niet raakt terwijl de putbodem wordt bereikt (in het geval van een lege put). Dit cijfer is gewijzigd van13. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende gegevens. Klik hier om deze bestanden te bekijken. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De belangrijkste verbetering van deze methodologie is een significante toename van het aantal gemeten cellen in een bepaalde hoeveelheid tijd. De tegenwaarde is een vermindering van het aantal gemeten punten per cel. Het betekent dat deze methode niet is ontworpen om een gedetailleerde analyse van een enkele cel te bieden. De methode is alleen van toepassing op cellen die in de putten van de PDMS-stempel passen. De stempel is vrij veelzijdig, terwijl het putten van 1,5 x 1,5 μm2 tot 6 x 6 μm2bevat. Toch is het onmogelijk om bacillus of veel grotere cellen te immobiliseren. De stempel en capillaire convectieve afzetting kunnen niet worden gebruikt om zoogdiercellen te immobiliseren die veel groter zijn (ongeveer 100 μm lang).

In deze context ontwikkelden Peric et al.19 een slim microfluïdisch apparaat om bacillus zoals Escherichia coli en bacillus subtilis te immobiliseren. Dit apparaat maakt het mogelijk om bacillus te immobiliseren op gedefinieerde posities en onder fysiologische omstandigheden. Het zou erg interessant zijn om de software aan te passen aan de specifieke grootte van dit apparaat.

Tipbesmetting kan ook een probleem zijn in dit geautomatiseerde systeem. In het geval van microbiële cellen komt het niet zo vaak voor, maar het is van groot belang in het geval van zoogdiercellen. Dujardin et al.11 hebben dit probleem aangepakt door een reinigingsstap toe te voegen aan hun geautomatiseerde protocol. Deze stap bestaat uit het controleren van de lasersom en het activeren van de reinigingsprocedure als de som te laag is. De schone stap bestaat uit het onderdompelen van de punt in een put gevuld met water of ethanol.

Een vraag die systematisch voortkomt uit dit automatiseringswerk is: "komt de heterogeniteit voort uit de evolutie van de cellen tijdens het experiment?". Om deze vraag te beantwoorden, hebben we de stijfheidsresultaten uitgezet als functie van de tijd zoals weergegeven in figuur 8A, B. Het toont duidelijk aan dat heterogene stijfheidswaarden op elk moment tijdens het experiment worden geregistreerd.

In dezelfde context kwam de kwestie van de tippositie tijdens de maatregel naar voren. Het zou mogelijk zijn dat krachtcurven die aan de rand van een cel zijn geregistreerd, een andere stijfheid hebben dan FC die op de bovenkant van de cellen is geregistreerd. Om dit ongemak te voorkomen, hebben we gedefinieerd wat we het veilige gebied noemden. Het is afgebeeld in figuur 9A, B en vertegenwoordigt een gebied in de putten waar de punt de putranden niet raakt tijdens krachtmeting. Met behulp van dit "veilige gebied" konden we FC alleen opnemen op cellen en bovenaan. Zoals weergegeven in figuur 8C,D is de tippositie in het veilige gebied niet verantwoordelijk voor de heterogeniteit van de resultaten, omdat we beide fenotypen voor elke positie van de tip in het veilige gebied hebben gevonden.

Om ervoor te zorgen dat de waarden die op elke positie zijn geregistreerd homogeen zijn, hebben we de stijfheidswaarden uitgezet als functie van de positie zoals weergegeven in figuur 9C,D. Het toont aan dat heterogene stijfheidswaarden worden geregistreerd op elke positie in de put, wat betekent dat de waargenomen heterogeniteit geen artefact is vanwege de tippositie in de putten.

Het in dit artikel gepresenteerde protocol vertegenwoordigt een conceptuele en methodologische doorbraak op het gebied van AFM toegepast in de life science. De grote hoeveelheden gegenereerde gegevens zijn compatibel met automatische analyse, waardoor celpopulaties ongetwijfeld volgens nieuwe criteria kunnen worden ingedeeld. De toepassing van dit protocol op eiwit- of suikerarrays is volledig haalbaar en vereist slechts enkele aanpassingen om rekening te houden met de afstand tussen de aandachtsgebieden.

Het is dan ook een veelzijdig protocol dat het resultaat is van een sterke interdisciplinaire samenwerking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

We willen FONCYCYT van CONACYT (Mexico), het ministerie van Buitenlandse Zaken van Frankrijk en de Université Paris 13 erkennen, hoewel de financiële steun van het internationale samenwerkingsproject ECOS-NORD genaamd Nano-palpation for diagnosis, nr. 263337 (Mexico) en MI5P02 (Frankrijk). AMR wil de financiële steun van SIP-IPN via het project No. 20195489 bedanken. SPC wordt ondersteund door een PhD fellowship van CONACYT (No. 288029) en IPN via de cotutelle overeenkomst om een dubbel PhD certificaat (IPN-UPS) te behalen. ED en CFD zijn onderzoekers van Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM cantilever Bruker AFM probes MLCT The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m
AFM data analysis JPK-Bruker JPK Data processing version minimum 5.1.8 Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount
AFM Petri dishes WPI FluoroDish FD35-100 The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Atomic force Microscope (AFM) JPK-Bruker Nanowizard II or III the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage
Caspofungin Sigma-Aldrich SML0425-5MG Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)
Code editor Microsoft Visual Studio Code version 1.40.1 https://code.visualstudio.com/
Cryobeads IFU CB12
Dessicator/Degassing chamber Fisherbrand 15594635 The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.
Petri dish heater JPK-Bruker PetriDishHeater This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Sodium acetate buffer pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899 The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months
Statistical analysis language https://www.r-project.org R version 3.6.1 R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment
Statistical analysis software https://rstudio.com R studio version 1.1.463 collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics
Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761028 Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set
Yeast Peptone D Broth Difco 242820
YPD Agar Difco DF0427-17-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  2. Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
  3. Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
  4. Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
  5. Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
  6. Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
  7. Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
  8. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  9. Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
  10. Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
  11. Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
  12. Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
  13. Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
  14. Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
  15. Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
  16. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  17. Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
  18. El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
  19. Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).

Tags

Deze maand in JoVE atomic force microscopy C. albicans automation cell nanomechanics mechanobiology force curve analysis cell adhesion AFM automation Jython JPK experiment planner
Automatisering van bio-atoomkrachtmicroscoopmetingen op honderden <em>C. albicans-cellen</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Severac, C., Proa-Coronado, S.,… More

Severac, C., Proa-Coronado, S., Formosa-Dague, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells. J. Vis. Exp. (170), e61315, doi:10.3791/61315 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter