Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى أتمتة قياسات AFM على مئات الخلايا الميكروبية. أولا، يتم شل حركة الميكروبات في الهياكل المجهرية لختم PDMS ومن ثم يتم إجراء قياسات التحليل الطيفي بالقوة تلقائيا على مئات الخلايا المشلودة.
Abstract
تهدف الطريقة المعروضة في هذه الورقة إلى أتمتة تجارب Bio-AFM وتسجيل منحنيات القوة. باستخدام هذه الطريقة، فمن الممكن لتسجيل المنحنيات القوات على 1000 خلية في 4 ساعات تلقائيا. للحفاظ على وقت تحليل 4 ساعات، يتم تقليل عدد منحنيات القوة لكل خلية إلى 9 أو 16. الأسلوب يجمع بين برنامج Jython القائم على واستراتيجية لتجميع الخلايا على أنماط محددة. البرنامج، الذي تم تنفيذه على بيو-AFM التجارية، يمكن أن مركز تلميح على الخلية الأولى من الصفيف ومن ثم التحرك، تلقائيا، من خلية إلى خلية أثناء تسجيل منحنيات القوة على كل خلية. باستخدام هذه المنهجية ، من الممكن الوصول إلى المعلمات الفيزيائية الحيوية للخلايا مثل صلابتها ، وخصائصها اللاصقة ، وما إلى ذلك. مع التشغيل الآلي وعدد كبير من الخلايا تحليلها، يمكن للمرء الوصول إلى سلوك السكان الخلية. وهذا إنجاز كبير في مجال بيو-أ إف إم حيث تم تسجيل البيانات، حتى الآن، على بضع عشرات فقط من الخلايا.
Introduction
يوفر هذا العمل منهجية لإجراء قياسات القوة التلقائية على مئات الخلايا الحية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). كما يوفر طريقة لشل حركة الميكروبات على طابع PDMS المجهري المتوافق مع تجارب AFM التي أجريت في بيئة سائلة.
Bio-AFM هي تقنية متخصصة للغاية تم تصميمها للتطبيقات في علم الأحياء ثم تستخدم لدراسة الخلايا الحية. يتطلب مهندسا مدربا يمكنه تحليل خلية واحدة في ذلك الوقت. في هذه الظروف، يكون عدد الخلايا المختلفة التي يمكن تحليلها صغيرا نوعا ما، نموذجيا من 5 إلى 10 خلايا في 4-5 ساعات. ومع ذلك، فإن كمية قياسات القوة المسجلة على خلية واحدة عادة ما تكون عالية جدا ويمكن أن تصل بسهولة إلى 1000. وبالتالي ، فإن النموذج الحالي لقياسات قوة AFM على الخلايا الحية هو تسجيل مئات منحنيات القوة (FCs) ولكن على عدد محدود من الخلايا.
ومن الناحية الإحصائية، فإن هذا النهج مشكوك فيه ويثير مسألة تمثيل العينة. في الواقع، من الصعب، على سبيل المثال، تقييم عدم التجانس بين مجموعة الخلايا من خلال قياس عدد قليل من الخلايا فقط، حتى لو تم تسجيل مئات القياسات على هذه الخلايا القليلة. ومع ذلك ، على أساس هذا النموذج الذي تم إحراز تقدم كبير في الفيزياء الحيوية وعلم الأحياء المجهرية والطب النانوي1و2و3. في الواقع ، قدم تحليل نانومتر على نطاق خلايا واحدة معلومات جديدة عن الميكانيكا النانوية الخلوية ، على تنظيم البروتينات عبر الميمبران ، أو آلية عمل الأدوية المضادة للميكروبات أو مضادات الميكروبات4،5،6،7. ولكن في الآونة الأخيرة، ظهرت العديد من الاختبارات الميكانيكية الحيوية عالية الإنتاجية التي أجريت على الخلايا8،مما يدل على اهتمام المجتمع العلمي في تغيير هذا النموذج والوصول إلى عدم التجانس السكاني الخلية. تعتمد جميع هذه الاختبارات على أنظمة microfluidic لتشوه الخلايا وقياس تشوهها بصريا تحت الضغط للحصول على مقياس غير مباشر لمرونتها السطحية الإجمالية8. ومع ذلك ، فإن مشكلة مهمة مع هذه الأساليب هي أنها أحادية البارامترية: يمكن فحص مرونة الخلية فقط. وعلاوة على ذلك، فإنها لا تسمح بقياس المعلمات الميكانيكية للخلايا الملتصقة، والتي يمكن أن تحد من دراسات خلايا الثدييات غير الدورانية أو الأغشية الحيوية على سبيل المثال.
وقد تم تطوير النهج التي تنطوي على AFM من قبل فرق S. Scheuring9 و M. Favre10. Scheuring وآخرون الخلايا المشلولة على أنماط فيبروكتين9, إجبار الخلايا الفردية على اتخاذ شكل نمط9. ثم قام هذا الفريق بتعيين الخصائص الميكانيكية لعدد قليل من الخلايا لتحديد متوسط البيانات ، ممثل 14 إلى 18 خلية. ويهدف التطوير الذي قام به Farve وآخرون إلى مضاعفة القياسات من خلال التوازي مع AFM cantilevers10. على حد علمنا، هذا العمل في الاتجاه المتعدد لم يؤد إلى قياسات على الخلايا الحية.
يقدم النهج المثير للاهتمام الذي اقترحه فريق دوجاردين AFM آليا قادرا على تحديد الخلايا وتصويرها في الجزء السفلي من الآبار المصنوعة خصيصا. على الرغم من أن هذه الطريقة لا تسمح لتحليل عدد كبير من الخلايا، فإنه يسمح للاختبار التلقائي لظروف مختلفة في كل بئر11.
هدفنا في هذا العمل هو أكثر طموحا لأننا أردنا قياس ما لا يقل عن 1000 خلية للوصول ليس إلى خلية متوسطة ، ولكن ، على العكس من ذلك ، عدم التجانس بين الخلايا. تستند الاستراتيجية التي وضعناها هنا للوصول إلى عدم تجانس سكان الخلايا باستخدام AFM إلى تحليل مئات الخلايا التي يتم تسجيل عدد محدود من منحنيات القوة عليها. وبالمقارنة مع النهج "التقليدي" المتمثل في تسجيل عدد كبير من منحنيات القوة على عدد محدود من الخلايا، ينبغي اعتبار هذا النهج مكملا لأنه لا يقدم نفس المعلومات. في الواقع ، في حين أن الطريقة النموذجية تسمح للمرء بالتحقيق في عدم التجانس سطح الخلية الفردية ، وذلك باستخدام نهجنا ، ونحن قادرون على الوصول إلى عدم التجانس مجموع سكان الخلية. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بدمج طريقة تعمل مباشرة على شل حركة الميكروبات (هنا أنواع الخميرة المبيضات البيض)في آبار الطابع المجهريPDMS 12، وتطور برنامجا أصليا لنقل طرف AFM ، تلقائيا ، من الخلية إلى الخلية13 وقياس الخصائص الميكانيكية لكل خلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة الخلايا الميكروبية
- إحياء الخلايا من مخزون الجلسرين.
ملاحظة: يتم تخزين C. albicans في -80 درجة مئوية في مخزونات الجلسرين، على الرخام.- اختيار الرخام في الأوراق المالية -80 درجة مئوية وفرك على الخميرة بيبتون dextrose (YPD) أجار. تنمو الخلايا لمدة 2 أيام في 30 درجة مئوية، قبل زراعة السائل.
- إعداد الثقافات السائلة.
- ملء أنبوب الثقافة مع 5 مل من مرق YPD العقيم وإضافة مستعمرة واحدة من خلايا ألبيكان C. ، نمت على لوحة أجار YPD.
- تنمية الثقافة في ظروف ثابتة عند 30 درجة مئوية لمدة 20 ساعة قبل الحصاد عن طريق الطرد المركزي (4000 × ز، 5 دقائق). تجاهل supernatant والقضاء على النفايات الخطرة بيولوجيا.
- غسل الكريات 2x مع 10 مل من العازلة خلات (خلات الصوديوم 8 mM, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 5.2). جهاز الطرد المركزي (4000 × ز، 5 دقائق) بين الغسيل.
- Resuspend بيليه في 2 مل من العازلة خلات واستخدام هذا الحل لشل حركة الخلية على ختم PDMS.
ملاحظة: لا يمكن تخزين هذا التعليق وينبغي إعداده طازجا للقسم 3.
2. إعداد طابع PDMS
- إعداد قالب السيليكون الرئيسي
- رسم الهياكل المجهرية المطلوبة باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD).
ملاحظة: يجب أن تكون الآبار المصممة ذات حجم مماثل للميكروب الذي يجب اعتراضه. وينبغي أن يوفر التصميم مصفوفة كبيرة من الآبار 100 × 100 في القائمة. فمن الأفضل لجعل صفائف عدة مع أحجام مختلفة قليلا حول متوسط حجم الميكروب. - إذا كانت هناك غرفة نظيفة متوفرة، اتبع الخطوات من 2 إلى 12 من البروتوكول المنشور سابقا12. خلاف ذلك، يمكن الحصول على قالب السيليكون الرئيسي من مرافق غرفة نظيفة التجارية.
- رسم الهياكل المجهرية المطلوبة باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD).
- صب ختم PDMS
- إعداد 55 غرام من محلول PREPOLYMER PDMS تحتوي على خليط من 10 إلى 1، نسبة الكتلة، من أوليغومرات PDMS وعامل المعالجة(جدول المواد).
- مزيج وdgas هذا الحل تحت فراغ (في نطاق 10-1 -10-2 القضبان) حتى تتم إزالة جميع الفقاعات المحاصرين من الحل PDMS (5-10 دقيقة).
- صب 20 غرام من محلول degassed على قالب السيليكون الرئيسي وdgas مرة أخرى (في نطاق 10-1 -10-2 القضبان).
ملاحظة: يجب أن يكون سمك الطابع حوالي 2-3 مم. - عند إزالة جميع الفقاعات، إعادة صياغة PDMS عند 80 درجة مئوية خلال 1 ساعة.
- اقطع الطابع المجهري PDMS بمشرط (0.5 × 1.5 سم2)في اتجاه مواز للصفائف المجهرية المرئية.
- قشر الطابع من قالب السيليكون الرئيسي.
- أعد الطابع لعرض الهياكل المجهرية على جانبه العلوي وإيداعه على شريحة زجاجية. تأكد من أن يكون microstructures تواجه بعيدا عن الشريحة الزجاجية. قم بمحاذاة الهياكل المجهرية التي يمكن رؤيتها على الطابع مع جانب الشريحة الزجاجية ، والتي ستكون لاحقا مرجعا لإجراء أتمتة AFM.
ملاحظة: في هذه المرحلة، الطابع PDMS جاهزة لشل حركة الخلية. يمكن تخزين طوابع PDMS على قالب السيليكون الرئيسي لعدة أشهر. عندما تتم إزالة جميع PDMS من القالب الرئيسي، يمكن إلقاء طابع PDMS جديد مرة أخرى على القالب الرئيسي (للحفاظ على العفن الرئيسي آمنة، فمن الممكن لتكرار ذلك في البولي يوريثين)14.
3. إعداد العينة
- تجميد الخلايا
- جهاز الطرد المركزي (500 × ز، 5 دقائق) 600 ميكرولتر من محلول الخلية الذي أعيد إنفاقه لفصل العازل عن الخلايا.
- Pipet 200 μL من supernatant من الخطوة 3.1.1 على طابع PDMS ، وdgas تحت فراغ (في حدود 10-1 -10-2 القضبان) لمدة 40 دقيقة.
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتحسين تجميد الخلية داخل الآبار. جزيئات من جدار الخلية الخميرة، موجودة في supernatant، وربما تودع على سطح PDMS خلال هذه الخطوة قبل التبول. هذه الجزيئات، على الأرجح، تعزيز التصاق الخلايا والمساهمة في زيادة في معدل ملء الطابع. - بعد 40 دقيقة، مع ماصة، وإزالة العازلة من سطح PDMS وإيداع، مع ماصة، 200 ميكرولتر من محلول الخلية من الخطوة 1.2.4 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ضع الخلايا في الهياكل المجهرية للطابع عن طريق التجميع الحراري / الشعري. لذلك، نشر يدويا 200 ميكرولتر من تعليق الخلايا عبر الطابع باستخدام شريحة زجاجية في كلا الاتجاهين مع زاوية بين 30 و 50 درجة. قد يكون من الضروري تمرير الشريحة الزجاجية عدة مرات على الطابع لتحقيق معدل تعبئة مرتفع.
ملاحظة: وصف كامل من هذا الأسلوب هو متوفر13. - إزالة تعليق الخلية مع ماصة. غسل ختم 3x مع 1 مل من العازلة خلات، الأس الحموضة 5.2 لإزالة الخلايا التي لم تكن محاصرة.
- جفف الجزء الخلفي من الطابع باستخدام تدفق النيتروجين ، من أجل ضمان التزام الطابع بطبق بيتري الجاف.
- أخيرا إيداع ختم PDMS مليئة الخلايا في طبق بيتري(جدول المواد)وملئه مع 2 مل من العازلة خلات للحفاظ على الخلايا في المتوسط السائل.
- وضع الطابع على مرحلة AFM
- مركز المرحلة في 0:0 عند بدء عمليات AFM.
- معايرة حساسية ونبع ثابت من cantilever على الزجاج والماء على النحو المبين في Unsay etal.
- خذ طبق بيتري مع الطابع ووضعه في حامل طبق AFM Petri.
- محاذاة حافة الطابع عموديا على محور Y حامل طبق بيتري.
ملاحظة: زاوية إمالة مقبولة أقل من 5° كما هو موضح في الشكل 1. - ضع رأس AFM على المسرح وكن حذرا من أن محركات السائر ممتدة بما يكفي لتجنب الطرف لتحطم على الطابع.
4. تشغيل برنامج AFM
ملاحظة: يتم توفير برنامج AFM كمادة تكميلية (AutomatipSoftware2019.pdf). فإنه يتطلب JPK-بروكر AFM Nanowizard الثاني أو الثالث مجهزة مرحلة الآلية وJK نسخة برنامج سطح المكتب 4.3. وقد تم تطوير البرنامج تحت Jython (نسخة على أساس بيثون 2.7)
- الحصول على البيانات
- مركز تلميح AFM على رأس الزاوية اليسرى من 4.5 × 4.5 ميكرومتر2 الآبار (المقابلة لحجم الخلية) باستخدام المجهر البصري AFM. إذا كان هناك حاجة إلى حجم بئر آخر ، مركز على الزاوية اليسرى العليا من الآبار المطلوبة.
- تنفيذ خريطة قوة 64 × 64 (نطاق Z = 4 ميكرومتر، سرعة تلميح = 90 ميكرومتر · ق-1،القوة التطبيقية 3 إلى 5 نانو ن) على مساحة 100 × 100 ميكرومتر مربع. حدد وضع تعيين القوة من المربع المنسدل وضع القياس. في لوحة تعيين التحكم القوة إدخال المعلمات التالية: Rel. Setpoint = 3 إلى 5 nN; z طول 4 ميكرومتر; حركة Z: مدة ثابتة؛ تمديد الوقت: 0.01s; ext. تأخير:0; تأخير الروتر: 0، وضع التأخير: القوة الثابتة، معدل العينة 2048 هرتز؛ Z حلقة مغلقة إلغاء تحديد; الشبكة: تحقق من الصورة المربعة، بسرعة 100 ميكرومتر، بطيئة: 100 ميكرومتر، X إزاحة: 0 ميكرومتر؛ إزاحة Y: 0 ميكرومتر؛ زاوية الشبكة: 0 درجة؛ بكسل: 64x64; نسبة البكسل: 1:1
ملاحظة: تظهر نتيجة نموذجية في الشكل 2. ستساعد هذه الصورة في قياس الملعب والتحقق منه بين بئرين. - لاحظ إحداثيات وسط البئر الأيسر العلوي (W1) وأسفل اليسار جيدا (يشار إليها باسم W2 في الشكل 2). للقيام بذلك، وجعل مربع مربع حول البئر. يظهر تنسيق وسط المربع على اللوحة اليسرى لبرنامج AFM في مربعات إحداثيات x,y.
- لفتح برنامج التشغيل الآلي(Automatip_scan.py):في برنامج سطح المكتب JPK انقر مسبقا في القائمة شريط أعلى وحدد فتح البرنامج النصي. في الإطار الذي يفتح حدد المسار نحو ملف البرنامج النصي المتوفر في البيانات التكميلية (Automatip_scan.py).
- تنفيذ W1 و W2 تنسيق القيم في المقطع مربع المدخلات من البرنامج النصي Jython (الشكل 3). إدخال إحداثيات W1 في سطر المتغير P1 239 من البرنامج النصي وإحداثيات W2 في سطر المتغير P2 241.
ملاحظة: يجب ألا تكون الآبار المحددة كإحداثيات أولية (W1 و W2) قريبة جدا من حافة منطقة المسح الضوئي. وإلا فإن خوارزمية توسيط لا تنفذ بشكل صحيح لأنه يحتاج إلى قياس الارتفاع على سطح PDMS على كل جانب من البئر. للحصول على مثال، راجع الشكل 4. - سم قيمة الملعب إلى خط متغير الملعب 245 من البرنامج النصي.
- إدخال بعد البئر في سطر متغير Ws 248. وهذا معروف من تصميم أنماط البئر ويمكن التحقق من نفس الصورة التي تستخدم للتحقق من الملعب(الشكل 2).
- اكتب المسار إلى دليل الحفظ في السطر 251 لحفظ البيانات في المكان المطلوب.
- تعيين totalArea متغير خط 254 إلى الرغبةمتعددة" ن " من 100 ميكرومتر (وهذا هو الحد الأقصى لمسح منطقة AFM المستخدمة). يمكن حساب العدد الإجمالي للالآبار التي سيتم فحصها باستخدام هذه القيمة والملعب: أقصى منطقة مسح / الملعب *ن2.
ملاحظة: في مثال الشكل 3، سيتم تحليل 9 مناطق من 100 × 100 ميكرومتر2. - تعيين مصفوفة منحنيات القوة، صف وعمود (3، 3 أو 4، 4)، سجلت في بئر في خط متغير numScans 257.
ملاحظة: في المثال من الشكل 3، سيتم تسجيل مصفوفة من 3 × 3 = 9 FCs لكل بئر. - تشغيل البرنامج. انقر على زر البدء.
ملاحظة: ينفذ البرنامج أولا خوارزمية توسيط لتحديد مركز W1 و W2 بشكل أفضل (الخطوة 1). ثم يكتسب تلقائيا مصفوفة منحنيات القوة (FCs) على كل بئر من منطقة المسح الضوئي الأولى (الخطوة 2). عندما يتم فحص جميع آبار تلك المنطقة ، يقوم البرنامج النصي تلقائيا بنقل تلميح AFM إلى البئر الأول من منطقة المسح التالية. يتم سحب الطرف ، وينتقل مرحلة المجهر إلى المنطقة التالية ، ويتم الاقتراب من الطرف مرة أخرى على الطابع ويتم تنفيذ خوارزمية توسيط مرة أخرى لإعادة المركز تلقائيا على البئر الأول (1') من تلك المنطقة (الخطوة 3). يتم تعريف المنطقة الأولى من قبل المستخدم، والثانية، على اليمين وما إلى ذلك حتى يتم الوصول إلى n. ن + 1 المنطقة تحت ن ، ن + 2 على يسار ن + 1 ، وما إلى ذلك حتى يتم التوصل إلى 2N. 2n +1 تحت 2n ، و 2n +2 على اليمين على 2n ، الخ. على الصعيد العالمي، الثعبان تلميح من خلال المساحة الإجمالية. الخطوة 2 و 3 تتكرر تلقائيا حتى العدد الإجمالي "ن2" من مناطق المسح الضوئي قد تم بحثها. الشكل 5 يعرض المخطط الانسيابي للبرنامج. يستغرق ~ 4 ساعة لإكمال البرنامج.
- تحليل البيانات
- تنفيذ "نسخ الملفات" بيثون النصي (Copy_files_L.py، المقدمة في البيانات التكميلية) لتنظيم ملفات FCs في مجلد واحد. تم تطوير هذا السيناريو مع بيثون 2.7 ووحدة SciPy. استخدام برنامج Visual Studio Code لفتح البرنامج النصي python. مسار الإدخال إلى المجلد العام (السطر 67 من البرنامج النصي المقدم في بيانات تكميلية) ومكان تخزينه (السطر 73).
- افتح برنامج معالجة البيانات المصنعة ل AFM لتحليل منحنيات القوة. في القائمة العلوية ملف، حدد فتح 'دفعة من منحنيات التحليل الطيفي.
- في إطار معالجة الدفعة، حدد العملية المتوفرة في البيانات التكميلية (StiffnessProcess.jpk-proc-force). حدد الخطوة الأخيرة من العملية وانقر على الاحتفاظ بها وتطبيقها على الجميع. ستتلقى جميع منحنيات القوة نفس المعاملة.
ملاحظة: تستخدم العملية المعايرة من ملفات FCs لتحويل منحنيات الانحراف إلى منحنيات قوة معايرة في نيوتن؛ يتم تطبيق خوارزمية تنعيم البيانات (متوسط 3 نقاط متتالية)؛ تتم ترجمة الأساس للراحة على محور الصفر؛ يتم استقراء نقطة الاتصال ويتم تعويض FC لوضع نقطة الاتصال في التنسيق (0,0)؛ يتم طرح الانحناء من cantilever إلى FCs، يتم تركيب المنحدر التراجع. في نهاية معالجة البيانات ، يقوم البرنامج بإنشاء ملف يحتوي على جدول يعطي لكل FCs: اسمه ، Young Modulus ، نقطة الاتصال ، قوة التصاق ، المنحدرات ، إلخ. - كرر الخطوات من 4.2.1 إلى 4.2.3 لكافة التجارب. كن حذرا لحفظ البيانات في مجلدات مختلفة (أي: "...\TREATED\" و "...\UNTREATED\")
- استخدم البرنامج النصي R المتوفر في البيانات التكميلية لرسم المخططات التخطيطية ومؤامرات المربع وتنفيذ العلاجات الإحصائية ANOVA.
- لفتح البرنامج النصي R (DataAnalisys.R)، استخدم برنامج استوديو R وحمل الملفات التي تحتوي على المعلومات المستخرجة مع برنامج معالجة البيانات (.tsv).
- في إطار البيئة استخدم الزر استيراد مجموعة البيانات، من القائمة المعروضة حدد من النص (readr) وفي النافذة الجديدة حدد زر المتصفح والعثور على ملف .tsv.
- بمجرد تحميل الملف، حدد الأعمدة (الصلابة والالتصاق) ليتم تضمينها للتحليل. لتشغيل كافة التعليمات البرمجية، اضغط على Ctrl+Alt+R.
ملاحظة: البرنامج النصي يعمل مع مجموعات البيانات 4، النظر في تجربتين على حد سواء وجود الخلايا المعالجة وغير المعالجة. من الممكن تنفيذ كتل من البرنامج النصي ونرى كيف تتغير المتغيرات وفقا للوظائف المنفذة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدمنا البروتوكول الموصوف لتحليل تأثير البراميلوفونجين على الخصائص الفيزيائية الحيوية لمسبب الأمراض البشري الانتهازي C. albicans في شكل الخميرة. كاسبوفونجين هو جزيء مضاد للفطريات فرصة أخيرة تستخدم عندما الأدوية الأخرى غير فعالة بسبب آليات المقاومة الخلايا تتطور نحو مضادات الفطريات. وتستند آلية عملها على تثبيط Fks2 وحدة فرعية من fks1/Fks2 معقدة مسؤولة عن توليف ß glucan. كما ß glucans هي عنصر رئيسي من جدار الخلية الفطرية16،17، كنا نتوقع تعديل الخصائص الفيزيائية الحيوية لجدار الخلية : صلابة والالتصاق.
ويعرض الشكل 6 مخططات بيانية نموذجية تم الحصول عليها عند تطبيق جميع البروتوكول الوارد أعلاه. يمثل الرسم البياني الأحمر إعادة تقسيم التصلب المسجلة على 957 خلية أصلية والأزرق على 574 خلية معالجة من كاسبونغين. الملاحظة الأولى المثيرة للاهتمام هي أن كلا الرسمين البيانيين يوضحان توزيعا ثنائي الوسائط للقيم. هذه الملاحظة ممكنة فقط لأننا قمنا بقياس مئات الخلايا. في العينات الأصغر، يلاحظ الباحثون عادة توزيعا واحدا ويفتقفون عدم التجانس السكاني. 17,18
وتتعلق الملاحظة الثانية بتأثير البراميلوفونجين. على الصعيد العالمي يقلل من صلابة الخلايا في حين لا تزال هناك مجموعتين فرعيتين. في خطوة أخيرة يوفر البروتوكول المقترح مقارنة ANOVA للخلايا الأصلية والمعاملة كما هو معروض في الشكل 7. وهو يدل على أن الشرطين لديهما صلابة مختلفة وأن هذا الاختلاف كبير للغاية (قيمة p < 0.001). يتم الوصول إلى هذه القيمة بفضل العدد الكبير من الخلايا التي تم تحليلها وتوفر ثقة أكبر في النتائج التي تم الحصول عليها.
كما تم استخراج التصاق من البيانات المسجلة تلقائيا ووجدنا أن قوة الالتصاق بين الطرف العاري والخلايا الأصلية كانت 0.64 ± 0.6 nN. وفي هذه الحالة، عثر أيضا على مجموعتين فرعيتين: الأولى لها قوة تصاق متوسطة 0.7 ± 1.4 nN بينما الثانية من 4.5 ± 1.5 nN. كان للعلاج مع البراميل آثار لا يمكن التنبؤ بها على التصاق. في تجربة واحدة لم يلاحظ أي تأثير، ولكن في تجربة أخرى، تسبب كاسبوفونجين انخفاض في التصاق إلى طرف وانخفاض في عدم التجانس التصاق السكان. يتم استخراج هذه النتائج من بروا وآخرون13, حيث يتم تقديمها في المجموع.
الشكل 1: الوضع المقبول للطابع المجهري على مرحلة AFM.
يمكن للبرنامج معالجة زاوية الميل على الصور اليسرى (حتى 5 درجات) ولكن الإمالة على اليمين مهمة (10 درجة). وقد تم تعديل هذا الرقم من13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة نموذجية ل AFM لطوابع PDMS مليئة تظهر الإحداثيات الأولية مثل W1 و W2 ، وحجم منطقة المسح الضوئي (Δ2)، وزاوية الميل (ο).
تم تعديل هذا الرقم من13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قسم إدخال المستخدم من البرنامج النصي.
P1 و P2 يشير إلى إحداثيات البئر 1 (W1) والآبار 2 (W2) من الشكل 2. المعلمات الأخرى هي الملعب في μm، وحجم البئر في μm (Ws)، ومسار الدليل لحفظ البيانات، وإجمالي المساحة المربعة التي سيتم بحثها من قبل AFM الآلي (totalArea هو طول في μm من جانب المساحة المربعة الإجمالية) وعدد من القوة منحنيات لكل بئر (numScans). جميع الوحدات في μm. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صورة بصرية تقدم مثالا على الآبار الأولية القيمة (النقاط الخضراء).
يمثل المربع الأسود منطقة المسح الضوئي والبقع الحمراء ، وهي آبار أولية يجب التخلص منها بشكل أفضل. وقد تم تعديل هذا الرقم من13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مخطط انسيابي للبرنامج يعرض الخطوات ال 5 التي يتم تنفيذها تلقائيا بواسطة AFM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: المدرجات التكرارية لقيم الصلابة المتوسطة.
(أ, ب) إظهار النتائج المتوسطة لكل خلية للخلية المعالجة الأصلية والبراميلوفونجين. وقد تم تعديل هذا الرقم من13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: قطع مربع مقارنة الأصلية وتعامل مع خلايا caspofungin.
تمثل النجوم ال 3 أهمية ل p<0.001. يمثل المربع 90٪ من النتائج، والخط المركزي هو القيمة الوسيطة، وتمثل الأشرطة الرأسية نطاق كافة البيانات. وقد تم تعديل هذا الرقم من13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تبعية القيم في موضع الوقت.
المدرجات التكرارية في المركز هي البيانات الأصلية التي تنقسم إلى مجموعات فرعية مختلفة مطابقة للفئات السكانية الفرعية التي تأسست (الأزرق / الأصفر). (أ, ب) إظهار وجود مجموعتين فرعيتين في كل ساعة في التجربة. (C, D) إظهار مواقف المسافة البادئة; على كل موقف من الممكن أن نرى وجود السكان الفرعية (الأزرق / الأصفر). تم إجراء تنظيم المجموعة الفرعية باستخدام خوارزمية k-means. وقد تم تعديل هذا الرقم من13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: المنطقة الآمنة.
تم تعريف منطقة داخل PDMS جيدا على أنها المنطقة التي لا يمس فيها الطرف الهرمي حافة البئر أثناء الوصول إلى قاع البئر (في حالة البئر الفارغ). تم تعديل هذا الرقم من13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
البيانات التكميلية. الرجاء الضغط هنا إلى أسفل هذه الملفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والتحسن الرئيسي الذي توفره هذه المنهجية هو زيادة كبيرة في عدد الخلايا المقاسة في فترة زمنية محددة. النظير هو تخفيض عدد النقاط التي تقاس لكل خلية. وهذا يعني أن هذه الطريقة ليست مصممة لتقديم تحليل مفصل لخلية واحدة. تنطبق الطريقة فقط على الخلايا التي يمكن أن تتلاءم مع آبار ختم PDMS. الطابع هو تنوعا جدا، في حين أنه يحتوي على آبار من 1.5 × 1.5 ميكرومتر2 تصل إلى 6 × 6 μm2. لا يزال من المستحيل شل عصيات أو خلايا أكبر من ذلك بكثير. لا يمكن استخدام الطابع والترسب الحراري الشعري لشل حركة خلايا الثدييات التي هي أكبر بكثير (حوالي 100 ميكرومتر في الطول).
وفي هذا السياق، طورت شركة Peric et al.19 جهازا ذكيا للفلوريد الدقيق لشل عصيات مثل الإشريكية القولونية والعصيات الفرعية. هذا الجهاز يجعل من الممكن لشل عصيات في مواقف محددة وفي ظل الظروف الفسيولوجية. سيكون من المثير جدا تكييف البرنامج مع الحجم الخاص لهذا الجهاز.
يمكن أن يكون تلوث البقشيش مشكلة في هذا النظام الآلي. في حالة الخلايا الميكروبية ، فإنه ليس منتشرا جدا ، ولكنه مهم للغاية في حالة خلايا الثدييات. وقد تناول دوجاردين وآخرون11 هذه المسألة بإضافة خطوة تنظيف في بروتوكولهم الآلي. تتكون هذه الخطوة من فحص مجموع الليزر وتنشيط إجراء التنظيف إذا كان المبلغ منخفضا جدا. تتكون الخطوة النظيفة من غمر الطرف في بئر مملوء بالماء أو الإيثانول.
كان السؤال الذي ينشأ بشكل منهجي من هذا العمل الآلي هو: "هل يأتي التغايرية من تطور الخلايا أثناء التجربة؟". للإجابة على هذا السؤال، رسمنا نتائج صلابة كدالة من الزمن كما هو معروض في الشكل 8A، B. وهو يدل بوضوح على أن يتم تسجيل قيم صلابة غير متجانسة في أي وقت خلال التجربة.
وفي السياق نفسه، برزت مسألة موقف البقشيش أثناء التدبير. قد يكون من الممكن أن منحنيات القوة المسجلة على حافة الخلية سيكون لها صلابة مختلفة عن FC المسجلة في الجزء العلوي من الخلايا. لتجنب هذا الإزعاج، حددنا ما أسمينا المنطقة الآمنة. وهو مبين في الشكل 9A، B ويمثل منطقة داخل الآبار حيث لن تلمس الحافة حواف البئر أثناء قياس القوة. باستخدام هذه "المنطقة الآمنة" يمكننا تسجيل FC فقط على الخلايا وفي أعلىها. كما هو مبين في الشكل 8C، D موقف تلميح داخل المنطقة الآمنة ليست مسؤولة عن عدم التجانس من النتائج كما وجدنا كلا النمطين الظاهري لكل موقف من طرف، في المنطقة الآمنة.
للتأكد من أن القيم المسجلة في كل موضع متجانسة قمنا برسم قيم الصلابة كدالة للموضع كما هو معروض في الشكل 9C,D. وهو يبين أن يتم تسجيل قيم صلابة غير متجانسة على كل موقف في البئر، مما يعني أن التغايرية لوحظ ليست قطعة أثرية بسبب موقف تلميح في الآبار.
يمثل البروتوكول المعروض في هذه المقالة طفرة مفاهيمية ومنهجية في مجال AFM المطبق في علوم الحياة. وتتوافق الكميات الكبيرة من البيانات التي يتم توليدها مع التحليل التلقائي الذي سيسمح بلا شك بتصنيف مجموعات الخلايا وفقا لمعايير جديدة. وتطبيق هذا البروتوكول على صفائف البروتين أو السكر ممكن تماما ولا يتطلب سوى عدد قليل من التعديلات للنظر في التباعد بين المناطق ذات الاهتمام.
ولذلك فهو بروتوكول متعدد الاستخدامات هو نتيجة للتعاون القوي بين التخصصات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نريد أن نعترف FONCYCYT من كوناسيت (المكسيك) ، ووزارة الخارجية الفرنسية وجامعة باريس 13 ، على الرغم من الدعم المالي للمشروع التعاوني الدولي ECOS - NORD اسمه نانو الجس للتشخيص ، رقم 263337 (المكسيك) وMI5P02 (فرنسا). ويود المكتب أن يشكر الدعم المالي الذي تقدمه الشبكة من خلال المشروع رقم 20195489. ويدعم SPC من قبل زمالة دكتوراه من كوناسيت (رقم 288029) و IPN من خلال اتفاق كوتيل للحصول على شهادة دكتوراه مزدوجة (IPN-UPS). ED وCFD هم باحثون في المركز الوطني للبحوث Scientifique (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
References
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
