Dieses Protokoll zielt darauf ab, AFM-Messungen an Hunderten von mikrobiellen Zellen zu automatisieren. Zuerst werden Mikroben in PDMS-Stempelmikrostrukturen immobilisiert und dann werden kraftspektroskopische Messungen automatisch an Hunderten von immobilisierten Zellen durchgeführt.
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Methodenartikel
Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die in diesem Artikel vorgestellte Methode zielt darauf ab, Bio-AFM-Experimente und die Aufzeichnung von Kraftkurven zu automatisieren. Mit dieser Methode ist es möglich, Kräftekurven auf 1000 Zellen in 4 Stunden automatisch aufzuzeichnen. Um eine Analysezeit von 4 Stunden einzuhalten, wird die Anzahl der Kraftkurven pro Zelle auf 9 oder 16 reduziert. Die Methode kombiniert ein Jython-basiertes Programm und eine Strategie zum Zusammensetzen von Zellen auf definierten Mustern. Das Programm, das auf einem kommerziellen Bio-AFM implementiert ist, kann die Spitze auf der ersten Zelle des Arrays zentrieren und sich dann automatisch von Zelle zu Zelle bewegen, während Kraftkurven auf jeder Zelle aufgezeichnet werden. Mit dieser Methodik ist es möglich, auf die biophysikalischen Parameter der Zellen wie ihre Steifigkeit, ihre Hafteigenschaften usw. zuzugreifen. Mit der Automatisierung und der großen Anzahl der analysierten Zellen kann man auf das Verhalten der Zellpopulation zugreifen. Dies ist ein Durchbruch im Bio-AFM-Bereich, wo bisher nur Daten an wenigen Dutzend Zellen aufgezeichnet wurden.
Einleitung
Diese Arbeit bietet eine Methodik, um automatische Kraftmessungen an Hunderten von lebenden Zellen mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) durchzuführen. Es bietet auch eine Methode zur Immobilisierung von Mikroben auf einem mikrostrukturierten PDMS-Stempel, die mit AFM-Experimenten kompatibel ist, die in einer flüssigen Umgebung durchgeführt werden.
Bio-AFM ist eine hochspezialisierte Technologie, die für Anwendungen in der Biologie konzipiert und dann zur Untersuchung lebender Zellen verwendet wird. Es erfordert einen ausgebildeten Ingenieur, der eine Zelle zu diesem Zeitpunkt analysieren kann. Unter diesen Bedingungen ist die Anzahl der ver....
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Protokoll
1. Mikrobielle Zellkultur
- Belebung von Zellen aus einem Glycerinvorrat.
HINWEIS: C. albicans werden bei -80 °C in Glycerinvorräten auf Murmeln gelagert.- Wählen Sie eine Murmel in der -80 °C-Brühe und reiben Sie sie auf Hefepeptrose (YPD) Agar. Züchten Sie die Zellen für 2 Tage bei 30 °C, bevor Sie die Flüssigkeit kultivieren.
- Bereiten Sie flüssige Kulturen vor.
- Füllen Sie ein Kulturröhrchen mit 5 ml steriler YPD-Brühe und fügen Sie eine einzelne Kolonie von C. albicans-Zellen hinzu, die auf der YPD-Agarplatte gezüchtet wurden.
- Die Kultur unter statischen Bedingungen bei 30 °C für 20 h vor....
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Ergebnisse
Wir haben das beschriebene Protokoll verwendet, um die Wirkung von Caspofungin auf die biophysikalischen Eigenschaften des opportunistischen Humanpathogens C. albicans in seiner Hefeform zu analysieren. Caspofungin ist ein Antimykotikum der letzten Chance, das verwendet wird, wenn andere Medikamente aufgrund der Resistenzmechanismen, die Zellen gegenüber Antimykotika entwickeln, unwirksam sind. Sein Wirkmechanismus beruht auf der Hemmung der Untereinheit Fks2 des komplexen fks1/Fks2, der für die ß-Glucansynthese.......
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Diskussion
Die wichtigste Verbesserung, die diese Methodik bietet, ist eine signifikante Erhöhung der Anzahl der gemessenen Zellen in einem bestimmten Zeitraum. Das Gegenstück ist eine Reduzierung der Anzahl der pro Zelle gemessenen Punkte. Dies bedeutet, dass diese Methode nicht für eine detaillierte Analyse einer einzelnen Zelle ausgelegt ist. Die Methode gilt nur für Zellen, die in die Vertiefungen des PDMS-Stempels passen. Der Stempel ist sehr vielseitig, während er Vertiefungen von 1,5 x 1,5 μm2 bis zu 6 x 6 μm.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir möchten FONCYCYT von CONACYT (Mexiko), dem französischen Außenministerium und der Université Paris 13 dank der finanziellen Unterstützung des internationalen Kooperationsprojekts ECOS-NORD mit dem Namen Nano-Palpation for diagnosis, No. 263337 (Mexiko) und MI5P02 (Frankreich) anerkennen. AMR bedankt sich für die finanzielle Unterstützung von SIP-IPN durch das Projekt Nr. 20195489. SPC wird durch ein PhD-Stipendium von CONACYT (Nr. 288029) und IPN durch die Cotutelle-Vereinbarung unterstützt, um ein doppeltes PhD-Zertifikat (IPN-UPS) zu erhalten. ED und CFD sind Forscher am Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AFM-Ausleger | Bruker AFM-Sonden | MLCT | Die verwendeten Ausleger waren mit der Bezeichnung " C” mit einer Resonanzfrequenz von 7 bis 10 kHz und k: 0,01 N/m |
| AFM-Datenanalyse | JPK-Bruker | JPK Datenverarbeitungsversion mindestens 5.1.8 | Kann von einem JPK-Bruker-Benutzer heruntergeladen werden |
| Konto AFM Petrischalen | WPI | Fluorschüssel FD35-100 | Die Heizung wurde verwendet, um die Temperaturänderungen während des Experiments zu überwachen |
| Rasterkraftmikroskop (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II oder III | Das AFM sollte auf einem inversen optischen Mikroskop mit einem motorisierten Tisch montiert werden |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin wurde mit einer Konzentration von 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) verwendetCode-Editor |
| Microsoft | Visual Studio Code Version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ | |
| Kryobeads | IFU | CB12 | |
| Exsikatator/Entgasung Kammer | Fisherbrand | 15594635 | Das Gerät dient zur Entgasung der PDMS-Stempel für ca. 50 Minuten, die jeder Exsikkator in Verbindung mit einer Vakuumpumpe ausführt. |
| Petrischalenheizung | JPK-Bruker | PetriDishHeater | Dies ist ein Add-on zum JPK/Bruker AFM. Die Heizung wurde verwendet, um die Temperaturänderungen während des Experiments zu überwachen |
| Natriumacetat-Puffer pH 5,2 | Sigma-Aldrich | S7899 | Die Lösung enthält 18 mM Natriumacetat, 1 mM CaCl2 und 1 mM MnCl2. Stellen Sie den pH-Wert mit Eisessig ein. Die Lösung kann bei 4 Grad gelagert werden; C für 2 Monate Sprache für |
| statistische Analysen | https://www.r-project.org | R Version 3.6.1 | R ist eine Sprache und Umgebung für statistische Berechnungen und Grafiken. Es handelt sich um ein GNU-Projekt, das der S-Sprache und -Umgebung |
| Statistische Analysesoftware | https://rstudio.com | R Studio Version 1.1.463 | Zusammenarbeit zwischen der R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP und anderen. RStudio und Shiny sind Partnerprojekte der Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxan (PDMS) und Härter in einem Set |
| Hefe Pepton D Bouillon | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
Referenzen
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
