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Bioengineering

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

Published: April 2, 2021 doi: 10.3791/61315
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 4, 3,5, 2
1ITAV-CNRS, Université de Toulouse, CNRS, Toulouse, France, 2LAAS-CNRS, Université de Toulouse, CNRS, Toulouse, France, 3ENCB, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Mexico City, Mexico, 4TBI, Université de Toulouse, CNRS, INRA, INSA, Toulouse, France, 5CIC, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Mexico City, Mexico
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo mira ad automatizzare le misurazioni AFM su centinaia di cellule microbiche. In primo luogo, i microbi vengono immobilizzati nelle microstrutture di francobolli PDMS e quindi le misurazioni della spettroscopia di forza vengono eseguite automaticamente su centinaia di cellule immobilizzate.

Abstract

Il metodo presentato in questo documento mira ad automatizzare gli esperimenti Bio-AFM e la registrazione delle curve di forza. Utilizzando questo metodo, è possibile registrare automaticamente le curve di forza su 1000 celle in 4 ore. Per mantenere un tempo di analisi di 4 ore, il numero di curve di forza per cella viene ridotto a 9 o 16. Il metodo combina un programma basato su Jython e una strategia per assemblare celle su modelli definiti. Il programma, implementato su un Bio-AFM commerciale, può centrare la punta sulla prima cella dell'array e quindi spostarsi, automaticamente, da cella a cella durante la registrazione delle curve di forza su ogni cella. Utilizzando questa metodologia, è possibile accedere ai parametri biofisici delle cellule come la loro rigidità, le loro proprietà adesive, ecc. Con l'automazione e il gran numero di celle analizzate, si può accedere al comportamento della popolazione cellulare. Si tratta di una svolta nel campo bio-AFM, dove finora sono stati registrati dati solo su poche decine di cellule.

Introduction

Questo lavoro fornisce una metodologia per eseguire misurazioni automatiche della forza su centinaia di cellule viventi utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM). Fornisce anche un metodo per immobilizzare i microbi su un timbro microstrutturato PDMS compatibile con gli esperimenti AFM condotti in un ambiente liquido.

Bio-AFM è una tecnologia altamente specializzata concepita per applicazioni in biologia e poi utilizzata per studiare le cellule viventi. Richiede un ingegnere addestrato in grado di analizzare una cella alla volta. In queste condizioni, il numero di cellule diverse che possono essere analizzate è piuttosto piccolo, tipico da 5 a 10 cellule in 4-5 ore. Tuttavia, la quantità di misurazioni della forza registrate su una singola cella è solitamente molto alta e può facilmente raggiungere 1000. Pertanto, l'attuale paradigma delle misurazioni della forza AFM sulle cellule viventi è registrare centinaia di curve di forza (HC) ma su un numero limitato di cellule.

Statisticamente, questo approccio è discutibile e solleva la questione della rappresentatività del campione. In effetti, è difficile, ad esempio, valutare l'eterogeneità di una popolazione cellulare misurando solo poche cellule, anche se su queste poche cellule vengono registrate centinaia di misurazioni. Tuttavia, è sulla base di questo paradigma che sono stati fatti importanti progressi in biofisica, microbiologia e nanomedicina1,2,3. Infatti, l'analisi nanometrica su scala di singole cellule ha fornito nuove informazioni sulla nanomeccanica cellulare, sull'organizzazione delle proteine transmembrana, o sul meccanismo d'azione dei farmaci antimicrobici o anticancro4,5,6,7. Recentemente, tuttavia, sono emersi diversi test biomeccanici ad alta produttività condottisu cellule 8, che mostrano l'interesse della comunità scientifica a cambiare questo paradigma e ad accedere all'eterogeneità della popolazione cellulare. Tutti questi test si basano su sistemi microfluidici per deformare le cellule e misurarne otticamente la deformazione sotto stress per ottenere una misura indiretta della loro elasticità superficialecomplessiva 8. Tuttavia, una questione importante con questi metodi è che sono mono-parametrici: solo l'elasticità cellulare può essere sondata. Inoltre, non consentono la misurazione dei parametri meccanici delle cellule aderenti, che possono essere limitanti per gli studi di cellule di mammifero non circolanti o biofilm, ad esempio.

Gli approcci che coinvolgono AFM sono stati sviluppati dai team di S. Scheuring9 e M. Favre10. cellule immobilizzate su modelli di fibronectina9,costringendo le singole cellule a prendere la forma del modello9. Quindi questo team ha mappato le proprietà meccaniche di alcune celle per definire i dati medi, rappresentativi da 14 a 18 celle. Lo sviluppo effettuato da Farve et al. Per quanto ne siamo a conoscenza, questo lavoro nella direzione del multiplexing non ha portato a misurazioni su cellule viventi.

Un approccio interessante proposto dal team di Dujardin presenta un AFM automatizzato in grado di identificare le cellule e di identificarle nella parte inferiore di pozzi su misura. Sebbene questo metodo non consenta l'analisi di una grande popolazione di cellule, consente il test automatico di condizioni diverse in ogni pozzo11.

Il nostro obiettivo in questo lavoro è più ambizioso poiché volevamo misurare almeno 1000 cellule per accedere non a una cellula media, ma, al contrario, all'eterogeneità tra le cellule. La strategia che abbiamo sviluppato qui per accedere all'eterogeneità della popolazione cellulare usando AFM si basa sull'analisi di centinaia di cellule su cui viene registrato un numero limitato di curve di forza. Rispetto all'approccio "classico" di registrare un gran numero di curve di forza su un numero limitato di celle, questo approccio dovrebbe essere considerato complementare in quanto non fornisce le stesse informazioni. Infatti, mentre il metodo tipico consente di sondare l'eterogeneità della superficie cellulare individuale, utilizzando il nostro approccio, siamo in grado di accedere all'intera eterogeneità della popolazione cellulare. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo combinato un metodo che immobilizza direttamente i microbi (qui la specie di lievito Candida albicans)nei pozzi di un timbro microstrutturato PDMS12, esviluppa un programma originale per spostare la punta AFM, automaticamente, dalla cella allacella 13 e misurare le proprietà meccaniche di ogni cellula.

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Protocol

1. Coltura cellulare microbica

  1. Ravvivare le cellule da un calcio di glicerolo.
    NOTA: Gli albicani C. sono conservati a -80 °C in scorte di glicerolo, su marmi.
    1. Raccogliere un marmo nel ceppo di -80 °C e strofinarlo sull'agar peptone destrosio di lievito (YPD). Coltivare le cellule per 2 giorni a 30 °C, prima della coltivazione liquida.
  2. Preparare colture liquide.
    1. Riempire un tubo di coltura con 5 ml di brodo sterile YPD e aggiungere una singola colonia di cellule C. albicans, coltivate sulla piastra di agar YPD.
    2. Coltivare la coltura in condizioni statiche a 30 °C per 20 ore prima della raccolta per centrifugazione (4000 x g,5 min). Scartare il supernatante ed eliminare come rifiuti a rischio biologico.
    3. Lavare i pellet 2x con 10 mL di tampone di acetato (acetato di sodio da 8 mM, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 5.2). Centrifuga (4000 x g,5 min) tra un lavaggio e l'altro.
    4. Rimorsi il pellet in 2 mL di tampone di acetato e utilizzare questa soluzione per l'immobilizzazione cellulare sul timbro PDMS.
      NOTA: Questa sospensione non può essere conservata e deve essere preparata fresca per la sezione 3.

2. Preparazione del timbro PDMS

  1. Preparazione dello stampo master in silicio
    1. Disegnare le microstrutture desiderate utilizzando il software CAD (Computer Assisted Design).
      NOTA: I pozzi progettati dovrebbero essere di dimensioni simili al microbo da intrappolare. Il design dovrebbe fornire una grande matrice di pozzi 100 x 100 all'elenco. È meglio realizzare diversi array con dimensioni leggermente diverse intorno alla dimensione media del microbo.
    2. Se è disponibile una camera pulita, attenersi ai passaggi da 2 a 12 del protocollo12 pubblicato in precedenza. Altrimenti, lo stampo master in silicio può essere acquisito da strutture commerciali per camere pulite.
  2. Stampaggio timbro PDMS
    1. Preparare 55 g di soluzione di prepolimero PDMS contenente una miscela da 10 a 1, rapporto di massa, di oligomeri PDMS e agente polimerizzante(Tabella dei materiali).
    2. Mescolare e degasare questa soluzione sotto vuoto (nell'intervallo di 10-1-10-2 barre) fino a quando tutte le bolle intrappolate vengono rimosse dalla soluzione PDMS (5−10 min).
    3. Versare 20 g della soluzione degassata sullo stampo master in silicio e degasare di nuovo (nell'intervallo di 10-1-10-2 barre).
      NOTA: Lo spessore del timbro deve essere di circa 2−3 mm.
    4. Quando tutte le bolle vengono rimosse, reticolare il PDMS a 80 °C durante 1 h.
    5. Tagliare il timbro microstrutturato PDMS con un bisturi (0,5 x 1,5 cm2)in una direzione parallela agli array di microstrutture visibili.
    6. Sbucciare il timbro dallo stampo principale in silicio.
    7. Restituire il timbro per esporre le microstrutture sul lato superiore e depositarlo su uno scivolo di vetro. Assicurarsi di avere le microstrutture rivolte verso l'alto lontano dallo scivolo di vetro. Allineare le microstrutture che possono essere viste sul timbro con il lato del vetrino, che in seguito servirà da riferimento per la procedura di automazione AFM.
      NOTA: In questa fase, il timbro PDMS è pronto per l'immobilizzazione cellulare. I francobolli PDMS possono essere conservati sullo stampo master in silicio per diversi mesi. Quando tutto il PDMS viene rimosso dallo stampo principale, un nuovo timbro PDMS può essere lanciato di nuovo sullo stampo master (per mantenere sicuro lo stampo master, è possibile replicarlo in poliuretano)14.

3. Preparazione del campione

  1. Immobilizzazione cellulare
    1. Centrifuga (500 x g, 5 min) 600 μL della soluzione cellulare rimorsiata per separare il tampone dalle cellule.
    2. Pipetta 200 μL del supernatante dal passo 3.1.1 sul timbro PDMS e degas sotto vuoto (nell'intervallo di 10-1-10-2 barre) per circa 40 min.
      NOTA: Questo passaggio è importante per migliorare l'immobilizzazione cellulare all'interno dei pozzi. Le molecole della parete cellulare del lievito, presenti nel supernatante, sono probabilmente depositate sulla superficie del PDMS durante questo passo pre-bagnato. Queste molecole, molto probabilmente, migliorano l'adesione delle cellule e contribuiscono all'aumento della velocità di riempimento del timbro.
    3. Dopo 40 min, con una pipetta, rimuovere il tampone dalla superficie PDMS e depositare, con una pipetta, 200 μL della soluzione cellulare dal passo 1.2.4 per 15 min a temperatura ambiente.
    4. Posizionare le cellule nelle microstrutture del timbro mediante assemblaggio convettivo/capillare. Per questo, stendere manualmente 200 μL di sospensione delle cellule attraverso il timbro utilizzando uno scivolo di vetro in entrambe le direzioni con un angolo compreso tra 30 e 50 °. Potrebbe essere necessario passare lo scivolo di vetro più volte sul timbro per ottenere un alto tasso di riempimento.
      NOTA: una descrizione completa di questo metodo è disponibile13.
    5. Rimuovere la sospensione cellulare con una pipetta. Lavare il timbro 3x con 1 mL di tampone di acetato, pH 5.2 per rimuovere le cellule che non erano intrappolate.
    6. Asciugare la parte posteriore del timbro utilizzando il flusso di azoto, al fine di garantire che il timbro aderisca alla piastra di Petri asciutta.
    7. Infine depositare il timbro PDMS riempito con le celle in una piastra di Petri(Tavolo dei Materiali)e riempirlo con 2 mL di tampone di acetato per mantenere le cellule in mezzo liquido.
  2. Impostazione del timbro sul palco AFM
    1. Centrare il palco alle 0:0 all'avvio delle operazioni AFM.
    2. Calibrare la sensibilità e la costante di molla del sbalzino su vetro e in acqua come descritto in Unsay etal.
    3. Prendi la piastra di Petri con il timbro e mettila nel portapiacenne AFM Petri.
    4. Allineare il bordo del timbro perpendicolarmente all'asse Y del supporto della piastra di Petri.
      NOTA: Un angolo di inclinazione accettabile è inferiore a 5° come illustrato nella figura 1.
    5. Posizionare la testa AFM sul palco e fare attenzione che i motori stepper siano sufficientemente estesi per evitare che la punta si schianti sul timbro.

4. Esecuzione del programma AFM

NOTA: il programma AFM viene fornito come materiale supplementare (AutomatipSoftware2019.pdf). Richiede un JPK-Bruker AFM Nanowizard II o III dotato di uno stadio motorizzato e software desktop JPK versione 4.3. Il programma è stato sviluppato sotto Jython (versione basata su python 2.7)

  1. Acquisizione dati
    1. Centrare la punta AFM sopra l'angolo sinistro dei pozzi da 4,5 x 4,5μm 2 (corrispondenti alle dimensioni della cella) utilizzando il microscopio ottico AFM. Se è necessaria un'altra dimensione del pozzo, centrare l'angolo in alto a sinistra dei pozzi desiderati.
    2. Eseguire una mappa di forza 64 x 64 (intervallo Z = 4 μm, velocità della punta = 90 μm·s-1, forza applicata da 3 a 5 nN) su un'area di 100 x 100 μm². Selezionate la modalità Force Mapping dalla casella a discesa Modalità di misura (Measurement mode). Nel pannello di mappatura del controllo di forza vengono immessi i seguenti parametri: Rel. z lunghezza 4 μm; Movimento Z: durata costante; tempo di proroga: 0,01; ritardo interno:0; Ritardo retr: 0, modalità ritardo: Forza costante, frequenza di campionamento 2048 Hz; Z loop chiuso deselezionare; Griglia: controllare l'immagine quadrata, veloce 100 μm, lenta: 100μm, offset X: 0 μm; Offset Y: 0 μm; angolo griglia: 0 gradi; Pixel: 64x64; rapporto pixel: 1:1
      NOTA: un risultato tipico è illustrato nella figura 2. Questa immagine aiuterà a misurare e verificare l'intonazione tra due pozzi.
    3. Si notano le coordinate del centro del pozzo in alto a sinistra (W1) e del pozzo in basso a sinistra (indicato come W2 nella figura 2). Per fare ciò, crea una scatola quadrata intorno al pozzo. La coordinata del centro della casella viene visualizzata sul pannello sinistro del software AFM in caselle di coordinate x,y.
    4. Per aprire il software diautomazione( Automatip_scan.py ): nel software desktop JPK fare clic in anticipo nel menu della barra superiore e selezionare apri lo script. Nella finestra visualizzata selezionare il percorso verso il file script fornito in Dati supplementari (Automatip_scan.py).
    5. Implementare i valori delle coordinate W1 e W2 nella sezione della casella Input dello script Jython (Figura 3). Immettere le coordinate W1 nella linea variabile P1 239 dello script e le coordinate W2 nella linea variabile P2 241.
      NOTA: i pozzali selezionati come coordinate iniziali (W1 e W2) non devono essere troppo vicini dal bordo dell'area di scansione. In caso contrario, l'algoritmo di centramento non viene eseguito correttamente perché deve misurare l'altezza sulla superficie PDMS su ciascun lato del pozzo. Per un esempio, vedere figura 4.
    6. Attribuire il valore di intonazione alla riga 245 della variabile di intonazione dello script.
    7. Immettere la dimensione del pozzo nella riga variabile Ws 248. Ciò è noto dal design dei modelli di pozzo e può essere controllato sulla stessa immagine utilizzata per verificare l'intonazione (Figura 2).
    8. Scrivere il percorso della directory di salvataggio nella riga 251 per salvare i dati nel punto desiderato.
    9. Impostare la linea variabile totalArea 254 sul multiplo desiderio "n" di 100 μm (cioè l'area di scansione massima dell'AFM utilizzato). Il numero totale di pozzi che verranno sondati può essere calcolato utilizzando questo valore e il passo: area di scansione massima/ passo*n2.
      NOTA: Nell'esempio della Figura 3verranno analizzate 9 aree di 100 x 100μm 2.
    10. Impostate la matrice, la riga e la colonna delle curve di forza (3, 3 o 4, 4), registrate per pozzo nella linea variabile numScans 257.
      NOTA: Nell'esempio della figura 3, per ogni pozzo verrà registrata una matrice di 3 x 3 = 9 IC.
    11. Eseguire il programma. Fare clic sul pulsante Start.
      NOTA: il programma esegue prima automaticamente un algoritmo di centramento per determinare meglio il centro dei pozzi W1 e W2 (passaggio 1). Acquisisce quindi automaticamente la matrice Force Curves (FC) su ogni pozzo della prima area di scansione (passaggio 2). Quando tutti i pozzi di quell'area vengono sondati, lo script sposta automaticamente la punta AFM sul primo pozzo dell'area di scansione successiva. La punta viene retratti, lo stadio del microscopio si sposta nell'area successiva, la punta viene nuovamente avvicinata sul timbro e l'algoritmo di centraggio viene eseguito di nuovo per centrare automaticamente sul primo pozzo (1') di quell'area (passaggio 3). La prima area è definita dall'utente, la seconda, è a destra ecc. fino al raggiungere n. l'area n+1 è sotto n, n+2 a sinistra di n+1, ecc. fino al raggiungere 2n. 2n +1 è sotto 2n, e 2n + 2 è sulla destra su 2n, ecc. A livello globale, la punta si atteva alla superficie totale. I gradini 2 e 3 vengono ripetuti automaticamente fino a quando nonviene sondatoil numero totale " n2" delle aree di scansione. La figura 5 presenta il diagramma di flusso del programma. Ci vogliono ~ 4 ore per completare il programma.
  2. analisi dei dati
    1. Eseguire lo script python "Copy files" (Copy_files_L.py, fornito in Dati supplementari) per organizzare i file FCs in un'unica cartella. Questo script è stato sviluppato con Python 2.7 e il modulo SciPy. Usa il software Visual Studio Code per aprire lo script python. Percorso di input della cartella generale (riga 67 dello script fornito in dati supplementari) e dove verrà memorizzata (riga 73).
    2. Aprire il software di elaborazione dati del produttore AFM per analizzare le curve di forza. Nel menu superiore Fileselezionare open 'batch di curve di spettroscopia.
    3. Nella finestra di elaborazione batch selezionare il processo fornito in Dati supplementari (StiffnessProcess.jpk-proc-force). Selezionare l'ultimo passaggio del processo e fare clic su Mantieni e applica a tutti. Tutte le curve di forza riceveranno lo stesso trattamento.
      NOTA: il processo utilizza la calibrazione dai file FCs per convertire le curve di deflessione in curve di forza calibrate in Newton; viene applicato un algoritmo di smussatura dei dati (media di 3 punti consecutivi); la linea di base viene tradotta per riposare sull'asse zero; il punto di contatto viene estrapolato e l'FC viene sfalsato per posizionare il punto di contatto alla coordinata (0,0); la flessione del sbalzino viene sottratta ai PC, la pendenza di retrazione è montata. Al termine del trattamento dei dati, il software genera un file che contiene una tabella che fornisce per ogni TC: il suo nome, Modulo Giovane, punto di contatto, forza di adesione, pendenze, ecc.
    4. Ripetere i passaggi da 4.2.1 a 4.2.3 per tutti gli esperimenti. Fare attenzione a salvare i dati in cartelle diverse (ad esempio: "...\TREATED\" e "...\UNTREATED\")
    5. Utilizzare lo script R fornito in Dati supplementari per tracciare istogrammi e box plot ed eseguire trattamenti statistici ANOVA.
      1. Per aprire lo script R (DataAnalisys.R), utilizzare il software R studio e caricare i file contenenti le informazioni estratte con il software di elaborazione dati (.tsv).
      2. Nella finestra dell'ambiente utilizzare il pulsante Importa Dataset, nell'elenco visualizzato selezionare da testo (lettura) e nella nuova finestra selezionare il pulsante Browser e trovare il file tsv.
      3. Una volta caricato il file, selezionare le colonne (rigidità e adesione) da includere per l'analisi. Per eseguire tutto il codice, premere CTRL+ALT+R.
        NOTA: lo script funziona con 4 set di dati, considera due esperimenti che hanno entrambe celle non trattate e trattate. È possibile eseguire blocchi dello script e vedere come cambiano le variabili in base alle funzioni eseguite.

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Representative Results

Abbiamo usato il protocollo descritto per analizzare l'effetto della caspofungina sulle proprietà biofisiche dell'agente patogeno umano opportunistico C. albicans nella sua forma di lievito. Caspofungin è un'ultima molecola antimicotico utilizzata quando altri farmaci sono inefficaci a causa dei meccanismi di resistenza che le cellule sviluppano verso gli antifungini. Il suo meccanismo d'azione si basa sull'inibizione della subunità Fks2 del complesso fks1/Fks2 responsabile della sintesi ß glucano. Poiché i glucani ß sono un componente importante della parete cellulare fungina16,17, ci aspettavamo una modifica delle proprietà biofisiche della parete cellulare: rigidità e adesione.

La figura 6 presenta gli istogrammi tipici ottenuti quando viene applicato tutto il protocollo sopra presentato. L'istogramma rosso rappresenta la ripartizione della rigidità registrata su 957 cellule native e quella blu su 574 cellule trattate con caspofungin. La prima osservazione interessante è che entrambi gli istogrammi dimostrano una distribuzione bimodale dei valori. Questa osservazione è possibile solo perché abbiamo misurato centinaia di cellule. Su campioni più piccoli, i ricercatori di solito osservano una singola distribuzione e perdono l'eterogeneità della popolazione. 17di18

La seconda osservazione riguarda l'effetto della caspofungina. A livello globale riduce la rigidità delle cellule mentre esistono ancora due sottopopolazioni. In un ultimo passaggio il protocollo proposto fornisce un confronto ANOVA tra le celle native e trattate presentate nella figura 7. Dimostra che le due condizioni hanno una rigidità diversa e che questa differenza è molto significativa (valore p < 0,001). Questo valore viene raggiunto grazie al gran numero di cellule analizzate e fornisce una maggiore fiducia nei risultati ottenuti.

Anche l'adesione è stata estratta dai dati registrati automaticamente e abbiamo scoperto che la forza di adesione tra la punta nuda e le celle native era di 0,64 ± 0,6 nN. In questo caso sono state riscontrate anche due sottopopolazioni: la prima ha una forza di adesione media di 0,7 ± 1,4 nN, mentre la seconda di 4,5 ± 1,5 nN. Il trattamento con caspofungin ha avuto effetti imprevedibili sull'adesione. In un esperimento non è stato osservato alcun effetto, ma in un altro esperimento, la caspofungina ha indotto una diminuzione dell'adesione alla punta e una riduzione dell'eterogeneità dell'adesione della popolazione. Questi risultati sono estratti da Proa etal.

Figure 1
Figura 1: Posizione accettabile del timbro microstrutturato sullo stadio AFM.
L'angolo di inclinazione sulle immagini a sinistra (fino a 5°) può essere gestito dal programma, ma l'inclinazione a destra è importante (10°). Questa cifra è stata modificata apartire da 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagine AFM tipica di un timbro PDMS riempito che mostra le coordinate iniziali come W1 e W2, la dimensione dell'area di scansione (Δ2), l'angolo di inclinazione (θ).
Questa figura è stata modificata apartire da 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Sezione di input dell'utente dello script.
P1 e P2 si riferiscono alle coordinate del pozzo 1 (W1) e del pozzo 2 (W2) della Figura 2. Gli altri parametri sono il passo in μm, la dimensione del pozzo in μm (Ws), il percorso di directory per salvare i dati, l'area quadrata totale che verrà sondata dall'AFM automatizzato (totalArea è la lunghezza in μm del lato dell'area quadrata totale) e il numero di curve di forza per pozzi (numScans). Tutte le unità sono in μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagine ottica che fornisce un esempio di preziosi pozzi iniziali (punti verdi).
Il quadrato nero rappresenta l'area di scansione e le macchie rosse, pozzi iniziali che dovrebbero essere meglio scartati. Questa cifra è stata modificata apartire da 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Diagramma di flusso del programma che mostra i 5 passaggi eseguiti automaticamente dall'AFM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Istogrammi dei valori di rigidità mediana.
(A, B) Mostra i risultati mediani per cella per la cella nativa e trattata con caspofungin. Questa cifra è stata modificata apartire da 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Box plot che confrontano i nativi e trattati con cellule di caspofungina.
Le 3 stelle rappresentano un significato di p<0.001. La casella rappresenta il 90% dei risultati, la linea centrale è il valore mediano e le barre verticali rappresentano l'intervallo di tutti i dati. Questa cifra è stata modificata apartire da 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Dipendenza dei valori in posizione di tempo.
Gli istogrammi al centro sono i dati originali che sono divisi nei diversi sottogruppi corrispondenti alle sottopopolazioni fondate (blu/giallo). (A,B) Mostra la presenza delle due sotto-popolazioni ad ogni ora dell'esperimento. (C,D) mostrano le posizioni di indentazione; su ogni posizione è possibile vedere la presenza delle sottopopolazioni (blu/giallo). L'organizzazione del sottogruppo è stata eseguita utilizzando l'algoritmo k-means. Questa cifra è stata modificata apartire da 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: L'area sicura.
Un'area, all'interno del pozzo PDMS, è stata definita come l'area in cui la punta piramidale non tocca il bordo del pozzo raggiungendo il fondo del pozzo (nel caso di un pozzo vuoto). Questa figura è stata modificata apartire da 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dati supplementari. Clicca qui per scendere questi file. 

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Discussion

Il principale miglioramento fornito da questa metodologia è un aumento significativo del numero di cellule misurate in un determinato lasso di tempo. La controparte è una riduzione del numero di punti misurati per cella. Significa che questo metodo non è progettato per fornire un'analisi dettagliata di una singola cella. Il metodo si applica solo alle celle che possono essere adatte ai pozzi del timbro PDMS. Il timbro è abbastanza versatile, mentre contiene pozzi di 1,5 x 1,5 μm2 fino a 6 x 6 μm2. Tuttavia è impossibile immobilizzare il bacillo o cellule molto più grandi. Il timbro e la deposizione convettiva capillare non possono essere utilizzati per immobilizzare le cellule di mammifero che sono molto più grandi (circa 100 μm di lunghezza).

In questo contesto, Peric etal. Questo dispositivo consente di immobilizzare il bacillo in posizioni definite e in condizioni fisiologiche. Sarebbe molto interessante adattare il software alle dimensioni particolari di questo dispositivo.

La contaminazione da punta può anche essere un problema in questo sistema automatizzato. Nel caso delle cellule microbiche, non è così prevalente, ma è di grande importanza nel caso delle cellule di mammifero. Dujardin etal. Questo passaggio consiste nel controllare la somma laser e attivare la procedura di pulizia se la somma è troppo bassa. Il passo pulito consiste nell'immergere la punta in un pozzo pieno di acqua o etanolo.

Una domanda che nasce sistematicamente da questo lavoro di automazione è stata: "l'eterogeneità deriva dall'evoluzione delle cellule durante l'esperimento?". Per rispondere a questa domanda, abbiamo tracciato i risultati della rigidità in funzione del tempo come presentato nella figura 8A,B. Dimostra chiaramente che valori di rigidità eterogenei vengono registrati in qualsiasi momento durante l'esperimento.

Nello stesso contesto è emersa la questione della posizione della punta durante la misura. Potrebbe essere possibile che le curve di forza registrate sul bordo di una cella abbiano una rigidità diversa da quella fc registrata sulla parte superiore delle celle. Per evitare questo inconveniente, abbiamo definito quella che abbiamo chiamato l'area sicura. È raffigurato nella figura 9A,B e rappresenta un'area all'interno dei pozzi in cui la punta non toccherà i bordi dei pozzi durante la misurazione della forza. Utilizzando questa "area sicura" potremmo registrare FC solo sulle celle e nella parte superiore di esse. Come mostrato nella figura 8C,D, la posizione della punta all'interno dell'area di sicurezza non è responsabile dell'eterogeneità dei risultati, poiché abbiamo riscontrato entrambi i fenotipi per ogni posizione della punta, nell'area sicura.

Per assicurarsi che i valori registrati in ogni posizione siano omogenei, abbiamo tracciato i valori di rigidità in funzione della posizione presentata nella figura 9C,D. Mostra che valori di rigidità eterogenei sono registrati su ogni posizione nel pozzo, il che significa che l'eterogeneità osservata non è un artefatto a causa della posizione della punta nei pozzi.

Il protocollo presentato in questo articolo rappresenta una svolta concettuale e metodologica nel campo dell'AFM applicato nelle scienze della vita. Le grandi quantità di dati generati sono compatibili con l'analisi automatica che consentirà senza dubbio la classificazione delle popolazioni cellulari secondo nuovi criteri. L'applicazione di questo protocollo alle proteine o agli array di zucchero è del tutto fattibile e richiede solo pochi adattamenti per considerare la spaziatura tra le aree di interesse.

Si tratta quindi di un protocollo versatile frutto di una forte collaborazione interdisciplinare.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vogliamo riconoscere FONCYCYT di CONACYT (Messico), il Ministero degli Affari Esteri della Francia e l'Université Paris 13, anche se il supporto finanziario del progetto collaborativo internazionale ECOS-NORD ha nominato Nano-palpazione per la diagnosi, n. 263337 (Messico) e MI5P02 (Francia). AMR desidera ringraziare il sostegno finanziario di SIP-IPN attraverso il progetto n. 20195489. SPC è supportata da una borsa di dottorato di CONACYT (n. 288029) e IPN attraverso l'accordo cotutelle per ottenere un doppio certificato di dottorato (IPN-UPS). ED e CFD sono ricercatori del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM cantilever Bruker AFM probes MLCT The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m
AFM data analysis JPK-Bruker JPK Data processing version minimum 5.1.8 Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount
AFM Petri dishes WPI FluoroDish FD35-100 The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Atomic force Microscope (AFM) JPK-Bruker Nanowizard II or III the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage
Caspofungin Sigma-Aldrich SML0425-5MG Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)
Code editor Microsoft Visual Studio Code version 1.40.1 https://code.visualstudio.com/
Cryobeads IFU CB12
Dessicator/Degassing chamber Fisherbrand 15594635 The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.
Petri dish heater JPK-Bruker PetriDishHeater This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Sodium acetate buffer pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899 The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months
Statistical analysis language https://www.r-project.org R version 3.6.1 R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment
Statistical analysis software https://rstudio.com R studio version 1.1.463 collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics
Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761028 Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set
Yeast Peptone D Broth Difco 242820
YPD Agar Difco DF0427-17-6

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References

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Questo mese in JoVE Numero 170 microscopia a forza atomica C. albicans,automazione nanomeccanica cellulare meccanobiologia analisi della curva di forza adesione cellulare automazione AFM Jython pianificazione esperimenti JPK
Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su <em>centinaia di cellule C. albicans</em>
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Severac, C., Proa-Coronado, S., Formosa-Dague, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells. J. Vis. Exp. (170), e61315, doi:10.3791/61315 (2021).

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