Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika

Summary

Ex-vivo-Gehirnschnitte können verwendet werden, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf evozierte Reaktionen auf afferente Inputs zu untersuchen. Optogenetik wird eingesetzt, um thalamokortikale und kortikokkortikale Afferenzen für nicht-primären Neokortex unabhängig zu aktivieren, und synaptische und Netzwerkantworten werden mit Isofluran moduliert.

Abstract

Anästhetika beeinflussen das Bewusstsein zum Teil durch ihre Wirkung auf thalamokortikale Schaltkreise. Das Ausmaß, in dem flüchtige Anästhetika unterschiedliche Zell- und Netzwerkkomponenten dieser Schaltkreise beeinflussen, bleibt jedoch unklar. Ex-vivo-Gehirnschnitte bieten ein Mittel, mit dem Forscher diskrete Komponenten komplexer Netzwerke untersuchen und potenzielle Mechanismen entwirren können, die den Auswirkungen flüchtiger Anästhetika auf evozierte Reaktionen zugrunde liegen. Um potenzielle zelltyp- und wegspezifische Arzneimittelwirkungen in Gehirnschnitten zu isolieren, müssen die Forscher in der Lage sein, unabhängig voneinander afferente Faserwege zu aktivieren, nicht überlappende Zellpopulationen zu identifizieren und flüchtige Anästhetika in wässriger Lösung auf das Gewebe aufzutragen. In diesem Protokoll werden Methoden beschrieben, um optogenetisch evozierte Reaktionen auf zwei unabhängige afferente Signalwege zum Neocortex in ex vivo Gehirnschnitten zu messen. Extrazelluläre Reaktionen werden auf die Assay-Netzwerkaktivität aufgezeichnet und gezielte Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen werden in Somatostatin- und Parvalbumin-positiven Interneuronen durchgeführt. Die Abgabe physiologisch relevanter Isoflurankonzentrationen über künstliche Rückenmarksflüssigkeit zur Modulation von Zell- und Netzwerkantworten wird beschrieben.

Introduction

Flüchtige Anästhetika werden seit mehr als einem Jahrhundert ubiquitär in einer Vielzahl von klinischen und akademischen Umgebungen eingesetzt. Verschiedene Klassen von Anästhetika haben einzigartige, oft nicht überlappende molekulare Ziele ^1,2,3, aber fast alle von ihnen erzeugen Bewusstlosigkeit. Während ihre Verhaltenseffekte ziemlich vorhersehbar sind, sind die Mechanismen, durch die Anästhetika Bewusstseinsverlust induzieren, weitgehend unbekannt. Anästhetika können letztendlich sowohl das Niveau als auch den Inhalt des Bewusstseins durch Aktionen auf kortikothalamische Schaltkreise beeinflussen und die Integration von Informationen in der gesamten kortikalen Hierarchie^stören 4,5,6,7,8,9. Im weiteren Sinne kann die Modulation kortikothalamischer Schaltkreise eine Rolle bei experimentell 10 oder pharmakologisch 11 veränderten Bewusstseinszuständen spielen und kann auch mit Schlafstörungen¹² und pathophysiologischen Bewusstseinsstörungen^13,14 in Verbindung gebracht werden.

Die Flüchtigkeit der Mechanismen, die dem Verlust und der Rückkehr des Bewusstseins während der Anästhesie zugrunde liegen, kann teilweise auf nichtlineare, synergistische Wirkungen von Anästhetika auf zellulärer, Netzwerk- und Systemebene zurückgeführt werden¹⁵. Isofluran zum Beispiel unterdrückt die Aktivität innerhalb der ausgewählten Hirnregionen 16,17,18, beeinträchtigt die Konnektivität zwischen entfernten Hirnregionen ^{19,20,21,22,23} und verringert synaptische Reaktionen in einer wegspezifischen Weise^24,25 . Welche Wirkungen von Anästhetika, von der molekularen bis zur Systemebene, notwendig oder ausreichend sind, um Bewusstseinsverlust zu bewirken, bleibt unklar. Zusätzlich zu substantiellen klinischen Untersuchungen des Bewusstseins mit nicht-invasiven Techniken 19,20,26 ist es wichtig, dass Experimentatoren versuchen, die unterschiedlichen zellulären und Netzwerkinteraktionen, die der bewussten Erfahrung dienen^, zu entwirren.

Durch die Vereinfachung der komplexen Interaktionen im intakten Gehirn ermöglichen Ex-vivo-Gehirnschnitte die Untersuchung isolierter Komponenten der dynamischen Systeme des Gehirns⁹. Ein reduziertes Schnittpräparat kombiniert die Vorteile relativ intakter anatomischer Strukturen lokaler neuronaler Schaltkreise mit der Vielseitigkeit von In-vitro-Manipulationen. Bis vor kurzem haben methodische Einschränkungen jedoch die Untersuchung der synaptischen und Schaltkreiseigenschaften von Langstreckeneingaben in Gehirnschnitten ausgeschlossen^27,28; Der gewundene Weg der kortikothalamischen Faserbahnen machte die Aktivierung unabhängiger afferenter Bahnen durch elektrische Stimulation nahezu unmöglich.

Die Untersuchung der Wirkung von Anästhetika auf die Gehirnschnittpräparate stellt zusätzliche Herausforderungen dar. In Ermangelung eines intakten Atmungs- und Kreislaufsystems müssen Anästhetika im Bad angewendet und die Konzentrationen sorgfältig auf die geschätzten Konzentrationen an der Wirkungsstelle abgestimmt werden. Bei vielen intravenösen Anästhetika macht die langsame Gleichgewichtsrate im Gewebe traditionelle pharmakologische Untersuchungen mühsam ^29,30. Die Untersuchung der Auswirkungen von flüchtigen Gasanästhetika in Ex-vivo-Präparaten ist handhabbarer, stellt aber auch Herausforderungen dar. Dazu gehören die Umwandlung inhalativer Partialdruckdosen in wässrige Konzentrationen und die Notwendigkeit eines modifizierten Verabreichungssystems des Arzneimittels zum Gewebe über künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit³¹.

Hier werden Methoden beschrieben, mit denen Forscher die gut dokumentierten physikochemischen Eigenschaften des flüchtigen Anästhetikums Isofluran für die Wirkstoffabgabe an ex vivo Gehirnschnitte nutzen, weg- und schichtspezifische Eingaben in einen kortikalen Bereich von Interesse mit hoher raumzeitlicher Auflösung aktivieren und simultane laminare Aufnahmen und gezielte Patch-Clamp-Aufnahmen von ausgewählten Neuronenpopulationen durchführen können. In Kombination ermöglichen diese Verfahren den Forschern, flüchtige, durch Anästhetika induzierte Veränderungen in mehreren beobachtbaren elektrophysiologischen Reaktionseigenschaften von der synaptischen bis zur lokalen Netzwerkebene zu messen.

Protocol

Alle Verfahren mit Tieren, die in diesem Protokoll beschrieben sind, wurden von der University of Wisconsin-Madison School of Medicine und dem Public Health Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Züchtung von Mäusen zur Expression von fluoreszierendem Reporterprotein in Interneuron-Subpopulationen

1. Paaren Sie homozyogische, Cre-abhängige tdTomato-Maus mit homozygoter SOM-Cre-Weibchen oder homozygoter PV-Cre-Weibchenmaus.
   HINWEIS: Andere spezifische neuronale Populationen können mit den entsprechenden Cre-Linien anvisiert werden.
2. Lassen Sie heterozygote Nachkommen mindestens 3 Wochen reifen, bevor Sie fortfahren. Für hier beschriebene Experimente ist eine Genotypisierung nicht notwendig, da homozygote Eltern Nachkommen produzieren, die sowohl für zelltypspezifische Cre-Rekombinase als auch für Cre-abhängige Reporterallele alle heterozygot sind.

2. Durchführung einer einseitigen stereotaktischen Injektion eines viralen Konstrukts

1. Passen Sie die Einstellungen des Mikropipettenziehers für Injektionspipetten wie in der Gerätebedienungsanleitung angegeben an (empfohlene Einstellungen siehe Tabelle 1 ). Ziehen Sie an der Glasmikropipette.
2. Brechen Sie die Spitze des scharfen Endes der Pipette so, dass der Spitzendurchmesser ca. 30 μm mit minimaler Verjüngung über mehrere Millimeter beträgt.
3. Entscheiden Sie anhand zuvor dokumentierter Verfahren über den geeigneten Titer und das Volumen des zu injizierenden Virus. In den hier beschriebenen Experimenten führten einseitig injizierte 1,0 μL (Titer: 3,1-5,7 TU/ml) zu guten Ergebnissen.
4. Füllen Sie das gesamte Volumen der Pipette mit Mineralöl auf. Laden Sie die Pipette auf die Mikrospritze und lassen Sie eine kleine Menge Mineralöl durch die Spitze fließen, um sicherzustellen, dass die Spitze nicht verstopft ist.
5. Frontfill mindestens 1,0 μL virales Konstrukt. Der rekombinante adeno-assoziierte virale Vektor, der in diesen Experimenten verwendet wurde, war AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
6. Sterile Vorhänge in einem chirurgischen Bereich anordnen. Sterilisieren Sie Werkzeuge für stereotaktische Verfahren und legen Sie sie auf den Vorhang.
7. Anästhesieren Sie SOM-tdTomato oder PV-tdTomato heterozygotes Tier mit Isofluran (3% für Induktion, 1,5-2% für Erhaltung) und Sauerstoffgemisch. Bestätigen Sie regelmäßig das chirurgische Niveau der Anästhesie mit Zehenklemme während der Operation. Stellen Sie sicher, dass das Tier nicht über den chirurgischen Plan der Anästhesie hinausgeht, indem Sie die Atmung alle 10-15 Minuten überwachen.
8. Rasieren Sie die Oberseite des Kopfes des Tieres. Tragen Sie 70% Isopropylalkohol und Lösung auf Jodbasis großzügig auf den chirurgischen Bereich und die Augensalbe auf die Augenhöhlen auf, um ein Austrocknen der Membran zu verhindern. Bupivacain/Lidocain (Verhältnis 1:1, 1,0 mg/kg) subkutan an die Operationsstelle zur Lokalanästhesie verabreichen.
9. Passen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen.
10. Verwenden Sie das Skalpell, um einen Schnitt entlang der sagittalen Hautachse über der dorsalen Oberfläche des Schädels zu machen. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette zurück. Hydratisieren Sie den Schädel nach Bedarf mit 0,9% Kochsalzlösung.
11. Markieren Sie auf der Oberfläche des Schädels leicht den Schnittpunkt von vorderen und lateralen Koordinaten mit einem Kreuz in Bleistift. Bohren Sie ein Loch an den entsprechenden Koordinaten in der Querebene (in mm relativ zu Bregma, für die Injektion des cingulären Kortex (Cg): anterior 0,2, lateral 0,3; für posterior thalamus (Po) Injektion: posterior 2,25, lateral 3,4).
    HINWEIS: Die Markierungen sollten über die Grenzen des Gratlochs hinausgehen, um eine genaue Platzierung der Pipette zu ermöglichen.
12. Schalten Sie den Lufttisch ein und balancieren Sie ihn aus.
13. Positionieren Sie den Elektrodenmanipulator des stereotaktischen Rahmens bei 0° für Injektionen in Cg oder 45° in der koronalen Ebene für Injektionen in Po.
14. Befestigen Sie die Spritzenpumpe am Elektrodenmanipulator. Befestigen Sie die Steuerung der Mikrospritzenpumpe an der Spritzenpumpe.
15. Navigieren Sie durch die Pipettenspitze in der Nähe der Gehirnoberfläche (aber ohne sie zu berühren), an der Kreuzung der in Schritt 2.11 erstellten Markierungen. Die Pipette wird mit etwa 1 mm/s entlang ihrer Längsachse entweder 0,9 mm (Injektion in Cg) oder 3,1 mm (Injektion in Po) in das Gehirn vorgeschoben. Warten Sie 10 Minuten, bevor Sie fortfahren.
16. Injizieren Sie 1,0 μL virales Konstrukt über einen Zeitraum von 10 min (100 nL / min). Wenn eine Wellung des Virus von der Pipetteneinführungsstelle beobachtet wird, verlangsamen Sie die Injektionsrate auf 50 nL / min.
17. Warten Sie nach der Injektion 10 Minuten, bevor Sie die Injektionspipette langsam zurückziehen.
18. Naht, um den Kopfhautschnitt zu schließen und 2-5 mg/kg Meloxicam subkutan zu verabreichen.
19. Setzen Sie Isofluran ab und überwachen Sie das Tier während des Auftauchens aus der Narkose. Lassen Sie die Erholung nach den vom Animal Care and Use Committee der Institution beschriebenen Verfahren durchführen, einschließlich der weiteren Verabreichung von Analgetika.

3. Vorbereitung von akuten Hirnschnitten

1. Warten Sie mindestens 3 Wochen für die Expression des viralen Konstrukts, bevor Sie Gewebe entnehmen.
2. Bereiten Sie 1 L künstliche Rückenmarksflüssigkeit für das Schneiden vor (Schneiden künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit, sACSF). Siehe Tabelle 2 für Inhaltsstoffe.
3. Während des gesamten Schneidevorgangs wird sACSF ein gelöstes 95% O₂/5% CO_2-Gemisch zugeführt, das über ein Gasdispersionsrohr abgegeben wird.
4. Bereiten Sie das eiskalte Bad für das vibrierende Klingenmikrotom vor. Montieren Sie den eiskalten Probentisch auf das Mikrotom und fixieren Sie die Saphirklinge zum Schneiden des Gewebes.
5. Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran und Sauerstoff bis zum Verlust des aufrichtenden Reflexes.
6. Enthaupten Sie die Maus mit der Guillotine und tauchen Sie den Kopf sofort in 4 ° C sACSF. Um die Gesundheit des Gewebes zu erhalten, führen Sie die folgenden Schritte so schnell wie möglich aus.
7. Öffnen Sie die Schädelhöhle, indem Sie einen kleinen Schnitt an der Schädelbasis machen und jede Schädelplatte vorsichtig entfernen. Entfernen Sie vorsichtig die darunterliegende Dura mater.
8. Während sich das Gehirn noch in der Schädelhöhle befindet, verwenden Sie die Rasierklinge, um das Kleinhirn zu entfernen. Machen Sie einen zweiten vertikalen Schnitt entlang der sagittalen Ebene in der linken Hemisphäre, nur seitlich zur Mittellinie.
9. Bereiten Sie den Gewebeblock für das Schneiden vor.
   1. Heben Sie das Gehirn vorsichtig aus der Schädelhöhle. Legen Sie das Gehirn auf das Filterpapier mit der flachen, sagittalen Ebene nach unten. Führen Sie das Filterpapier über die blockierende Schablone und richten Sie das Gehirn an der zugrunde liegenden Vorlagengliederung aus (ergänzende Abbildung 1).
   2. Machen Sie zwei parallele Schnitte in der koronalen Ebene, wie durch die Linien auf der Schablone angezeigt. Fügen Sie bei Bedarf einen kleinen Tropfen sACSF hinzu, um Filterpapier nass zu halten.
   3. Legen Sie den Gewebeblock kurz in 4°C sACSF, während Schritt 3.8.4 durchgeführt wird.
   4. Tragen Sie eine kleine Menge Sekundenkleber auf die eiskalte Probenstufe auf.
   5. Heben Sie den Gewebeblock von kaltem sACSF an. Verwenden Sie die Ecke eines saugfähigen Handtuchs, um überschüssiges sACSF abzuleiten. Kleben Sie die hintere koronale Ebene des Gewebeblocks auf das Probenstadium, wobei die dorsale Oberfläche des Gehirns der Saphirklinge zugewandt ist.
10. Sammeln Sie 500 μm dicke koronale Hirnschnitte. Legen Sie interessante Scheiben auf Nylongitter (ergänzende Abbildung 2) in 34 °C sACSF und lassen Sie den Behälter Raumtemperatur erreichen.
    HINWEIS: Für hier beschriebene Experimente wurden elektrophysiologische Aufzeichnungen von einem koronalen Abschnitt gesammelt, der etwa 2,25 mm hinter Bregma zentriert war, um einen nicht-primären sensorischen Bereich, den medialen sekundären visuellen Kortex (V2MM), zu untersuchen.

4. Herstellung von experimentellen künstlichen Rückenmarksflüssigkeitsbeuteln (eACSF) mit gelöstem flüchtigem Anästhetikum Isofluran

1. Bereiten Sie 300 ml einer Stammmischung von 3,0% Isofluran vor.
   1. In einem versiegelten Polytetrafluorethylen-Gasbeutel ~100 ml 95% O 2/5% CO 2-Gasgemisch zu 20-30 mL flüssigem Isofluran und einer kleinen Menge 0,9% Kochsalzlösung hinzufügen. Warten Sie mindestens 30 Minuten, um das Gleichgewicht von Isofluran zwischen flüssiger und gasförmiger Phase zu ermöglichen.
   2. Bestimmen Sie die Menge an gesättigtem Isoflurangas, V_sat, die dem Brühbeutel hinzugefügt werden soll, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:
      
      wobei P%_stock die Zielzusammensetzung des Vorratsgases (in diesem Fall 3%),_V-Bestand das Endvolumen des Vorratsgasbeutels, P-Isofluran der Partialdruck von_Isofluran bei Raumtemperatur (~ 240 mmHg) und P_insgesamt der atmosphärische Druck (~ 760 mmHg) ist.
   3. Geben Sie die berechnete Menge an gesättigtem Gas in einen leeren Gasbeutel und füllen Sie den Beutel mit einem Volumen von 95% O 2/5% CO₂ Gasgemisch, um das Gesamtvolumen des Beutels auf 300 ml zu bringen.
2. Bereiten Sie 2 L künstliche Rückenmarksflüssigkeit für die Durchblutung der Scheibe während des Experiments vor (experimentelle ACSF, eACSF). Siehe Tabelle 2 für Inhaltsstoffe. 95% O 2/5% CO₂ Gasgemisch werden in Lösung gelöst.
3. Bereiten Sie zwei separate Beutel mit Kontroll- und Isofluran-Lösungen vor.
   1. Zu einem leeren Polytetrafluorethylen-Gasbeutel werden 600 mL eACSF und 600 mL 95% O 2/5% CO 2-Gasgemisch hinzugefügt. Beschriften Sie diese Tasche als Control.
   2. Zu einem weiteren leeren Polytetrafluorethylen-Gasbeutel 300 ml eACSF hinzufügen. Beschriften Sie diesen Beutel als Isofluran.
   3. Wählen Sie eine physiologisch relevante äquilibrierte Gasphasenkonzentration von Isofluran. Die Experimente wurden mit Gaskonzentrationen durchgeführt, die 1,3% Isofluran entsprechen. Mäuse verlieren den aufrichtenden Reflex und vermutlich das Bewusstsein bei 0,9% inhaliertem Isofluran.
   4. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die äquivalente Gasphasenkonzentration bei Raumtemperatur P%(_T-Raum)³¹ zu berechnen:
      
      wobei P%(T-Körper) die in Schritt 4.3.3 gewählte physiologisch relevante Gasphasenkonzentration ist, der_T-Raum 25 °C und der_T-Körper 37 °C beträgt.
   5. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um das Gasvolumen aus dem Lagergasbeutel,_V-Vorrat, zu bestimmen, das der Isofluranlösung hinzugefügt werden soll.
      
      wobei V-Lösung das Volumen von eACSF im ISOFLURAN-Beutel (300 ml) ist, P%(_T-Raum) aus Gleichung (2) eingegeben wird, λ der Salz-/Gas-Ostwald-Verteilungskoeffizient von Isofluran (λ = 1,2³²) und P%stock die Gasphasenkonzentration des Standardgasbeutels ist (P%_stock = 3,0%).
   6. Fügen Sie dem Isofluran-Lösungsbeutel das in Schritt 4.3.5 berechnete Gasvolumen aus dem Vorratsgasbeutel_{V hinzu}.
   7. Fügen Sie dem Isofluran-Lösungsbeutel ein Volumen von 95% O 2/5% CO_2-Gasgemisch hinzu, um das Gesamtvolumen des Gases im Isofluran-Lösungsbeutel auf 300 ml zu erhöhen.
4. Schütteln Sie sowohl Kontroll- als auch Isofluranbeutel mindestens 1 Stunde lang auf dem Shaker, um das Isofluran-Phasengleichgewicht zu ermöglichen.
5. Nachdem alle Daten gesammelt wurden, kann die korrekte Konzentration überprüft werden, indem ein Anästhesiegasmonitor verwendet wird, um die äquilibrierte Gaskonzentration von Isofluran über der verbleibenden Lösung im Beutel zu messen.
6. Geben Sie experimentelle Konzentrationen flüchtiger Gase in wässrigen Einheiten an, da Millimolarkonzentrationen robuster gegenüber Temperaturänderungen sind. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Gasphasenkonzentration bei Raumtemperatur, P%(_T-Raum), in äquivalente wässrige Konzentration (C_wässrig, in mM)³¹ umzurechnen:
   
   wobei α der Salz-Gas-Bunsen-Verteilungskoeffizient für Isofluran bei 25 °C³² ist.

5. Vorbereitung von Hard- und Software für Mehrkanalaufnahmen

1. Richten Sie ein 16-Kanal-Datenerfassungssystem gemäß Herstelleranweisungen ein.
   HINWEIS: Mehrere handelsübliche Verstärker und Datenerfassungssysteme können verwendet werden, um Mehrkanalaufnahmen zu sammeln. In den hier beschriebenen Experimenten werden analoge Signale über ein Elektroden-Referenzpanel an zwei Verstärker geliefert, wo sie verstärkt (2000x) und gefiltert (0,1-10kHz) werden. Analoge Eingänge zum Datenerfassungssystem werden mit 40kHz digitalisiert.
2. Befestigen Sie den entsprechenden 16-Kanal-Headstage-Adapter an einem Mikromanipulator des Mikroskops. Richten Sie den Adapter so aus, dass die Buchsenanschlüsse nach unten zeigen.
3. Stellen Sie den Betriebswinkel dieses Mikromanipulators so ein, dass er in einem Winkel von etwa 70° relativ zur Horizontalen nach unten zur Aufnahmekammer ausgerichtet ist.
4. Verbinden Sie den Headstage-Eingang mit einer 16 x 1-Sonde für die In-vitro-Elektrophysiologie über den am Mikromanipulator verankerten Headstage-Adapter.
5. Schließen Sie den Headstage-Ausgangsanschluss an das Datenerfassungssystem an.
6. Installieren Sie geeignete Software zur Datenerfassung. Konfigurieren Sie 15 Eingangskanäle so, dass sie den Eingangssignalen der ersten 15 mehrkanaligen Tastkontakte entsprechen. Konfigurieren Sie den verbleibenden Kanal so, dass er Eingaben von der intrazellulären Elektrode empfängt.
   HINWEIS: Achten Sie beim Sammeln und Analysieren von Daten darauf, Elektroden- und Adapterzuordnungen zu berücksichtigen, um sicherzustellen, dass das entsprechende Signal dem Elektrodenkontakt entspricht, von dem es erfasst wurde.

6. Konfiguration von Lichtstimulationsprotokollen

1. Richten Sie das Lichtabgabesystem ein und installieren Sie die zugehörige Software.
2. Öffnen Sie die Software. Wählen Sie eine Hardware-Verdrahtungskonfiguration, bei der eine Triggerquelle (Digital/TTL Out) das Trigger-In-Signal an das Lichtabgabesystem und das Lichtabgabesystem das Trigger-Out-Signal an eine 470-nm-LED liefert.
3. Montieren Sie Hochleistungsobjektiv. Verwenden Sie eine Digitalkamera, kalibrieren Sie das Hochleistungsobjektiv für die Verwendung mit dem Lichtabgabesystem.
4. Erstellen Sie eine neue Profilsequenz von Lichtstimulationsprofilen.
   1. Erstellen Sie ein Muster Ihrer Wahl. In den hier beschriebenen Experimenten wird ein Kreis mit einem Durchmesser von 150 μm verwendet, um eine schichtspezifische Aktivierung von Axonterminals zu ermöglichen.
   2. Um eine Profilsequenz zu erstellen, kopieren Sie dieses Profil und fügen Sie es für jede beliebige Anzahl von Tests ein.
   3. Erstellen Sie eine Wellenformliste, die Wellenformen beliebiger Lichtintensität, Pulsdauer oder Pulszahl enthält.
   4. Weisen Sie jedem Profil nach dem Zufallsprinzip Wellenformen zu. Jedes Profil mit seiner zugewiesenen Wellenform entspricht einem Triggerimpuls von einem digitalen TTL-Eingang oder einem Versuch.
   5. Speichern Sie die Profilsequenz.
5. Erstellen Sie in der Datenerfassungssoftware ein neues Protokoll.
   1. Stellen Sie die Anzahl der Versuche so ein, dass sie der Anzahl der Profile in der soeben erstellten Profilsequenz entspricht.
   2. Wählen Sie die Signaleingänge entsprechend den in Schritt 5.6 konfigurierten aus. Konfigurieren Sie ein Protokoll, das einen einzelnen digitalen TTL-Ausgang bereitstellt und von diesen 16 Eingangskanälen für eine angemessene Zeit vor und nach dem digitalen Trigger aufzeichnet.

7. Platzieren einer Mehrkanalsonde in einer ex vivo Hirngewebescheibe

1. Perfusion sprudelte eACSF (nicht in versiegelten Beuteln) bei 3-6 ml/min.
2. Übertragen Sie die Gehirnscheibe mit dem interessierenden Bereich auf das Netzgitter in der Mikroskopperfusionskammer. Anker mit Platinharfe (siehe ergänzende Abbildung 3).
3. Drehen Sie das Netzgitter so, dass die Linie der Elektrodenkontakte am distalen Ende der Mehrkanalsonde annähernd senkrecht zur Pialoberfläche verläuft.
4. Senken Sie die Mehrkanalsonde unter Breitfeldbeleuchtung und unter feiner Kontrolle des Mikromanipulators in Richtung der Oberfläche der Scheibe ab.
5. Drehen Sie den Filterwürfelrevolver, um den geeigneten Filterwürfel für die Visualisierung des fluoreszierenden Reporterproteins zu aktivieren, das in Axonterminals kortikaler Afferenzen exprimiert wird. Drehen Sie ggf. die Scheibe, um die Sonde genauer an der Pialoberfläche auszurichten.
6. Positionieren Sie die Sonde knapp über der Ebene der Scheibe, ~200 μm kurz vor der endgültigen Zielposition entlang der x-Achse, wobei mindestens ein Kanal außerhalb der Grenze des aufgezeichneten Gewebebereichs verbleibt
7. Führen Sie die Sonde langsam in die Scheibe ein, indem Sie den Manipulator entlang seiner Längsachse bewegen. Um Schäden am Gewebe zu minimieren, bewegen Sie die Sonde nur so weit, dass die scharfen Spitzen gerade noch unter der Gewebeoberfläche sichtbar sind. Dies minimiert die Schädigung des Gewebes und stellt gleichzeitig sicher, dass die Elektrodenkontakte mit dem Gewebe in Kontakt stehen.

8. Patch-Klemmen gezielter Neuronen und Erzielen einer Ganzzellkonfiguration

1. Schalten Sie die eACSF-Quelle auf eine verpackte Steuerungslösung um.
2. Identifizieren Sie fluoreszierend markierte Zellen für eine gezielte Patch-Clamp-Aufnahme.
   1. Beschränken Sie die Blendenblende auf den kleinsten Durchmesser. Setzen Sie ein Low-Power-Objektiv ein und bringen Sie das Gewebe in den Fokus.
   2. Zentrieren Sie das Licht über einen Gewebebereich, der an die Mehrkanalsonde angrenzt (aber nicht überlappt).
   3. Setzen Sie das Hochleistungs-Wassertauchobjektiv (40x oder 60x) ein und vermeiden Sie vorsichtig den Kontakt zwischen der Mehrkanalsonde und der Objektivlinse.
   4. Drehen Sie den Filterwürfelrevolver, um den entsprechenden Filtersatz zu aktivieren, um die Abbildung von Zellen zu ermöglichen, die Cre-abhängige Fluoreszenzmarker exprimieren.
   5. Identifizieren Sie eine fluoreszierend markierte Zelle als Ziel für die Patch-Clamp-Aufzeichnung. Heben Sie die Objektivlinse an, um ausreichend Platz zum Absenken einer Patch-Pipette zu schaffen.
3. Legen Sie eine Patchpipette (siehe Tabelle 1) mit interner Lösung (Tabelle 2) ein und montieren Sie die Pipette in den Elektrodenhalter. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um einen positiven Druck anzulegen, der ~ 0,1 ml Luft entspricht.
4. Untere Patchpipette in die Lösung. Bringen Sie die Pipettenspitze unter visueller Anleitung in den Fokus.
5. Erhalten Sie eine Ganzzellaufzeichnung von der Zielzelle unter Verwendung der zuvor gezeigten Schritte³³.
6. Wenn Sie Änderungen der intrinsischen Eigenschaften der Zelle (z. B. Eingangswiderstand, Aktionspotentialfeuerrate als Reaktion auf aktuelle Schritte) bewerten möchten, führen Sie diese Aufzeichnungen durch. Andernfalls wechseln Sie zum Axon-Stimulationsprotokoll unten.

9. Schichtspezifische optogenetische Aktivierung von Axonterminals

1. Bearbeiten Sie das Sichtfeld in der x-y-Ebene, um das Lichtstimulationsprofil an der gewünschten Position auf der Scheibe auszurichten.
2. Laden Sie das Lichtstimulusprotokoll und bereiten Sie das Lichtabgabesystem so vor, dass es einen digitalen TTL-Impuls empfängt.
3. Optogenetisch aktivieren Axonterminals und erfassen gleichzeitig extrazelluläre Feldpotentiale und intrazelluläre Membranfluktuationen.
4. Schalten Sie die eACSF-Quelle auf Isofluran-Lösung um und waschen Sie das Medikament für 15 Minuten ein. Sammeln Sie ggf. spontane Aufnahmen während des Waschvorgangs.
5. Wiederholen Sie Schritt 9.2-9.3.
6. Schalten Sie die eACSF-Quelle auf Kontrolllösung um und waschen Sie das Medikament für 20 Minuten aus. Sammeln Sie bei Bedarf spontane Aufnahmen während des Auswaschens.
7. Wiederholen Sie Schritt 9.2-9.3.

Results

Eine Zeitachse der im Protokoll beschriebenen Schritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Kortikale Inputs, die aus kortikalen Bereichen höherer Ordnung oder aus nicht-primären Thalamuskernen kommen, haben teilweise überlappende terminale Felder in Schicht 1 des nicht-primären visuellen Kortex²⁴. Um unabhängige thalamokortikale oder kortikokkortikale afferente Signalwege zu isolieren, wurde ein viraler Vektor, der ChR2 und einen eYFP-Fluoreszenzreporter enthält, entweder...

Discussion

In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur Bewertung intra- und extrazellulärer Reaktionen auf selektiv aktivierte afferente Signalwege in ex vivo Hirnschnitten beschrieben.

Die Verwendung optogenetischer Werkzeuge und paralleler Aufzeichnungsschemata ermöglicht es Forschern, Reaktionen lokaler Populationen auf afferente Eingaben aus entfernten Hirnregionen zu untersuchen und gleichzeitig von Zielpopulationen von Interneuronen aufzuzeichnen. Durch den Einsatz optogenetischer Technologie könne...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5x Weitfeld-Objektiv	Olympus	MPLFLN2,5x
40x Wasser-Immersionsobjektiv	Olympus	LUMPLFLN40XW
95% O2/5% CO2-Gemisch	Airgas	Z02OX95R2003045
A16 Sonde	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	16-Kanal Sonde
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core
Anästhesiegasmonitor (POET II)	Criticare	602-3A
ATP, Magnesiumsalz	Sigma Aldrich	A9187	intrazelluläre Lösung
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	The Jackson Laboratory	007914	Cre-abhängige tdTomato-Maus
B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J	The Jackson Laboratory	008069	PV-Cre Maus
Bauchtänzerin	Shaker Thomas Scientific	1210H86-TS	zur Äquilibrierung von versiegelten Gasbeuteln
Betadine-Lösung	Generische Marke
Bleiche	Generische Marke		für Silberchlorid-Patch-Klemmelektrode
Bupivicain
Calciumchlorid (CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
Kapillarglas (Patch-Clamp-Aufnahmen)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	Borosilikat, ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm, Länge: 90,0 mm
Kapillarglas (Virusinjektionen)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3,5"
Steuerung des Junior-Mikromanipulators	Luigs und Neumann	SM8	zur Steuerung des Junior-Mikromanipulators
Steuerung der Manipulatoren und des Schalttisches	Luigs und Neumann	SM7	zur Steuerung der Mehrkanal-Elektrode und Schalttisch
Digidata 1440A + Clampex 10	Molecular Devices	1440A	Digitizer und Software
E-3603 Schlauch	Fisher Scientific	14171208	für die Abgabe eines 95%igen O2/5%igen CO2-Gasgemisches in die Inkubationskammer + Druckausübung während der Patch-Klemmung
EGTA	Dot Scientific	DSE57060	intrazelluläre Lösung
ERP-27 EEG-Referenz/Patchpanel	Neuralynx	Retired
Füllnadel	World Precision Instruments	50821912	zum Befüllen von Patch-Clamp-Pipetten
Filterwürfel für die Bildgebung EYFP	Olympus	U-MRFPHQ
Filterpapier	Fisher Scientific	09801E	Lege über die Schichtschablone während der Vorbereitung eines Gewebeblocks
Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument	P-1000	2,5x2,5 Box Filament
Gasdispersionsröhrchen	Sigma Aldrich	CLS3953312C
Glasspritze (100 mL)	Sigma Aldrich	Z314390	zum Befüllen von gasversiegelten Beuteln
Gluconsäure, Kaliumsalz (K-Gluconat)	Dot Scientific	DSG37020	intrazelluläre Lösung
Glucose	Dot Scientific	DSG32040	ACSF
GTP, Natriumsalz	Sigma Aldrich	G8877	intrazelluläre Lösung
Headstage-Sondenadapter	NeuroNexus	A16-OM16	Adapter zum Anschluss der 16-Kanal-Sonde an den Headstage-Eingang
Hämostatische Pinzette	VWR International	76192-096
HEPES	Dot Scientific	DSH75030	ACSF, intrazelluläre Lösung
HS-16 Headstage	Neuralynx	Pensionierter
Isofluran	Patterson Veterinary	07-893-1389
Isopropylalkohol (70%)	VWR International	101223-746
Junior Mikromanipulator	Luigs und Neumann	210-100 000 0090-R	zur Manipulation der Patch-Clamp-Elektrode
LED-Lichtquellensteuerungsmodul	Mightex	BLS-PL02_US	optogenetische Lichtquellensteuerung
Lidocain
Lynx-8 Verstärker	Neuralynx	Retired
Lynx-8 Netzteil	Neuralynx	Retired
Magnesiumsulfat (MgSO4)	Dot Scientific	DSM24300	ACSF
mCherry, Texas Roter Filterwürfel	Chroma	49008	für die Bildgebung tdTomate fluoreszierender Reporter
Meloxicam
Mikropipettenhalter	Fisher Scientific	NC9044962
Mikrospritzenpumpe	World Precision Instruments	UMP3-4
Mineralöl	Generische Marke
MultiClamp 700A	Molecular Devices/Axon Instruments	700A	Verstärker
Stickstoff (für Lufttisch)	Airgas	NI200
Nylonnetz	Fisher Scientific	501460083	über Hufeisen aus abgeflachtem Platindraht gespannt, Scheibenauflage darauf während der
Aufnahmen Nylon, aus Strumpfhose geschnitten	Generisches		Markenstück, um eine Scheibenplattform in der Inkubationskammer zu schaffen, einzelne Fasern zur Herstellung von Platinharfe
Ophthalmische Salbe	Fisher Scientific	NC1697520
Pipette	Dot Scientific	307	Für die Übertragung von Gewebe auf das Rig
Platindraht	VWR International	BT124000	2 cm, abgeflacht, zur Herstellung von Platinharfe
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000	optogenetisches Lichtabgabesystem, wird mit der PolyScan2-Software
Kaliumchlorid (KCl)	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
Kaliumphosphat (KH2PO4) geliefert	Dot Scientific	DSP41200	ACSF
Rasierklinge	Fisher Scientific	12-640
Saphirklinge (für Vibratom)	VWR International	100492-502
Skalpellklinge	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-361445
Versiegelter Gasbeutel	Fisher Scientific	109236
Verschiebungstisch für Mikroskop	Luigs und Neumann	380FMU
Natriumbicarbonat (HCO3-)	Dot Scientific	DSS22060	ACSF
Natriumchlorid (NaCl)	Dot Scientific	DSS23020	ACSF, intrazelluläre Lösung
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)	Das Jackson Laboratory	013044	SOM-Cre Maus
Stereotaktisches Instrument	Kopf	Modell 902	Dual Small Animal
Sekundenkleber	Klammern	886833	zur Fixierung des Gewebeblocks auf dem Probenstadium während der Schnittvorbereitung
Chirurgischer Bohrer	RAM Products Inc.	DIGITALMICROTORQUE	Microtorque II
Spritze (1 mL) mit LuerLock-Spitze	Fisher Scientific	309628	für die Druckausübung beim Patch-Spannen
Spritze (1 mL) mit Gleitspitze	WW Grainger, Inc.	19G384	zum Befüllen von Patch-Clamp-Pipetten
Spritzenfilter	VWR International	66064-414
Aufrechte Mikroskope	Olympus	BX51
Vibrierendes Mikrotom	Leica Biosystems	VT1000S
Wypall Handtücher	Fisher Scientific	19-042-427