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Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli mit Zwei-Farben-Einmolekülfluoreszenz in Situ-Hybridisierung

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DOI:

10.3791/61520

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30. Juli 2020

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1Department of Physics, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Center for the Physics of Living Cells, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Anwendung der einmolekularen Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (smFISH), um die In-vivo-Kinetik der mRNA-Synthese und -Degradation zu messen.

Zusammenfassung

Die Single-Molekül-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (smFISH) ermöglicht die Zählung der absoluten Anzahl von mRNAs in einzelnen Zellen. Hier beschreiben wir eine Anwendung von smFISH zur Messung der Transkriptionsraten und mRNA-Abbauraten bei Escherichia coli. Da smFISH auf festen Zellen basiert, führen wir smFISH zu mehreren Zeitpunkten während eines Zeitverlaufsexperiments durch, d.h. wenn Zellen bei Induktion oder Unterdrückung der Genexpression synchronisierte Veränderungen durchlaufen. Zu jedem Zeitpunkt werden Subregionen einer mRNA spektral unterschieden, um Transkriptionsdehnung und vorzeitige Beendigung zu sonden. Das Ergebnis dieses Protokolls ermöglicht auch die Analyse der intrazellulären Lokalisierung von mRNAs und Heterogenität in mRNA-Kopierzahlen zwischen Zellen. Mit diesem Protokoll können viele Samples (50)) innerhalb von 8 h verarbeitet werden, wie die Zeit, die für nur wenige Proben benötigt wird. Wir besprechen, wie dieses Protokoll angewendet werden kann, um die Transkriptions- und Abbaukinetik verschiedener mRNAs in Bakterienzellen zu untersuchen.

Einleitung

Der Fluss genetischer Informationen von DNA zu mRNA und Protein ist einer der grundlegendsten zellulären Prozesse, dessen Regulierung für die zelluläre Fitness wichtig ist1. Die Anzahl der mRNAs in einer Zelle wird durch zwei dynamische Prozesse bestimmt, Transkription und mRNA-Abbau. Wie Transkription und mRNA-Abbau in Zeit und Raum einer einzelnen Zelle reguliert werden, bleibt jedoch nicht vollständig verstanden, was vor allem auf den Mangel an experimentellen Methoden zur quantitativen Messung ihrer Kinetik in vivo zurückzuführen ist.

Methoden, die auf der Gesamtanzahl der mRNAs basieren, die aus einer Population von Zellen extrahiert wurden, wie Northern Blot, RT-PCR, RNA-Sequenzierung und Genexpressionsmikroarrays, können den relativen Unterschied in mRNA-Spiegeln messen und wurden weit verbreitet, um die Rate der Transkriptionsdehnung2,3,4,5 oder die Rate des mRNA-Abbaus6,7zu analysieren. Sie liefern jedoch nicht die absolute Anzahl von mRNAs pro Zelle, und daher sind sie nicht geeignet, die Rate der Transkriptionsinitiierung zu untersuchen8. Da mRNAs aus einer Zellgesamtheit extrahiert werden, können die räumliche Verteilung von mRNAs innerhalb einer einzelnen Zelle und die Variabilität der mRNA-Kopierzahlen zwischen den Zellen nicht gemessen werden.

Die RNA-Sequenzierung der nächsten Generation an einzelnen Zellen (scRNAseq) kann die Anzahl der mRNAs pro Zelle in einer genomischen Skala9quantifizieren. Aufgrund von Herausforderungen bei der Probenvorbereitung und hohen Kosten bleibt es jedoch schwierig, diese Technik zur Messung der Transkriptionskinetik zu verwenden. Insbesondere die Anwendung von scRNAseq auf Bakterien war aufgrund der geringen mRNA-Überfluss10,11technisch schwierig.

Die Einmolekülfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (smFISH) basiert auf der Hybridisierung fluoreszierend markierter einsträngiger Sonden, deren Sequenzen die Ziel-mRNA von Interesse12,13komplementär machen. Das Konzept der sequenzspezifischen Hybridisierung ähnelt dem, das in Northern Blot oder RT-PCR verwendet wird, aber die Hybridisierung erfolgt in situ innerhalb fester Zellen, um die native Lokalisierung von mRNAs zu erhalten. Das Signal einer einzelnen mRNA wird mit vielen Sonden verstärkt, die 20 Nukleotide (nt) in der Länge sind und mit verschiedenen Teilen einer mRNA hybridisieren (Abbildung 1A)13. Bei diesem "Kachel"-Sondenansatz legt die Anzahl der Sonden, die zum Nachweis einer einzelnen mRNA erforderlich sind, eine niedrigere Grenze für die Länge der mRNA fest, die untersucht werden kann. Alternativ kann die mRNA von Interesse transkriptionsweise zu einem nicht-kodierenden Array von Tandem-Lac-Operatorsequenzen verschmolzen werden, so dass mehrere Kopien einer fluoreszierend markierten LacO-Sonde zu einer einzigen mRNA hybridisieren (Abbildung 1B)14.

smFISH wurde verwendet, um die Anzahl der mRNAs pro Zelle im stationären Zustand zu quantifizieren (d. h. wenn Synthese und Zerfall im Gleichgewicht sind) und um den Mittelwert und die Variabilität von mRNAs zwischen Bakterienzellen15,16,17zu analysieren. Kürzlich wurde smFISH angewendet, um mRNA-Zahlen im nicht-stabilen Zustand zu quantifizieren, direkt nach der Induktion oder Unterdrückung der Genexpression in E. coli18,19,20. Die zeitlichen Veränderungen der absoluten mRNA-Kopierzahlen wurden dann verwendet, um die Rate der Transkriptionsinitiierung, Dehnung und Beendigung sowie die Rate des mRNA-Abbaus zu berechnen. Für diese Anwendung können herkömmliche smFISH-Verfahren umständlich sein, da es viele Proben gibt, die jeweils einen Zeitpunkt darstellen und mehrere Pufferaustauschschritte durchlaufen müssen (z. B. Zentrifugation und Waschen). Hier beschreiben wir ein smFISH-Protokoll, bei dem die Probenhandhabungsschritte drastisch vereinfacht werden, indem Zellen an der Oberfläche eines Deckellipss haften und Flüssigkeiten mit einem Vakuumfiltrationssystem14,19anhaften. Am Beispiel der Expression von lacZ in E. coli wird der vollständige Arbeitsablauf (Abbildung 2) demonstriert, einschließlich der Bildanalyse ( Abbildung3), die die In-vivo-Kinetik der Transkription (Initiierung, Dehnung und Beendigung) und den mRNA-Abbau, die Zell-zu-Zell-Variabilität in der mRNA-Expression und die mRNA-Lokalisierung ergibt. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll weithin auf die In-vivo-Kinetik und Lokalisierung anderer mRNAs in verschiedenen Bakterienarten anwendbar ist.

Protokoll

1. Herstellung von smFISH-Sonden

HINWEIS: Um smFISH-Sonden mit einem einzigen Fluorophor zu kennzeichnen, befolgen Sie ein Standardprotokoll zur Kennzeichnung von Nukleinsäure-Oligonukleotiden auf Basis der NHS-Esterchemie21.

  1. Design smFISH Sonden. Entscheiden Sie, ob "Kachelsonden" oder "Array"-Sonden (Abbildung 1) für das gen von Interesse verwendet werden sollen. Im Abschnitt "Diskussion" finden Sie die Entscheidung.
    1. Verwenden Sie für "Kachel-Sonden" (Abbildung 1A) ein Online-Sonden-Designer-Tool (z. B. Tabelle der Materialien).
    2. Führen Sie für "Array"-Sonden (Abbildung 1B) eine BLAST-Sequenzsuche durch, um sicherzustellen, dass die Sondensequenz nicht zu anderen mRNA-Sequenzen komplementär ist.
    3. Um die lacZ mRNA-Transkription und Abbaukinetik zu untersuchen, verwenden Sie zwei Sätze von 24 Sonden, die jeweils die ersten und letzten 1 kb Regionen von lacZ (3.072 bp)19abdecken.
      HINWEIS: Diese Sondensätze werden im Folgenden als "5' mRNA-Sonde" bzw. "3' mRNA-Sonde" bezeichnet. Sequenzen dieser Sonden sind in der Materialtabelleaufgeführt.
  2. Ordnen Sie Sondensequenzen als DNA-Oligonukleotide mit einem C6-Aminolinker am 5'-Ende an. Einzelne Sonden in Wasser auf 1 mM auflösen.
  3. Kombinieren Sie äquimolare Mengen von Sonden für "5' mRNA-Sonde" und "3' mRNA-Sonde"-Sets. Zum Beispiel, für die 5' mRNA-Sonde für lacZ,kombinieren 20 l jeder Sonde (insgesamt 24 Arten von Sonden in der Menge).
  4. Führen Sie Ethanolfällung22 der kombinierten Sonden durch, um Verunreinigungen von primären und sekundären Auminen (wie Tris, Glycin und Ammoniumsalze) zu entfernen, die die Konjugationsreaktion hemmen können. Lösen Sie am Ende das DNA-Pellet in 100 l Wasser (was 4,5 mM DNA in einem Sondensatz ergibt).
    HINWEIS: Dieser Schritt wird auch dann empfohlen, wenn die Sonden vom Hersteller einer Standard-Entsalzung unterzogen werden. Eine Standard-Filter-basierte Reinigung kann anstelle und zusätzlich zur Ethanolfällung funktionieren.
  5. Wählen Sie zwei spektral unterschiedliche Fluorophore mit einem monofunktionellen NHS Ester-Moiety, so dass 5' und 3' mRNA-Sondensätze differenziell gekennzeichnet werden können. Bereiten Sie beispielsweise Cy5 NHS Ester für 5' mRNA-Sonden und Cy3B NHS Ester für 3' mRNA-Sonden vor. Lösen Sie jede Art von Fluorophoren in wasserfreiem DMSO bis zu endgültigen 20 mg/ml (ca. 25 mM).
  6. 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,5) direkt vor jeder Etikettierungsreaktion vorbereiten. Die Luftexposition für eine lange Zeit wird den pH-Wert senken und die Etikettiereffizienz verringern.
  7. Für die Konjugationsreaktion folgendes kombinieren: 15 l des Cy5-Fluorophorbestands (ab Schritt 1,5), 4 l 5' mRNA-Sondensatz (ab Schritt 1.4), 75 l Natriumbicarbonat (ab Schritt 1,6) und 7 l Wasser. Das Rohr mit Aluminiumfolie umwickeln und bei Raumtemperatur für 3-6 h schütteln.
    HINWEIS: Eine längere Inkubation führt nicht unbedingt zu einer höheren Kennzeichnungseffizienz. Auch kann die Reaktion nach oben oder unten skaliert werden, wenn die Konzentrationen der Komponenten beibehalten werden.
  8. Wiederholen Sie den obigen Schritt für den 3' mRNA-Sondensatz und das entsprechende Fluorophor (d. h. Cy3B NHS-Ester).
  9. Führen Sie Ethanolfällung22 durch, um unreagierte Farbstoffmoleküle zu entfernen. Lösen Sie das Pellet in einem TE-Puffer von 50 l (10mM Tris-HCl pH 8.0 mit 1mM EDTA).
  10. Schätzen Sie die Konzentrationen von DNA und Fluorophor mithilfe eines UV-Vis-Spektrometers.
    1. Messen Sie die Absorption bei 260 nm und 559 nm (Cy3B) oder 649 nm (Cy5). Wenn die Probe zu konzentriert ist, um eine genaue Messung zu ergeben, verdünnen Sie 1 l der Probe auf 10 l.
    2. Konvertieren Sie die Absorption in die Konzentration:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
      figure-protocol-3
      εDNA = 0,2 m-1 (für 20-nt einsträngige DNA), εCy5 = 0,25 m-1und εCy3B = 0,13 m-1
      HINWEIS: [DNA] ist die Konzentration der gesamten Sonden innerhalb der Lösung. Die Konzentration der einzelnen Sonden ist etwa 24x niedriger. Die Konzentration der Gesamtsonden wird ab diesem Zeitpunkt als "Sondenkonzentrationen" verwendet. Wenn das Verhältnis zwischen [DNA] und [Dye] 1 ist, kann der folgende HPLC-Schritt23übersprungen werden, und die Probe sollte im TE-Puffer auf den endgültigen 4-5-M-Puffer verdünnt werden.
  11. (Empfohlen) Reinigen Sie die beschrifteten Sonden mit HPLC von unbeschrifteten Sonden und freien Farbstoffen.
    HINWEIS: Obwohl dieser zusätzliche Reinigungsschritt zum Verlust der Probe führt, ist er für die nachgelagerten Anwendungen von Vorteil. Die Entfernung von nicht beschrifteten DNA-Sonden wird das Fluoreszenzsignal von mRNA-Zielen erhöhen und die Entfernung von unreagierten Farbstoffen wird die Hintergrundfluoreszenz reduzieren.
    1. Bereiten Sie HPLC mit einer Standard-Analytischen C18-Säule, 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA) als Puffer A und Acetonitril als Puffer B vor.
    2. Fügen Sie dem Beispiel 1 M TEAA hinzu (ab Schritt 1.9), um 0,1 M TEAA zu erstellen.
    3. Stellen Sie das Gradientenprogramm wie folgt ein: 0-5 min mit 0% B, 5-35 min mit einem linearen Gradienten von B von 0-30%, 35-37 min mit einem linearen Gradienten von 30-100% von B und 37-40 min mit 0% B. Halten Sie die Durchflussrate bei 0,1 ml/min und zeichnen Chromatogramme bei 260 und 649 nm (für die Cy5-markierten Proben) oder bei 260 und 559 nm (für die Cy3B-markierten Proben).
    4. Sammeln Sie die eluierte Probe, wenn die Absorption sowohl in DNA- als auch fluorophor-Kanälen zunimmt.
    5. Konzentrieren Sie die eluierte Probe mit einem Vakuumkonzentrator und setzen Sie das Pellet in einem 50-100-L-TE-Puffer wieder auf.
  12. Überprüfen Sie die Konzentration von DNA und Fluorophor mit einem UV-Vis-Spektrometer (siehe Schritt 1.10). Verdünnen Sie ggf. die Endkonzentration um 4-5 m. Lagern Sie die Sonden bei -20 °C

2. Vorbereitung von Lösungen

  1. Bereiten Sie eine große Menge an DEPC-behandeltem Wasser und Puffern vor (Tabelle 1). Diese Lösungen können bei Raumtemperatur über ein Jahr halten.
  2. Vorbereiten 4x Befestigungslösung und Waschlösung (Tabelle 1).
  3. Vorbereiten der Vorhybridisierungslösung und der Sondenhybridisierungslösung (Tabelle 1). Bereiten Sie die Sondenhybridisierungslösung während der Inkubation in Schritt 5.1 oder Schritt 6.1 vor und bewahren Sie die Lösung dann in einem 37 °C-Arbeitsplattenshaker für 20-40 min mit einer Abdeckung auf, um die Lichteinwirkung zu minimieren.
    HINWEIS: Die Konzentrationen von Formamid, SSC und lacZ Sonde wurden für die lacZ-Sondensätze optimiert, um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren und gleichzeitig das reale Signal zu maximieren. Im Abschnitt Diskussion finden Sie Details zum Ändern dieser Konzentrationen für verschiedene Anwendungen.

3. Herstellung von Abdeckungen und Glasgletten

  1. Reinigen Sie Abdeckungen und Glasrutschen.
    1. Platzieren Sie einzelne Coverlips und Dias mit Zangen in einem Coplin-Glas. Stellen Sie sicher, dass die Abdeckungen und Folien getrennt sind und sich nicht berühren.
    2. Füllen Sie das Glas mit 100% Ethanol und schließen Sie den Deckel. Legen Sie das Glas in ein Wasserbad Ultraschallreiniger und beschallen Sie für 15-20 min.
      HINWEIS: Für den Beschallungsgerät wasserbadistieren, wird empfohlen, die Heizungsfunktion auszuschalten.
    3. Ethanol ausgießen und mit Reinstwasser 3-4x waschen. Verwenden Sie Wasser, das direkt aus der Wasseraufbereitungsmaschine fließt.
    4. Gießen Sie das Wasser aus dem Glas und füllen Sie es mit 70% Ethanol. Schließen Sie den Deckel und führen Sie die Beschallung für 15-20 min durch und waschen Sie mit Reinstwasser.
    5. Füllen Sie das Glas mit reinem Wasser und beschallen Sie für 15-20 min.
      HINWEIS: Coverlips und Glasrutschen können über Nacht im mit Reinstwasser gefüllten Coplin-Glas aufbewahrt werden.
    6. Nehmen Sie eine Rutsche oder einen Deckelrutsch aus dem Coplin-Glas mit sauberen Zangen und blasen Sie es mitN2-Gas. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Folien und Abdeckungen.
  2. Legen Sie die getrockneten Dias in eine saubere Aufbewahrungsbox, bis sie in Schritt 7.5 verwendet werden. Legen Sie die getrockneten Deckelinen in eine leere 1.000-L-Pipettenspitzenbox, die im verbleibenden Verfahren als "Kammer" dient.
  3. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Marker Kreise auf den Abdeckungen nach kreisförmigen Löchern im Pipettenspitzenkasten. Diese Kreise (durchmesser: 0,5 cm) dienen als "Wells". Warten Sie mindestens 5-10 min, bis der Marker vollständig getrocknet ist.
    HINWEIS: Halten Sie den Deckel der Spitzenbox immer geschlossen.
  4. Tragen Sie einen 20-L-Tropfen von 0,1% Poly-L-Lysin auf jeden Brunnen auf. 10-50 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Passen Sie diese Lautstärke entsprechend der Brunnengröße an. Stellen Sie sicher, dass die Lösung den Brunnenbereich vollständig abdeckt. Achten Sie bei längerer Inkubation darauf, Verdunstung zu vermeiden.
  5. Nach der Inkubation aspirieren Poly-L-Lysin, ohne die Oberfläche zu berühren, da dies das Poly-L-Lysin abkratzen wird. Dann tragen Sie einen Tropfen (ca. 20 l) DEPC-Wasser auf die poly-L-Lysin behandelten Brunnen auf. Schließen Sie den Deckel der "Kammer", um Verdunstung bis Schritt 5.1 zu verhindern.

4. Zeitverlaufsexperiment und Probenfixierung

  1. Wachsen Sie E. coli-Zellen in einer Flüssigkultur von 20 ml in einem 250-ml-Kolben. Den Kolben in einem Wasserbad-Shaker (30 °C) aufbewahren und weiter schütteln. Stoppen Sie den Shaker nur, wenn Sie Proben nehmen.
    HINWEIS: Die in diesem Papier vorgestellten Ergebnisse stammen aus MG1655-Zellen, die in M9-Minimalmedium angebaut werden, ergänzt mit 0,2 % Glycerin, 0,1 % Kasaminosäuren und 1 mg/L Thiamin zu einer exponentiellen Wachstumsphase (OD6000,2).
  2. Fügen Sie 250 l der 4x Befestigungslösung in ein leeres 1,5 ml Rohr. Wiederholen und bereiten Sie mehrere Rohre vor, so viele wie die zeitpunkte, die genommen werden sollen. Beschriften Sie die Rohre mit Zeitpunktzahlen und halten Sie sie bei Raumtemperatur.
  3. Nehmen Sie 750 l Zellkultur (OD6000,2), bevor Sie ein Zeit-Kurs-Experiment starten. Fügen Sie die Kultur zu einer Röhre hinzu, die für "Zeit Null" markiert ist (aus Schritt 4.2). Invertieren Sie das Rohr sanft, um Zellen mit der Befestigungslösung zu mischen.
    HINWEIS: Pipette nicht nach oben und unten, um die Zellen zu mischen, zu wirbeln oder "rau zu sein". Diese Stichprobe stellt den unterdrückten Zustand dar und wird als Steuerung verwendet, um die Fluoreszenzintensität einer einzelnen mRNA zu berechnen (siehe Schritt 9.4).
  4. Fügen Sie 0,02-1 mM Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranosid (IPTG) in die flüssige Kultur ein, um lacZ-Expression zu induzieren. Starten Sie an dieser Stelle einen Timer (t = 0 min) und proben Sie in einem bestimmten Zeitintervall (z.B. alle 1 min). Wiederholen Sie zum Sampling Schritt 4.3.
  5. Fügen Sie 5 mM Orthonitropheynl-β-D-Fucopyranosid (ONPF) oder 500 mM Glukose24 zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Zeitverlaufsexperiments (z.B. bei t = 1,5 min) hinzu, um die lacZ-Expression zu unterdrücken. Nach der erneuten Repression, weiterhin die Kulturen (Schritt 4.3) zu proben, um mRNA-Abbau zu verfolgen.
    ANMERKUNG: Repression kann auch mit einem Transkriptionsinitiationsinhibitor25durchgeführt werden.
  6. Zur Fixierung die Rohre mit probenbeprobten Zellen bei Raumtemperatur 15 min inkubieren, gefolgt von einer Inkubation im Eis für 30 min.
  7. Um Fixative zu entfernen, zentrieren Sie die Rohre bei 4.500 x g für 4 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, Formaldehyd gemäß dem Sicherheitsprotokoll in einem separaten Abfallbehälter zu entsorgen.
  8. Fügen Sie 1 ml DEPC-PBS hinzu, und setzen Sie die Zellen erneut aus. Zentrifugation wiederholen und 2x mehr mal wieder aufsuspensionen.
    HINWEIS: Feste Zellen sind zerbrechlich und müssen schonend behandelt werden. Das Pellet vorsichtig wieder aufhängen und Blasen vermeiden.
  9. Nach dem letzten Waschschritt werden die Zellen in einem DEPC-PBS von 30 L erneut suspendiert.

5. Permeabilisierung von Zellmembranen

  1. Tragen Sie jede Zeitpunktprobe auf verschiedene Bohrungen auf dem Deckbedeckungszettel auf (ca. 30 l pro Bohrung). Warten Sie 10-30 min bei Raumtemperatur, bis Zellen an der Oberfläche haften. Vermeiden Sie das Zusammenführen der flüssigkeitstropfen zwischen den Brunnen.
  2. Um ungebundene Zellen abzuspülen, saugen Sie die Flüssigkeit an und wenden Sie auf jeden Brunnen 20 L DEPC PBS an. DePC PBS innerhalb weniger Minuten aspirieren.
  3. Permeabilisieren Sie die Zellmembranen, indem Sie 15 l 70% Ethanol auf jeden Brunnen für 4 min auftragen. Das Ethanol nach 4 min ansaugen und sicherstellen, dass die Brunnen vollständig trocken sind.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Ethanolbehandlung auf 4 min zu begrenzen. Eine längere Behandlung führt zu einer Überpermeabilisierung.
  4. Tragen Sie 30 l der Waschlösung auf jeden Brunnen auf.

6. Probehybridisierung

  1. Aspirieren Sie die Waschlösung von jedem Brunnen. Tragen Sie 30 L der Vorhybridisierungslösung auf jeden Brunnen auf. Inkubieren Sie die Kammer im 37 °C-Ofen 30 min.
    HINWEIS: Fügen Sie 50 ml Wasser an den Boden der Kammer, um Feuchtigkeit zu gewährleisten.
  2. Aspirieren Sie die Vorhybridisierungslösung aus jedem Brunnen. Wenden Sie die Sondenhybridisierungslösung auf jeden Bohrwert auf. Die Kammer mit Aluminiumfolie bedecken und im 37 °C-Ofen 2 h bedecken.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Sondenhybridisierungslösung vor diesem Schritt im 37 °C-Arbeitsplattenshaker befindet. Vermeiden Sie das Zusammenführen von Flüssigkeiten zwischen Brunnen. Wenden Sie bei Bedarf ein kleineres Volumen der Lösung auf jeden Brunnen an.

7. Nachhybridisierung sanierung und Vorbereitung für die Bildgebung

  1. Mit einer Mehrkanalpipette, wenden Sie die Waschlösung auf jeden Brunnen auf einmal auf. Aspirieren und wiederholen Sie 3-5x Mal waschen. Inkubieren Sie die Kammer im 37 °C Ofen für 15-30 min.
  2. Wiederholen Sie Schritt 7.1 zwei weitere Male.
  3. Waschen Sie jeden gut mit DEPC-PBS 5x mal. Folgen Sie der in Schritt 7.1 verwendeten Methode, überspringen Sie jedoch den Inkubationsvorgang.
  4. Die Flüssigkeit aus dem Deckelschlupf absaugen. Tragen Sie 4 L DEPC-PBS auf jeden Brunnen auf.
  5. Heben Sie den Deckel mit Zange an und kippen Sie ihn, und legen Sie ihn vorsichtig über eine Glasrutsche (ab Schritt 3.2). Vermeiden Sie Blasen.
  6. Versiegeln Sie die Ränder des Deckels mit Silikon-Zahngummi.
  7. Warten Sie, bis das Zahnfleisch verfestigt ist. Man kann hier innehalten und die Rutsche über Nacht bei 4 °C lagern.
    HINWEIS: Andere smFISH-Protokolle schlagen vor, Sauerstoff-Aufräumreagen (z. B. Glukoseoxidase/Kataalase) hinzuzufügen oder ein kommerzielles Anti-Fade-Montagemedium14,26 zu verwenden, um die Photostabilität der Fluorophore zu erhöhen.

8. Bildgebung

  1. Um einen Interessenbereich zu finden, verwenden Sie den Live-Modus der Phasenkontrast-Bildgebung. Ändern Sie das Sichtfeld innerhalb eines Brunnens, indem Sie den Bühnen-Joystick manövrieren. Wählen Sie einen Bereich aus, in dem die Zelldichte optimal ist (d. h., es gibt viele Zellen, die meist getrennt sind). Passen Sie den Z-Fokus so an, dass Phasenkontrastzellenbilder im Fokus stehen.
  2. Erstellen Sie Schnappschüsse in der Reihenfolge von Cy5 (4-s-Exposition), Cy3 (2-s-Exposition) und Phasenkontrast (0,2-s-Exposition).
    HINWEIS: Cy3B-Farbstoffmoleküle werden im Cy3-Kanal abgebildet, und die Bilder werden als Cy3-Bilder bezeichnet.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 8.1-8.2, um Bilder von 10 verschiedenen Bereichen innerhalb eines Brunnens zu erfassen.
  4. Verschieben Sie das Ziel auf einen anderen Brunnen, und wiederholen Sie die Schritte 8.1-8.3.
  5. Exportieren Sie Bilder als TIFF-Dateien.
  6. (Optional) Bild-Mehrfarben-Perlen, die auf der Deckbedeckungsoberfläche in Cy5- und Cy3-Kanälen adsorbiert werden, um die räumliche Verschiebung zwischen Cy5- und Cy3-Kanälen für Bildregistrierungszwecke zu bestimmen.
    1. Tragen Sie eine mehrfarbige Fluoreszenz-Perlen (0,2 m Durchmesser) auf eine saubere Decksrutschoberfläche auf und warten Sie 10-30 min. Nach dem Waschen mit einem PBS von 50 l, geben Sie einen PBS-Wert von 5 l an und stecken Sie den Deckelmitrutsch mit einem Glasschlitten ein. Versiegeln und am Mikroskop montieren.
    2. Bildperlen in Cy5- und Cy3-Kanälen.

9. Bildanalyse

HINWEIS: Matlab-Code, der in diesem Schritt verwendet wird, ist auf der folgenden GitHub-Website verfügbar: https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020. Der GitHub-Ordner enthält alles, was für die Bildanalyse benötigt wird, einschließlich Parameterwerte für die Zellsegmentierung und Spot-Identifikation. Das Verfahren in diesem Schritt wird im Masterskript "FISHworkflow.m" näher erläutert.

  1. Öffnen Sie ein Zellsegmentierungswerkzeug, z. B. microbeTracker27 oder Oufti28, und laden Sie Phasenkontrastbilder. Wählen Sie "Unabhängige Frames" und drücken Sie eine Taste namens "Alle Frames", um den Segmentierungsprozess zu beginnen, aus dem Zellen identifiziert und ihre Konturen berechnet werden (Abbildung 3B,C).
    HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die Verwendung dieser Softwarepakete sind online verfügbar (z. B. oufti.org).
  2. Laden Sie Cy5-Fluoreszenzbilder in die spotFinder-Funktion von microbeTracker oder Oufti, und drücken Sie die Schaltfläche "Ausführen", um die Spot-Identifikation und Quantifizierung basierend auf 2D Gaussian Fitting zu beginnen (Abbildung 3B,C). Wiederholen Sie diesen Schritt für Cy3-Fluoreszenzbilder, um Flecken im Cy3-Kanal zu analysieren. In diesem Schritt wird eine Liste der Flecken in jeder Zelle erstellt, einschließlich ihrer Intensitäten und Koordinaten.
  3. (Optional) Filtern Sie abgezweite Flecken (falsche Positivmeldungen) mithilfe eines Schwellenwerts heraus, wie in der Datei FISHworkflow.m erläutert.
    HINWEIS: Untersuchen Sie fluoreszierende Flecken in der Negativkontrolle (z. B. MG1655 -lacZ) und bestimmen Sie den Schwellenwert, um falsch positive Werte herauszufiltern.
  4. Um die Spotintensität einer einzelnen mRNA zu erhalten, verwenden Sie eine Liste der zum Zeitpunkt Null gemessenen Punktintensitäten (vor dem Hinzufügen von IPTG) und passen die Verteilung der Spotintensitäten mit einem Gaußschen Gemischmodell mit zwei Mischungskomponenten an. Nehmen Sie die Spitzenposition der ersten Gaußschen Population (schwarze Linie in Abbildung 3D,E) als Spotintensität einer einzelnen mRNA. Führen Sie dies für Cy5-Spots und Cy3-Spots separat durch, um die Spotintensität einer einzelnen 5' und 3' lacZ mRNA zu erhalten.
    HINWEIS: Wiederholen Sie dies in jedem Zeitverlaufsexperiment, da die Spotintensität einer einzelnen mRNA in verschiedenen Experimenten leicht variieren kann.
  5. Teilen Sie die Fluoreszenzintensität eines Spots mit der Intensität einer einzelnen mRNA (ab Schritt 9.4), um die Anzahl der mRNAs innerhalb eines Spots zu erhalten. Summe normalisierte Spotintensitäten innerhalb einer Zelle, um die Gesamtzahl der mRNA in einer Zelle zu berechnen (Abbildung 3F). Führen Sie diese Berechnungen für 5' und 3' mRNA separat aus.
  6. Berechnen und zeichnen Sie die mittleren mRNA-Zahlen pro Zelle zu jedem Zeitpunkt (z. B. Abbildung 4B), und analysieren Sie die In-vivo-Kinetik der Transkription und den mRNA-Abbau aus der zeitlichen Veränderung der mittleren mRNA-Werte (Abbildung 4B).
    1. Um die Rate der Transkriptionsdehnung zu erhalten, führen Sie eine kleinste Quadrate Anpassung einer Linie an den anfänglichen Anstieg der 5' und 3' mRNA-Signale und identifizieren Abfangen zu den Basalebenen (Abbildung 4B). Der Unterschied zwischen diesen Abfangabschnitten gibt die durchschnittliche Zeit für RNAPs an, die von der 5' Sondenregion in die 3' Sondenregion reisen. Teilen Sie den Abstand zwischen zwei Prüfpunktsätzen (2 kb) mit dieser Zeit auf, um die durchschnittliche Rate der Transkriptionsdehnung zu erhalten.
    2. Um die Rate des mRNA-Abbaus zu erhalten, passen Sie eine exponentielle Zerfallsfunktion an den endgültigen Zerfallsbereich der 5' und 3' mRNA-Signale an (z. B. Abbildung 4B). Der Anpassungsparameter , b, ist die durchschnittliche mRNA-Lebensdauer.
  7. (Optional) Analysieren Sie die Zell-zu-Zell-Variation in der Genexpression (z. B. die Reaktion auf Zellebene auf die in Abbildung 4Cdargestellte Induktion), basierend auf der Verteilung der mRNA-Zahlen in jeder Zelle (berechnet in Schritt 9.5).
  8. (Optional) Analysieren Sie mithilfe von Informationen über die Spotposition entlang der Haupt- und Nebenachsen einer Zelle (aus Schritt 9.2) die Lokalisierung von mRNAs (Abbildung 4D,E).
  9. (Optional) Analysieren Sie die Co-Lokalisierung von 5' und 3' mRNAs (Abbildung 5) durch einen Vergleich der Lokalisierung von Spots, die in den Cy5- und Cy3-Kanälen erkannt wurden.
    1. Laden Sie Bilder von mehrfarbigen Perlen (Schritt 8.6) in der spotFinderF-Funktion in microbeTracker und erhalten Sie Koordinaten von Perlenzentroiden in Cy5- und Cy3-Kanälen. Verwenden Sie die Liste der Schwerpunktkoordinaten, um die affine Transformationsmatrix zu berechnen, die informiert, wie Cy5- und Cy3-Kanäle in Bezug auf einander verschoben und gedreht werden29.
    2. Wenden Sie die affine Transformationsmatrix auf Cy5- und Cy3-FISH-Bilder an, um Cy3-Bilder in der Cy5-Koordinate zu konvertieren. Klassifizieren, ob ein Spot mit einem anderen Spot in einem anderen Kanal kolokalisiert ist. Beispielsweise wird ein Punkt im Cy5-Kanal als mit einem anderen Punkt im Cy3-Kanal kolokalisiert betrachtet, wenn der Abstand zwischen ihren Schwerpunkten kleiner als 150 nm ist (Abbildung 5).
    3. Analysieren Sie, wie viele Cy5-Spots zu jedem Zeitpunkt als "kolokalisiert" mit Cy3-Spots klassifiziert werden. Analysieren Sie auch die Intensität der kolokalisierten Flecken (Abbildung 5).

Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder aus diesem smFISH-Protokoll. Ein vollständiges Sichtfeld (86,7 x 66,0 m mit unserem mikroskopischen Setup, das in der Tabelle der Materialienbeschrieben ist) zeigt, dass 500 E. coli-Zellen über das gesamte Feld verteilt sind (Abbildung 3A). Wenn die Dichte der Zellen viel höher ist als in diesem Bild dargestellt, wird die automatische Zellsegmentierung schwierig, da Segmentierungsalgorithmen einzelne Zellen nicht zuverlässig identifizieren, wenn Zellen sich gegenseitig berühren. Man muss die Konzentration der Zellen und die Inkubationszeit für die Oberflächenhaftung (Schritt 5.1) anpassen, um die optimale Dichte der Zellen im Sichtfeld zu erreichen.

Die Morphologie von Zellen in den Phasenkontrastbildern sollte für Segmentierungszwecke mit der von lebenden Zellen vergleichbar bleiben (Abbildung 3A-C). Wenn Zellen überpermeabilisiert sind, ändert sich die Zellmorphologie (wie "Geister"; Ergänzende Abbildung 1). In diesem Fall kann man die Dauer der 70%igen Ethanolbehandlung in Schritt 5.3 reduzieren.

Vor der Induktion betrug der durchschnittliche lacZ-Expressionspegel 0,03 mRNAs pro Zelle, konsistent mit früheren Berichten15,30. Auch die Verteilung der lacZ mRNA-Spotintensitäten vor der Induktion passte nicht gut zu einer Normalverteilung oder einer Poisson-Verteilung aufgrund des Vorhandenseins von Spots mit hohen Intensitäten (Abbildung 3D,E). Dies deutet darauf hin, dass die meisten der unter dem unterdrückten Zustand nachgewiesenen Flecken eine einzelne lacZ mRNA darstellen, aber eine kleine Population von Spots enthält mehr als eine lacZ mRNA. Um die Population mit einer einzigen lacZ mRNA zu isolieren, verwendeten wir ein Gauß-Mischmodell mit zwei Mischungskomponenten (Einschnitte in Abbildung 3D,E). Dann wurde der Mittelwert des ersten Gaußschen als mittlere Intensität eines einzelnen mRNA-Spots (z. B. der Spitze der schwarzen Kurve in Abbildung 3D)genommen und verwendet, um die Spotintensität in die Anzahl der mRNAs für alle im Zeitverlaufsexperiment erkannten Punkte umzuwandeln. Um die Gesamtzahl der mRNAs innerhalb einer Zelle zu berechnen, wurden die normalisierten Spotintensitäten in jeder Zelle summiert (Abbildung 3F)19.

Wenn der Expressionsgrad von lacZ mRNA niedrig ist, gibt es ein oder zwei beugungsbegrenzte lacZ-mRNA-Spots, die räumlich innerhalb einer Zelle getrennt sind. Daher können die Bilder dieser Flecken durch 2D Gaußian passend für ihre Intensität und Lokalisierung analysiert werden.

Wenn die Expressionsebene hoch ist, so dass sich Flecken innerhalb einer Zelle überlappen, führt die 2D-Gaußsche Anpassung nicht zu einer zuverlässigen Quantifizierung. In diesem Fall sollte der mRNA-Spiegel berechnet werden, indem das gesamte, hintergrundsubtrahierte Fluoreszenzsignal innerhalb einer Zelle mit der mittleren Intensität einer einzelnen mRNA19dividiert wird.

Wenn die Expression von lacZ induziert wird, erhöht sich zuerst das Signal von 5' lacZ mRNA und das von 3' lacZ mRNA erhöht sich später (Abbildung 4B). Wenn die Expression von lacZ unterdrückt wird, nehmen sowohl 5' als auch 3' lacZ mRNA-Signale mit einiger Verzögerung dazwischen ab (Abbildung 4B). Um die Transkriptionsdehnungsrate zu erhalten, ist der Anstieg von 5' und 3' Signalen zunächst mit Linien(Abbildung 4B) geeignet, und der Unterschied in x-Intercepts wird als Zeit für RNAPs genommen, um die Entfernung zwischen zwei Sondenregionen (2.000 nt) zu bewegen. Die Rate der Transkriptionsdehnung kann aus jedem Zeitverlaufsexperiment gemessen und Standardabweichungen aus experimentellen Duplikaten berechnet werden. Die durchschnittliche Rate der Transkriptionsdehnung betrug 15-30 nt/s unter unseren experimentellen Bedingungen19.

Zusätzlich wurde die Rate des mRNA-Abbaus (inverse der mittleren mRNA-Lebensdauer) durch Anbringen des Zerfallsbereichs mit einer exponentiellen Funktion(Abbildung 4B) ermittelt. Unsere Zeitverlaufsdaten enthalten mRNA-Abbau während und nach der Transkription31. Wir passen die Zeitpunkte an, nachdem 3' mRNA zu zerfallen begann (t > 6 min), um den Abbau von freigesetzten mRNAs zu untersuchen. Wir erhielten 90 s als durchschnittliche Lebensdauer von 5' oder 3' lacZ mRNA19.

Die Rate der Transkriptionsinitiierung kann aus der Steigung der 5' Signalerhöhung nach der Induktion berechnet werden(Abbildung 4B, blau), oder aus der durchschnittlichen mRNA-Zahl im stationären Zustand (d. h. der Initiationsrate dividiert durch die Abbaurate). Darüber hinaus kann die Wahrscheinlichkeit einer vorzeitigen Transkriptionsbeendigung geschätzt werden, entweder durch die Aufnahme des Verhältnisses zwischen der Steigung von 3' Signalerhöhung und der von 5' Signalerhöhung32 oder zwischen den stationären Niveaus von 3' und 5' mRNA-Regionen19.

Da smFISH eine Einzelzelltechnik ist, können wir die Zell-zu-Zell-Variabilität in der Transkription analysieren. Beispielsweise kann man den Prozentsatz der Zellen analysieren, die lacZ mRNA exemittieren, nachdem IPTG hinzugefügt wurde (Abbildung 4C). Man kann auch ansprechen, ob sich die mRNA-Lokalisierung nach der Induktion ändert. Wir beobachteten, dass sich 5' und 3' lacZ mRNA-Spots leicht nach außen bewegen, weg vom Zentrum der Zelle (Abbildung 4D,E), konsistent mit einem früheren Bericht33.

Schließlich kann die Analyse der Kolokalisierung zwischen 5' und 3' mRNA-Spots informativ sein (Abbildung 5A). Im unterdrückten Zustand (Zeit null) werden z. B. etwa 25 % der 5' mRNA-Spots mit einem 3' mRNA-Spot kolokalisiert. Bei t = 1 min, da viele Gen-Loci eine 5' mRNA-Synthese haben, aber noch keine 3' mRNA-Synthese, sind die meisten der 5' mRNA-Spots für sich allein ohne 3' mRNA-Signal (d.h. geringe Wahrscheinlichkeit einer Kolokalisierung). Wenn jedoch die 3' mRNA erscheint (d. h. t = 2 min), erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer Kolokalisierung (lila Pfeil in Abbildung 5A,B). Dieser Zeitpunkt, wenn die Kolokalisierung häufig wird, hängt von der Rate der Transkriptionsdehnung ab. Das 2D-Dichtediagramm von 5' und 3' lacZ mRNA-Zahlen innerhalb jedes zu diesem Zeitpunkt nachgewiesenen Co-Lokalisierungspunkts kann verwendet werden, um die Dichte von RNAPs auf dem lacZ-Gen abzuleiten (Abbildung 5C). Wie bereits berichtet19, deuten die 5' mRNA-Zahlen in diesem Diagramm darauf hin, dass die meisten lacZ-Loci weniger als 10 RNAPs auf der DNA haben, wenn die lacZ-Expression durch 1 mM IPTG induziert wird. Zusätzlich beziehen sich die 3' mRNA-Zahlen in diesem Diagramm auf die Clusterbildung von RNAPs34. Die Tatsache, dass die Anzahl der 3' mRNA nahe bei einem ist, bedeutet, dass ungefähr ein RNAP in den 3' Sondenbereich eintritt. Dies deutet darauf hin, dass RNAPs auf dem lacZ-Gen räumlich getrennt sind, anstatt einen Cluster (oder "Konvoi") zu bilden.

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Abbildung 1: Design von smFISH-Sonden für eine mRNA von Interesse. (A) Eine Kachelmethode. Sequenzen von kurzen DNA-Oligonukleotiden (20 bp länge) werden so gewählt, dass sie die mRNA von Interesse abdecken können. Die Oligonukleotid-Sonden sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet. (B) Eine Arraymethode. Ein nicht-kodierender Array von Tandemsequenzen (z. B."lacO array") wird transkriptionsmitderweise mit der mRNA von Interesse verschmolzen. Fluoreszierend beschriftete Sonde, die die Repeat-Einheit ergänzt (z.B. LacO-Sonde mit einer Länge von 17 bp), wird verwendet, um das Signal einer mRNA zu verstärken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematic des smFISH experimentellen Verfahrens und der Dauer jedes Schritts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: smFISH-Bildanalyse. (A-C) smFISH Mikroskopiebild von 5' lacZ mRNA (rot) und 3' lacZ mRNA (grün) in Wildtyp E. coli (MG1655) in M9 minimalmedium angebaut, ergänzt mit 0,2% Glycerin, 0,1% Casaminosäuren und 1 mg/L Thiamin bei 30 °C. (A) Ein repräsentatives Bild einer Probe aus t = 3 min nach Induktion mit 0,05 mM IPTG bei t = 0 min und Repression mit 500 mM Glukose bei t = 1,5 min. Phasenkontrast und zwei Fluoreszenzbilder von Cy5 (für 5' lacZ mRNA, rot) und Cy3 (für 3' lacZ mRNA, grün) wurden mit Pseudo-Färbung überlagert. Das Bild zeigt ein ganzes Feld von 86,7 x 66,0 m. Skalenbalken, 5 m. (B) Zoom-in-Version eines kleinen Bereichs (gelbes Feld) in (A). Zellumrisse werden weiß dargestellt, und Fluoreszenzflecken, die aus der Bildanalyse identifiziert werden, werden mit roten Punkten dargestellt. Schuppenstange, 1 m. (C) Nachweis von Zellumrissen und fluoreszierenden Flecken unter hoher Expressionsbedingung (t = 4 min nach Induktion mit 1 mM IPTG). Schuppenstange, 1 m. (D-E) Verteilungen von 5' und 3' mRNA-Spotintensitäten, gemessen vor Zugabe von IPTG (der unterdrückte Zustand). Die Histogramme werden mit zwei Gaußschen Funktionen (schwarz und grau) dargestellt, deren Mittelwerte aus dem Gaußschen Gemischmodell stammen. Inset zeigt quantil-quantile Darstellung von Zufallszahlen, die aus den Gaußschen Gemischmodellen und experimentell gemessenen mRNA-Spotintensitäten erzeugt wurden (n = 1040 für 5' mRNA und 680 für 3' mRNA). (F) Informationen für eine einzelne Zelle, die in Panel (B) gezeigt wird. Für eine bestimmte Zelle (i) wurden Flecken in Cy5- und Cy3-Kanälen identifiziert, und ihre Intensität (I) und Ihre Koordinate entlang der kurzen und langen Achse einer Zelle (d, l) wurden aus 2D Gaußian Fitting quantifiziert. Nach der Normalisierung wurden die Spotintensitäten summiert, um die Gesamtzahl von 5' oder 3' mRNAs in dieser Zelle zu ergeben. Auch die Kolokalisierung zwischen Spots aus verschiedenen Kanälen kann wie im Indister 5dargestellt analysiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Analyse der In-vivo-Kinetik der Transkription und mRNA-Abbau. (A) Schematische und repräsentative Bilder von zweifarbigen smFISH-Experimenten zur Messung von Veränderungen der lacZ mRNA-Spiegel im Laufe der Zeit. Rote und grüne gepunktete Linien zeigen Cy5- oder Cy3B-markierte Oligonukleotid-Sonden an, die zu den 1-kb-langen 5' bzw. 3' mRNA-Regionen von lacZ mRNA in E. colihybridisieren. Ebenfalls gezeigt sind Überlagerungen von zwei Fluoreszenzbildern mit einem Phasenkontrastbild zu angegebenen Zeitpunkten nach Induktion mit 0,2 mM IPTG bei t = 0 min. Die Transkription wurde mit 500 mM Glukose bei t = 1,5 min unterdrückt. Schuppenstange, 1 m. Die Figur wurde von Kim et al19geändert. (B) 5' und 3' lacZ mRNA-Zahlen pro Zelle im Zeitverlauf während des im Panel (A) beschriebenen Experiments. Fehlerbalken sind Bootstrapped SEMs. Pro Zeitpunkt wurden mindestens 1.200 Zellen analysiert. Der anfängliche Anstieg der 5' und 3' mRNA-Signale war mit einer Linie (blau) passend. Der Unterschied bei x-Intercepts betrug 1,93 min, was die durchschnittliche Rate der Transkriptionsdehnung von 17,3 nt/s ergab. Der endgültige Zerfall der 5' und 3' mRNA-Signale war mit einer exponentiellen Zerfallsfunktion (grau) geeignet. Die Anpassungsparameter geben an, dass die durchschnittliche mRNA-Lebensdauer 1,52 min für 5' mRNA und 1,66 min für 3' mRNA beträgt. (C) Prozentsatz der Zellen mit einem oder mehreren lacZ-mRNA-Spots während des in (A) beschriebenen Experiments. lacZ Fehlerbalken sind Bootstrapped SEMs. (D) Lokalisierung eines Spots entlang der kurzen Achse einer Zelle. Man kann die Nähe eines Spots zur Membran quantifizieren, indem man die Position entlang der kurzen Achse (d) mit der halben Breite der Zelle (w) dividiert. (E) Veränderung der Lokalisierung von 5' und 3' lacZ mRNA-Spots entlang der kurzen Achse der Zellen während des unter (A) beschriebenen Experiments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Analyse der Kolokalisierung von 5' und 3' mRNA-Spots. (A) Schemat, das die erwartete Kolokalisierung zwischen 5' und 3' mRNA-Spots nach der Induktion zeigt. Wenn 3' mRNA gemacht wird, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass ein 5' mRNA-Spot mit einem 3' mRNA-Spot kolokalisiert wird (lila Pfeil). (B) Die Wahrscheinlichkeit einer Kolokalisierung nach Induktion mit 1 mM IPTG. Der violette Pfeil gibt den Zeitpunkt an, an dem die Wahrscheinlichkeit einer Kolokalisierung nach dem Schaltplan im Panel (A) zuerst häufig wird. (C) Die Anzahl der 5' und 3' lacZ mRNAs innerhalb eines Ko-Lokalisierungspunkts, der bei t = 2 min nach Induktion mit 1 mM IPTG (insgesamt 841 Spots) nachgewiesen wurde. Graue Punkte stellen einzelne kolokalisierte Punkte dar, während rote Punkte den Durchschnitt der Binned-Daten darstellen. Fehlerbalken sind SEM. Der Grauton gibt die Dichte von Punkten in einem bestimmten Bereich des Diagramms an. Die gepunktete Linie zeigt eine Neigung von 1 an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Optimierung der Sondenhybridisierungsbedingung. Es wurden zwei Arten von Proben verwendet: MG1655-Zellen, die wie in Abbildung 3 beschrieben angebaut wurden und 20 min (rot) nicht induziert (blau) oder mit 0,5 mM IPTG behandelt werden. Die Sondenhybridisierungslösung wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen von Sonden (insgesamt 72 Cy5-konjugierte Sonden, die den gesamten lacZ-Bereich erhalten) und von Formamid hergestellt. Die Formamidkonzentrationen wurden auch in der Vorhybridisierungslösung und der Waschlösung entsprechend angepasst. "Keine Sonde" (graue Linie) gibt den Fluoreszenzpegel der IPTG-zugesetzten Zellen an, die während des Hybridisierungsschritts ohne Sonden behandelt werden. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität, die durch zellarea (AU) normalisiert wurde, wurde aus 300-800 Zellen berechnet. Fehlerbalken sind Bootstrapped SEMs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Verzerrte Zellmorphologien durch Überpermeabilisierung. Überlagerung von Phasenkontrast (Grauskala), 5' lacZ mRNA (Cy5, rot) und 3' lacZ mRNA (Cy3, grün) Bilder von MG1655 Zellen 5 min nach der Induktion mit 1 mM IPTG. (A) Ein Beispiel, das eine Mischung aus normalen Zellen und übermäßig permeabilisierten Zellen ohne normale Morphologie zeigt (angezeigt mit rosa Pfeilen). (B) Ein Beispiel, das "geisterhafte" Zellen zeigt, die miteinander verklumpt sind. Maßstabsleiste = 1 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

DEPC Wasser
0,1% DEPC zu Reinstwasser hinzufügen und die Flasche (bedeckt) im 37°C Ofen über Nacht und Autoklav am nächsten Tag inkubieren.
DEPC PBS (10X)
Mischen Sie Folgendes:
80 gNaCl (Finale 1,37 M)
2 gKCl (Finale 27 mM)
14,2 gNa2HPO4 (Finale 100 mM)
2,7 gKH2PO4 (Finale 20 mM)
Reinstwasser bis 1L
Filter (0,22 m) in eine Glasflasche.
Fügen Sie 0.1% DEPC hinzu und folgen Sie der Anleitung für DEPC-Wasser.
Um 1X Lösung zu machen, 10 Mal mit DEPC-Wasser verdünnen.
1M DEPC Natriumphosphatpuffer, pH 7,4
Mischen Sie Folgendes:
115 gNa2HPO4
22,8 gNaH2PO4
Reinstwasser bis 1 L
Filter (0,22 m) in eine Glasflasche.
Fügen Sie 0.1% DEPC hinzu und folgen Sie der Anleitung für DEPC-Wasser.
4X Befestigungslösung (16% Formaldehyd)
5 mL20% Formaldehyd
500 lDEPC Wasser
750 l1M DEPC Natriumphosphatpuffer, pH 7,4
Bei 4 °C bis zu 2-4 Wochen lagern.
VORSICHT: Formaldehyd ist giftig. Tragen Sie Handschuhe und verwenden Sie eine Dunstabzugshaube, wenn Sie diese Lösung herstellen.
Waschlösung
Mischen Sie Folgendes:
10 mlFormamid (endend 25%)
4 ml20X SSC (Finale 2X)
DEPC-Wasser auf 40 ml füllen
Filter (0,22 m) filtern und bei 4 °C lagern
VORSICHT: Formamid ist giftig. Tragen Sie Handschuhe und verwenden Sie eine Dunstabzugshaube, wenn Sie diese Lösung herstellen.
Vorhybridisierungslösung
200 lFormamid (endend 20%)
100 l20X SSC (Finale 2X)
10 l100X VRC (Finale 1X)
25 l4% (w/v) BSA (Endstand 0,1%)
685 lDEPC Wasser
HINWEIS: Wirbeln Sie die VRC-Aktie vor der Entnahme von 10 L heraus.
VORSICHT: Formamid ist giftig und ein bekanntes Teratogen. Tragen Sie Handschuhe und handhaben Sie es unter einer Dunstabzugshaube.
Probe-Hybridisierungslösung
200 lFormamid (endend 20%)
100 l20X SSC (Finale 2X)
10 l100X VRC (Finale 1X)
25 l4% (w/v) BSA (Endstand 0,1%)
10 l40 mg/ml E. coli tRNA (endend 0,4 mg/ml)
200 l50% Dextransulfat (endend 10%)
x L5' mRNA-Sondensatz (von Schritt 1.12) bis ende 4 nM.
y -L3' mRNA-Sondensatz (von Schritt 1.12) bis ende 4 nM.
-DEPC-Wasser, um das Gesamtvolumen 1 ml zu machen
HINWEIS: Fügen Sie Dextransulfat zuletzt hinzu. Da es sehr zähflüssig ist, schneiden Sie das Ende einer Pipettenspitze, bevor Sie 200 l aus dem 50%-Bestand herausnehmen. Nach Zugabe von Dextransulfat, Pipette nach oben und unten, um die Lösung zu homogenisieren.

Tabelle 1: Rezepte der verwendeten Lösungen.

Diskussion

Hier haben wir ein smFISH-Protokoll zur Messung der mRNA-Kinetik in E. coli vorgestellt. In den zuvor veröffentlichten smFISH-Protokollen für Bakterien23wurden Zellen bis zum Ende des Protokolls in den Röhren aufbewahrt, d.h. bis sie zur Bildgebung bereit sind. Obwohl es viele Vorteile hat, wie z. B. minimale unspezifische Bindung von Fluoreszenzsonden auf der Deckgeradenoberfläche23, ist es schwierig, diese Protokolle zu befolgen, wenn es viele Proben aus einem Zeitverlaufsexperiment gibt. Zunächst muss ein relativ großes Volumen von Zellen (>1 ml) vor der Fixierung beprobt und sogar geerntet werden. Zweitens müssen die Zellproben mehrmals zentrifugiert werden, um Lösungen auszutauschen und nach dem Hybridisierungsschritt zu waschen. In unserem Protokoll wird ein kleines Volumen (<1 ml) Kultur direkt mit einer Befestigungslösung in einem 1,5-ml-Rohr vermischt, was hilft, den Zellzustand zum Zeitpunkt der Probenahme schnell einzufrieren. Außerdem bleiben die Zellen während des gesamten Verfahrens an der Oberfläche befestigt, und verschiedene Lösungen können schnell ausgetauscht werden, indem Flüssigkeiten mit einem Vakuumfiltrationssystem angesaugt und Lösungstropfen gleichzeitig mit einer Mehrkanalpipette aufgebracht werden. Dieser Unterschied macht unser Protokoll sehr vorteilhaft, wenn eine große Anzahl von Proben gleichzeitig verarbeitet werden muss. Mit unserem Protokoll können 12-48 Proben gleichzeitig behandelt werden und die gesamte FISH-Prozedur kann innerhalb von 8 Stunden abgeschlossen werden, etwa eine ähnliche Zeit, die für ein paar Proben benötigt wird (Abbildung 2). Obwohl wir die Expression von lacZ in E. coli als Beispiel verwendet haben, ist das Protokoll weithin auf verschiedene Gene und Bakterienarten mit überlegungen anwendbar, die unten erläutert werden.

Bei verschiedenen Genen sind als erstes smFISH-Sonden zu beachten. Man kann Oligonukleotid-Sonden entwerfen, die die mRNA von Interesse fliesen (Abbildung 1A)13. Bei diesem "Fliesen"-Sondenansatz ist jede Sonde 20 Basislang und mit einem Fluorophor an der Endstation 5' oder 3' beschriftet. Diese Strategie ist praktisch, da keine genetische Manipulation erforderlich ist. Alternativ kann eine Tandem-Wiederholung von 20 bp Sequenz, fremd zur genomischen Sequenz (z. B. eine Reihe von LacO-Sequenzen in Caulobacter crescentus14), in den unübersetzten Bereich eines Gens von Interesse eingefügt werden und eine einzelne Sonde, die zur Wiederholungseinheit ergänzt, wird verwendet, um die mRNA zu kennzeichnen ("Array"-Ansatz; Abbildung 1B). In beiden Fällen schmücken mehrere Fluorophore eine mRNA und geben ein verstärktes Fluoreszenzsignal, das leicht von einer einzelnen Sonde unterschieden werden kann, die nicht spezifisch in einer Zelle gebunden ist.

Ob "Kachel"- oder "Array"-Ansätze gewählt werden sollen, hängt von der negativen Kontrolle ab, einer Probe, bei der die unspezifische Bindung von Sonden getestet wird, weil ihr die Ziel-mRNA fehlt. Bei Fliesensonden (Abbildung 1A) kann ein mutierter Stamm ohne das Gen von Interesse oder eine Bedingung, bei der das Gen nicht transkribiert wird (z. B. Unterdrückung von lacZ), als Negativkontrolle für die Prüfung der unspezifischen Bindung von Sonden dienen. Für den Array-basierten smFISH (Abbildung 1B) kann ein Wildtypstamm, der das Array fehlt, als Negativkontrolle dienen, da er keine Bindungsstellen für die Prüfpunkte enthält.

Optimale Hybridisierungsbedingungen können von den Sondensequenzen und sogar von der Wahl der Fluorophorfarbstoffe abhängen. Wir haben die Hybridisierungsbedingung für lacZ-Sondensätze optimiert, indem wir die Hybridisierungstemperatur bei 37 °C gehalten und verschiedene Konzentrationen von Sondensätzen und Formamid in der Hybridisierungslösung getestet haben. lacZ Höhere Konzentrationen von Formamid neigen dazu, sowohl unspezifische als auch spezifische Bindung zu reduzieren26,35. Wir empfehlen, die Hybridisierung und ihre Waschbedingungen systematisch zu ändern und gleichzeitig die Hybridisierungszeit und -temperatur gleich zu halten. Wenn die Bedingung strenger wird, nehmen sowohl unspezifische als auch spezifische Bindungsbindungen ab (Abbildung 6). Es ist wichtig, einen Punkt zu finden, an dem die unspezifische Bindung beginnt, unter einen akzeptablen Schwellenwert zu fallen, ohne dass eine spezifische Bindung weiter beeinträchtigt wird. Beispielsweise haben wir den signalpegel, der ohne Sonden ("keine Sonden") erhalten wurde, als Schwellenwert verwendet (Abbildung 6).

Die zweifarbige smFISH-Methode, die zwei separate Bereiche einer mRNA kennzeichnet, ist auf lange Gene beschränkt. Um die Rate der Transkriptionsdehnung zu messen, haben wir die Tatsache genutzt, dass lacZ lang ist (3075 bp) und seine Expression durch IPTG induziert werden kann. Wenn ein Gen kurz ist, ist es schwierig, zwei Fliesen-Sondensätze (nahe 5' und 3' Enden) zu entwerfen und die Zeitverzögerung zwischen den Auftritten von 5' vs. 3' mRNA-Regionen aufzulösen. In diesem Fall kann man im stetigen Zustand von smFISH aufkeimende mRNAs zählen und deren Verteilung mit einem analytischen Modell analysieren, das die Rate der Transkriptionsdehnung als passenden Parameter20hat. Wenn ein Gen von Interesse nicht induzierbar ist, kann man auch Zellen mit Rifampicin zum Zeitpunkt Null behandeln und die zeitliche Veränderung in 5' und 3' mRNA Subregionen messen. Die Verzögerung von der Abnahme des 5' mRNA-Signals auf das 3' mRNA-Signal kann dann verwendet werden, um die Rate der Transkriptionsdehnung zu berechnen, wie zuvor31getan.

Schließlich ist das smFISH-Protokoll vielseitig und kann mit anderen Kennzeichnungsschemata kombiniert werden. Zuvor wurde DNA-Lokus zusammen mit mRNAs durch die Kombination von mRNA FISH mit DNA FISH14 oder fluoreszierendem Reporter-Operator-System20visualisiert. Proteinprodukte können durch Immunfluoreszenz zusammen mit mRNA FISH14,36visualisiert werden. Es kann auch mit dreidimensionaler superhochauflösender Mikroskopie37 kombiniert werden, um mRNAs in allen drei Dimensionen38,39zu visualisieren.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Dieses Protokoll wurde von S.K. während ihrer Postdoktorandenforschung im Labor von Dr. Christine Jacobs-Wagner am Howard Hughes Medical Institute und am Microbial Sciences Institute der Yale University entwickelt. Wir danken Dr. Jacobs-Wagner und ihren Labormitgliedern für die verschiedenen Beiträge während der Methodenentwicklung und Laura Troyer für die kritische Lektüre des Manuskripts. S.K. erkennt die Unterstützung des Searle Scholars Program an; K.V. würdigt die Unterstützung des James Scholar Preble Research Award der University of Illinois.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bakterienstamm
Escherichia coli MG1655
Chemikalien, Peptide und andere
B
AmmoniumchloridFisher ChemicalA661-500Zur Herstellung von M9-Medium
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichB2518Sondenhybridisierung
CalciumchloridAcros Organics349610250Zur Herstellung von M9-Medium
CasaminosäureBD Difco223050Zur Herstellung von M9-Medium
Cy3B NHS-EsterGE Healthcare Life SciencesPA63101Fluorophor für FISH-Sonden
Cy5 NHS-EsterGE Healthcare Life SciencesPA15101Fluorophor für FISH-Sonden
DEPCSigma-AldrichD5758
DextransulfatMilliporeS4030Sondenhybridisierung
DextroseFisher ChemicalD16Zur Unterdrückung der Expression von lacZ
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD8418Zum Auflösen von Fluorophoren
E. coli tRNASigma-AldrichR1753Sondenhybridisierung
EthanolDecon Laboratories2701Wird bei der DNA-Reinigung, Lyse und Reinigung von Deckgläsern
verwendet FISH-SondenBiosearch TechnologiesSequenzen werden in ref#16
veröffentlicht FormaldehydLadd Research Industries20295Fixierung
FormamidAmerican BioAB00600Sondenhybridisierung, Prähybridisierung und Waschen
GlycerinAmericanbioAB00751-01000Zur Herstellung von M9-Medium
Isopropylthio-β-Galactosid (IPTG)Invitrogen15529019lacZ-Induktion
Magnesiumsulfat Fisher ChemicalM65-500Zur Herstellung von M9-Medium
2-Nitrophenyl β-D-Fucopyranosid (ONPF)Santa Cruz Biotechnologiesc-216258lacZ repression
Picodent twinsil 22Picodent1300 1000Dichtstoff
Poly-L-lysinSigma-AldrichP8920Zur Behandlung der Deckglasoberfläche
KaliumchloridFisher BioReagentsBP366-500Zur Herstellung von PBS
Kaliumphosphat monobasischFisher BioReagentsBP362-500Zur Herstellung von PBS und M9 Medium
RifampicinSigma-AldrichR3501Zum Stoppen der Transkriptionsinitiierung
Kochsalz-Natriumcitrat-Puffer (SSC)InvitrogenAM9763Sondenhybridisierung, Prähybridisierung und Waschen
NatriumbicarbonatFisher BioReagentsBP328-500Fluorophor-Sondenkonjugation
NatriumchloridFisher BioReagentsBP358-1Für die DNA-Aufreinigung, PBS und M9 medium
Natriumphosphat zweibasischFisher BioReagenzienBP332-500Zur Herstellung von PBS und M9 medium
Natriumphosphat monobasisch FisherBioReagenzienBP329-500Zur Herstellung eines Natriumphosphatpuffers
Super PAP PenInvitrogen8899Hydrophober Marker für Deckgläser
TetraSpek MikrosphärenInvitrogenT7280Kontrollen für Mehrkanalregistrierung
ThiaminSigma-AldrichT1270Zur Herstellung von M9-Medium
TriethylammoniumacetatSigma-Aldrich90358UPLC-Puffer Ein
Vanadyl-Ribonukleosid-Komplex (VRC)Sigma-Aldrich94742Sondenhybridisierung und Prähybridisierung
Ausrüstung
C18 SäuleWasserAcquity BEH C18 Säule
AufsatzzentrifugeEppendorf5425
Aufsatz-InkubatorEppendorfThermomixer F1.5
Inkubator (Ofen)Thermo Scientific51030514Schwerkraftkonvektion
WasseraufbereitungssystemMillipore Milli-QReferenz
NanotropfenThermo Scientific2000C
StickstoffgasGebäudeZum Föhnen von Deckgläsern und Objektträgern
UPLCWatersAcquity UPLC System
Vakuum und AspiratorGebäudeDer Aspirator besteht aus einem Filtrationskolben mit einem Seitenarm.
VakuumkonzentratorLabconco7810010Centrivap; zum Trocknen von Proben, die aus UPLC entnommen wurden.
VortexerScientific IndustriesGenie-2 SI-0236
WasserbadschüttlerNew BrunswickInnova 3100Kritisch für Zeitverlaufsexperimente
Wasserbad-UltraschallgerätVWR97043-960Zur Reinigung von Deckgläsern und Objektträgern
Tools
Eppendorf22431021DNA-Lobind-Röhrchen
1000-uL PipettenspitzenboxDenville ScientificP1126Eine leere Schachtel nach Gebrauch aller Spitzen
Coplin JarSPI01240-ABZum Reinigen von Deckgläsern und Objektträgern
Deckglas FisherScientific22-050-23024x60 No1
Gefilterte PipettenspitzenDenville ScientificP1121,P1122,P1126SHARP® Präzisions-Barrierespitzen
PinzetteSPIK35aZur Handhabung von sauberen Deckgläsern und Objektträgern
Objektträger GlasobjektträgerFisher Scientific12-544-1
HandschuheMicroflexMK-296-M
MehrkanalpipetteEppendorf2231300045Zur Verwendung im Waschschritt
PipetteGilsonP1000, P200, P20
ReagenzreservoirMTC BioP8025-1SZur Verwendung im Waschschritt
Spritzenfilter (0,22 μm)MilliporeSLGS033SS
TimerVWR62344-641
Software und Algorithmen
MATLABMathworksR2013 und höherhttps://www.mathworks.com
MicrobeTracker oder Ouftihttps://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker
https://oufti.org/
Stellaris Probe DesignerBiosearch Technologieshttps://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer
MikroskopCCD-Kamera
Hamamatsu PhotonikOrca-II-ER
Cy3 FiltersetChroma49004
Cy5 FiltersetChroma49006
Epi-FluoreszenzmikroskopNikonEclipse TiFür Phasenkontrast und Epifluoreszenz
FluoreszenzanregungsquelleLumencorSOLA-E
Nikon Elements SoftwareNikonSoftware zur Steuerung des Mikroskopaufbaus
Phasenkontrast 100x ObjektivNikonPlan Apochromat (NA 1.45)
Probe sequence
am 5'-EndeBiosearch Technologies Inc
lacZ1GTGAATCCGTAATCATGGTC5' mRNA
lacZ2TCACGACGTTGTAAAACGAC5' mRNA
lacZ3ATTAAGTTGGGTAACGCCAG5' mRNA
lacZ4TATTACGCCAGCTGGCGAAA5' mRNA
lacZ5ATTCAGGCTGCGCAACTGTT5' mRNA
lacZ6AAACCAGGCAAAGCGCCATT5' mRNA
lacZ7AGTATCGGCCTCAGGAAGAT5' mRNA
lacZ8AACCGTGCATCTGCCAGTTT5' mRNA
lacZ9TAGGTCACGTTGGTGTAGAT5' mRNA
lacZ10AATGTGAGCGAGTAACAACC5' mRNA
lacZ11GTAGCCAGCTTTCATCAACA5' mRNA
lacZ12AATAATTCGCGTCTGGCCTT5' mRNA
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Acetonitril Sigma-Aldrich 34851 UPLC-Puffer 1,5-ml-Röhrchen DNA Oligos mit C6-Aminomodifikation

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