Analyse von SEC-SAXS-Daten über EFA-Dekonvolution und Streuung

Biologische Makromoleküle sind zu klein, um selbst mit den besten Lichtmikroskopen gesehen zu werden. Aktuelle Methoden zur Bestimmung ihrer Strukturen beinhalten in der Regel die Kristallisation des Proteins oder Messungen an einer großen Anzahl identischer Moleküle gleichzeitig. Die Kristallographie liefert zwar Informationen über den atomaren Wert, stellt jedoch eine künstliche Probenumgebung dar, da die meisten Makromoleküle nicht in kristalliner Form in der Zelle dargestellt werden. In den letzten Jahren lieferte die Kryo-Elektronenmikroskopie ähnliche hochauflösende Strukturen großer Makromoleküle /makromolekularer Komplexe, aber obwohl die Proben näher am physiologischen Zustand sind, sind sie immer noch gefroren, daher unbeweglich und statisch. Die Bio-Kleinwinkel-Röntgenstreuung (BioSAXS) ermöglicht eine strukturelle Messung des Makromoleküls unter für die Biologie relevanten Bedingungen. Dieser Zustand kann als eine auf Einer Nanometerskala bestimmte 3D-Form mit niedriger Auflösung visualisiert werden und erfasst den gesamten Konformationsraum des Makromoleküls in Lösung. BioSAXS-Experimente bewerten oligomere Zustand, Domäne und komplexe Arrangements sowie Flexibilität zwischen den Domänen^1,2,3effizient. Die Methode ist genau, meist zerstörungsfrei und erfordert in der Regel nur ein Minimum an Probenvorbereitung und Zeit. Für die beste Interpretation der Daten müssen die Stichproben jedoch monodisperse sein. Das ist eine Herausforderung; biologische Moleküle sind oft anfällig für Verunreinigungen, schlechte Reinigung und Aggregation, zum Beispiel durch Gefrierauftauen⁴. Die Entwicklung der Inlinechromatographie, gefolgt von sofortiger SAXS-Messung, trägt dazu bei, diese Effekte zu mildern. Die Größenausschlusschromatographie trennt die Proben nach Größe und schließt damit die meisten Verunreinigungen und Aggregationen^5,6,7,8,9,10aus. In einigen Fällen reicht jedoch sogar SEC-SAXS nicht aus, um eine monodisperse Probe zu erzeugen, da das Gemisch aus Komponenten bestehen kann, die zu nah an der Größe sind oder ihre physikalischen Eigenschaften oder ihre schnelle Dynamik zu überlappenden Spitzen in der SEC-UV-Spur führen. In diesen Fällen kann ein softwarebasierter Dekonvolutionschritt der erhaltenen SAXS-Daten zu einer idealisierten SAXS-Kurve der einzelnen Komponente^5,11,12führen. Als Beispiel zeigen wir in Protokollabschnitt 2 die Standard-SEC-SAXS-Analyse der Vaccinia E9 DNA-Polymeraseexonuklease minus Mutant (E9 exo^minus) in Komplex mit DNA. Vaccinia stellt den Modellorganismus der Poxviridae dar, einer Familie, die mehrere Krankheitserreger enthält, zum Beispiel das menschliche Pockenvirus. Es wurde gezeigt, dass die Polymerase in biochemischen Ansätzen eng an die DNA bindet, wobei die Struktur des Komplexes vor kurzem durch Röntgenkristallographie¹³gelöst wurde.

Die meisten Synchrotron-Anlagen bieten eine automatisierte Datenverarbeitungspipeline, die Datennormalisierung und Integration durchführt und eine Reihe von nicht subtracted Frames erzeugt. Der in diesem Manuskript beschriebene Ansatz könnte jedoch auch mit einer Laborquelle verwendet werden, sofern SEC-SAXS durchgeführt wird. Darüber hinaus kann eine zusätzliche Automatisierung zur Verfügung stehen, die strahlungsgeschädigte Rahmen zurückweist und die Puffersubtraktion¹⁴durchführt. Wir zeigen, wie Sie die primäre Datenanalyse für vorverarbeitete Daten durchführen und die verfügbaren Daten in Abschnitt 2 nutzen können.

In Abschnitt 3 zeigen wir, wie SEC-SAXS-Daten dekonvolute und die Kurven effizient analysiert werden. Zwar gibt es mehrere Dekonvolution-Methoden wie die Gaußsche Peak-Dekonvolution, implementiert in US-SOMO¹⁵ und die Guinier optimierte Maximum-Likelihood-Methode, implementiert in der DELA-Software¹⁶, diese erfordern in der Regel ein Modell für die Peak-Form¹². Die endliche Größe einzelner Spitzen, die wir untersuchen, ermöglicht die Verwendung von Evolving Factor Analysis (EFA), als eine verbesserte Form der Singular Value Decomposition (SVD), um überlappende Spitzen zu dekonvolute, ohne sich auf die Spitzenform oder das Streuprofil^5,11zu verlassen. Eine SAXS-spezifische Implementierung finden Sie in BioXTAS RAW¹⁷. EFA wurde zum ersten Mal für Chromatographiedaten verwendet, als 2D-Dioden-Array-Daten erlaubten, Matrizen aus Absorption gegen Aufbewahrungszeit und Wellenlängendaten zu bilden¹⁸. Wo EFA zeichnet sich aus, ist, dass es sich auf den sich entwickelnden Charakter von Singularwerten konzentriert, wie sie sich mit dem Aussehen neuer Komponenten verändern, mit dem Vorbehalt, dass es eine inhärente Ordnung in der Akquisition¹⁰gibt. Glücklicherweise liefern SEC-SAXS-Daten alle notwendigen geordneten Erfassungsdaten in organisierten 2D-Datenarrays und verleihen sich gut an die EFA-Technik.

In Abschnitt 4 zeigen wir die Grundlagen der modellunabhängigen SAXS-Analyse aus der subtrahierten SAXS-Kurve im Pufferhintergrund. Die modellunabhängige Analyse bestimmt den Kreisradius (Rg), das Korrelationsvolumen (Vc), das Porod-Volumen (Vp) und den Porod-Debye-Exponent (PE). Die Analyse liefert eine semiquantitative Bewertung des thermodynamischen Zustands des Teilchens in Bezug auf Kompaktheit oder Flexibilität über das dimensionlose Kratky-Diagramm^2,4,19.

Schließlich werden SAXS-Daten in wechselseitigen Raumeinheiten gemessen, und wir zeigen, wie die SAXS-Daten in den realen Raum transformiert werden, um die Verteilungsfunktion "Paarentfernung" (P(r) wiederherzustellen. Die P(r)-Verteilung ist der Satz aller Entfernungen innerhalb des Partikels und enthält die maximale Dimension des Partikels, d_max. Da es sich um eine thermodynamische Messung handelt, stellt die P(r)-Verteilung den physischen Raum dar, der vom Konformationsraum der Teilchen belegt wird. Die richtige Analyse eines SAXS-Datasets kann Lösungszustandseinblicke bieten, die hochauflösende Informationen aus Kristallographie und Kryo-EM ergänzen.

1. Proteinexpression, -reinigung und SEC-SAXS-Messung basiert auf dem veröffentlichten Protokoll¹³

1. Folgen Sie dem inline SEC-SAXS Datenerfassungsprotokoll (Brennich et al.⁶) in Kürze.
   1. Equilibrate die SEC-Spalte mit mindestens 2 Spaltenvolumes des SEC-Laufpuffers (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl).
   2. Bereiten Sie 50 l der Probe von E9 exo^minus bei 8-u201210 mg/ml mit 20% Molüberschuss einer partiellen dsDNA (TCAGGAAGATAACAGCGGTTTAGCC und GGCTAAACCGCTGTCTCTT) vor. E9 exo^minus bindet mit einem K_D von 12 ± 6 nM (siehe Zusatzdaten).
   3. Inline 50 l dieser Mischung in eine SEC-Säule (S200 Increase) inline mit der Durchflusszelle für SAXS-Messungen bei 0,3 ml/min.
   4. Sammeln Sie 1000 Bilder bei je 1 s Belichtung.
      HINWEIS: Auf BioSAXS Beamline BM29 werden in der European Synchrotron Facility (ESRF) die einzelnen Frames automatisch und unabhängig innerhalb des EDNA-Frameworks verarbeitet¹⁴. Öffnen Sie nach der Datenerfassung die ISPyB-Datenbank²⁰ und drücken Sie unter der Registerkarte Datenerfassung die Schaltfläche "Gehen", um auf den Datensatz und die Ergebnisse der automatischen Analyse^{zuzugreifen 21}.
2. Laden Sie die Daten herunter.

2. Primäre Datenanalyse

1. Öffnen Sie das Java-basierte Programm Scatter IV (siehe die Materialtabelle) und führen Sie eine Hintergrundsubtraktion für SEC-Daten (Size Exclusion Chromatography) durch.
   1. Öffnen Sie die Registerkarte SEC. Ziehen und ablegen Sie die reduzierten Datendateien (*.dat) in das Fenster "Daten unten ablegen". Legen Sie das Ausgabeverzeichnis "Out Dir ::" fest, indem Sie auf die Schaltfläche Ausgabe Dir mit blauer Beschriftung klicken.
      HINWEIS: Wenn Ihre Daten in nm^-1gesammelt wurden, muss ein Konvertierungsfeld (unten links im Bedienfeld) aktiviert werden, wenn Dateien in das Fenster oder die Registerkarte Subtraktion ablegen.
   2. Bearbeiten Sie die experimentellen Details, verwenden Sie die Schaltfläche Details bearbeiten und füllen Sie so viele Felder wie möglich aus, dazu gehören Abschnitte, in denen Quell-/Beamline zum Sammeln von Daten verwendet wurde, die Sammlungsparameter und Beispieldetails. Diese werden mit den Daten gespeichert und ermöglichen es, den Abschnitt "Datenerfassungsparameter" in zukünftigen Publikationen leichter aufzufüllen.
   3. Geben Sie den Beispielnamen in das Feld Speichern unter ein. Klicken Sie auf TRACE.
      HINWEIS: Dies hat zwei Auswirkungen. Zunächst wird eine *.sec-Datei für die Daten erstellt. Dies ist eine einzelne Textdatei, die alle experimentellen Beobachtungen aus den separaten *.dat Dateien zusammenstellt. Darüber hinaus enthält die *.sec-Datei den gemittelten Satz von Frames, der der Pufferhintergrund ist, alle Frames, die in der Mittelung verwendet werden, sowie die Pufferhintergrund subtrahierten Frames im gesamten SEC-SAXS-Experiment. Zweitens wird ein Signaldiagramm erstellt, das die Framezahl im Vergleich zum Integral-Verhältnis zum Hintergrund darstellt. Hier werden die ausgewählten Frames (grau) angezeigt, die für die Puffersubtraktion gemittelt wurden. Die Punkte für den durchschnittlichen Puffer werden aus dem gesamten Bereich der Daten ermittelt. Es ist jedoch ratsam, die Pufferrahmen für die Mittelung manuell auszuwählen, da ein schlecht definierter Hintergrund aufgrund schlecht ausgeausgleichter oder schmutziger Säulen oder Kapillarfouling²²auftreten kann.
   4. Wählen Sie Pufferrahmen manuell aus. Klicken Sie auf Puffer löschen und wählen Sie dann einen Pufferbereich mit einem Linksklick-Ziehen auf der Ablaufverfolgungskurve erneut aus. Idealerweise sollte dies ein flacher Bereich vor dem Leerenvolumen der SEC-Spalte von etwa 100 Frames sein. Klicken Sie auf SET BUFFER und dann aktualisieren, um die *.sec-Datei neu zu berechnen, was einige Minuten dauern kann.
   5. Identifizieren Sie eine Region von Interesse (ROI). Wählen Sie im Signaldiagramm den Bereich des Spitzenwerts aus, mit einem Linksklick.Klicken Sie mit einem Linksklick.
      HINWEIS: Dadurch werden drei Diagramme im rechten Bereich aufgewirt. Die beiden oberen Diagramme sind mit Fadenkreuzen verbunden, die sich zwischen ihnen bewegen, ein zweites Signaldiagramm (oben rechts) zeigt nur den ausgewählten ROI, mit der Intensität jedes Frames in Blau und dem entsprechenden Rg jedes Frames in Rot und einer entsprechenden Heatmap unten, die die Residuen für jeden nach der Durbin-Watson Autokorrelationsanalyse gefärbten Rahmen zeigt. Regionen mit hoher Ähnlichkeit sind farbige Cyan (Durbin-Watson, d = 2), während unterschiedliche Rahmen dunkleren Blautönen zu Rosa und schließlich zu Roten folgen, abhängig von der Schwere der Unähnlichkeit (d > 2). Das untere Diagramm ist eine subtrahierte I-Kurve im Vergleich zu q-Kurve für den zentralen ausgewählten Rahmen (auch durch eine vertikale Linie bezeichnet). Die Pfeiltasten können verwendet werden, um durch die subtrahierten Frames zu navigieren. Das Diagramm I versus q zeigt die Qualität der subtrahierten Frames aus dem SEC-Experiment.
   6. Wählen Sie Rahmen aus, die zusammengeführt werden sollen. Klicken Sie auf die Fadenkreuze im Heatmap-Plot, um die Teilmenge der Frames auszuwählen, die zum Zusammenführen verwendet werden sollen. Die Fadenkreuze werden einen dreieckigen Bereich von überwiegend Cyan identifizieren, der auf die untere rechte Seite der Fadenkreuze fällt. Verwenden Sie einen Mausklick, um diese Frames als ausgewählt festzulegen und die Frames im entsprechenden Bereich des Signaldiagramms oben hervorzuheben. Diese Rahmen sollten idealerweise eine Region mit einem stabilen Rg hervorheben.
      HINWEIS: Zoomen Sie bei Bedarf mit einem Linksklick-Ziehen auf die Heatmap und verkleinern Sie sie mit einem Linksklick nach rechts.
   7. Wenn Sie mit den ausgewählten Frames zufrieden sind, klicken Sie auf MERGE. Dadurch werden die subtrahierten Frames zusammengeführt und auf der Registerkarte ANALYSIS angezeigt.

3. Datendekonvolution

1. Öffnen Sie das Dekonvolution-Programm (z. B. BioXTAS Raw 2.0.0).
2. Laden Sie im Dekonvolution-Programm das Dataset unter Registerkarte Dateien in der Systemsteuerung,um die Daten zu suchen oder die Position zu kopieren und in die Adressleiste einzufügen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Ordner nur die unformatierten *.dat Dateien und keine verarbeiteten oder durchschnittlichen Datendateien enthält.
3. Markieren Sie alle *.dat Dateien, drücken Sie die Schaltfläche Plot-Serie, ein Diagramm mit integrierter Intensität im Vergleich zur Frame-Nummer wird im "Seriendiagramm" gezeichnet.
4. Wählen Sie in der Systemsteuerung die Registerkarte Serie aus, und klicken Sie dann, um die Kurve hervorzuheben. Öffnen Sie das Popupfenster LC-Analyse mit der Schaltfläche an der Basis des Bedienfelds. Dieses Fenster bietet Zugriff auf verschiedene Optionen, wie z. B. die Auswahl unterschiedlicher Molekültypen (Protein oder RNA). Außerdem kann der Benutzer den Pufferbereich für das Diagramm auswählen. Klicken Sie zunächst auf Auto; hier sollte ein geeigneter Pufferbereich ausgewählt werden.
   HINWEIS: Wenn dies fehlschlägt, möglicherweise aufgrund einer instabilen Baseline, dann "Region hinzufügen", um den Pufferbereich zu optimieren. Dadurch wird das Pufferfeld mit einem kleineren Feld aufgetürt, in dem man die Framenummern, die für den Puffer verwendet werden sollen, manuell hinzufügen kann. Alternativ können Sie auf "Auswählen" klicken, um die Option zur Auswahl eines Bereichs auf dem Grundstück zu erhalten. Suchen Sie den Bereich, klicken Sie einmal mit der linken Maustaste für die Startposition, bewegen Sie den Cursor an die nächste Position und klicken Sie erneut mit der linken Maustaste. Möglicherweise müssen Sie mehr als einen Pufferspeicherort hinzufügen. Klicken Sie auf Puffer festlegen, und die Kurven werden subtrahiert und die Rg über den SEC-Peak berechnet. Wenn ein Popupfeld angezeigt wird, klicken Sie auf OK.
5. Um die Evolving Factor Analysis (EFA) zu starten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Systemsteuerung und wählen Sie dann Efa aus dem Menü.
   1. Überprüfen Sie, ob ein Popup-Fenster geöffnet wird, in dem die Single Value Decomposition (SVD) des Datensatzes angezeigt wird. Aktivieren Sie im Feld "Rahmen verwenden", damit der gesamte zu dekonvolute beraumende Spitzenbereich im Intensitätsdiagramm abgedeckt wird. Das Diagramm "Singular Values" oben rechts zeigt die Intensität der Singularwerte (getrennte Spitzen/Arten) über der Basislinie.
      HINWEIS: Die Anzahl der Punkte, die über der Basislinie vorhanden sind, stellt die Anzahl der streunenden Arten dar. Mit dem Vorbehalt, dass es auf die relative Größe des Singularwerts für die flache Fläche/Basislinie ankommt.
   2. Verwenden Sie das untere AutoKorrelationsdiagramm, um die Anzahl der einzelnen Werte zu überprüfen. Dies zeigt die rechten und linken einzelnen Korrelationsvektoren. Klicken Sie auf Weiter.
      HINWEIS: Diese stellen im Wesentlichen Streu- oder Konzentrationsprofile für den Vektor in der Lösung dar. Wobei die absolute Größe die Bedeutung des Vektors darstellt. Eine signifikante Komponente hat eine Autokorrelation in der Nähe von 1 (eine Regel der Daumenabschaltung ist >0.6-u20120.7). RAW berechnet dies hilfreich und wird im Feld #Significant SVs unten links angezeigt, obwohl Sie dies bei Bedarf ändern können. Wenn es mehrere Einzelwerte gibt (z. B. 4+), kann es erforderlich sein, nur 2 oder 3 der Komponenten zu betrachten, um den Bereich der verwendeten Daten zu ändern. Je geringer die Anzahl der Komponenten, desto einfacher wird die EFA-Analyse sein, aber auf Kosten der Verwendung von weniger Daten. In einer komplexen Situation, in der die linken und rechten Singularvektoren, die ähnlich sein sollten, nicht übereinstimmen, reduzieren Sie die signifikante SV-Zahl und verringern Sie die Anzahl der verwendeten Frames, bis die linken und rechten Singularvektoren ähnlich sind.
   3. Überprüfen Sie, ob die EFA berechnet wird, indem Sie Diagramme in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung für jeden Vektor generieren. Diese Diagramme zeigen, wann Komponenten das Lösungsprofil für die ausgewählten SEC-SAXS-Daten starten (Vorwärtsdiagramm) und beenden (Rückwärtsdiagramm). RAW versucht, diese Bereiche zu identifizieren. Ändern Sie diese mit den Pfeilen neben den Zählern, so dass jeder Kreis am Anfang eines Wendepunkts steht, der von oder vom Ausgangswert aufsteigt oder fällt. Klicken Sie auf Weiter.
      HINWEIS: Die letzte Stufe der EFA verwandelt die SVD-Vektoren wieder in Streukurven. Auf der linken Seite des Fensters werden die zuvor definierten Bereiche oben dargestellt. Diese Bereiche sind die Abhängigkeiten, um zu definieren, wo die einzelnen Vektoren wieder in Streukurven gedreht werden sollen. Das rechte Bedienfeld zeigt die entsprechenden Streukurvenprofile für jeden getrennten Peak an. Ein Diagramm für die Konzentration jedes Peaks, das repräsentativ für Elutionsprofile und ein Diagramm für den mittleren Fehler gewichtet chi²sein sollte. Das Chi^2-Diagramm misst den Dekonvolution-Datensatz auf den ursprünglichen Datensatz. Im Idealfall wird dies flach sein, aber Spikes können oft gesehen werden.
   4. Versuchen Sie, Spitzen zu reduzieren oder zu eliminieren, indem Sie die Komponentenbereichssteuerelementeändern, zuerst ungefähr identifizieren, welcher Rahmen der Spitze entspricht (aus chi^2-Plot) und dann in den Bereichssteuerungen, welche Komponente diesen Rahmen enthält (es könnte mehr als eins sein), mit den Pfeilen den entsprechenden Bereich nach oben oder unten bewegen.
      HINWEIS: Dies sollte zu einer Reaktion führen, die die Spitze erhöht oder verringert. Wenn der Spike-Frame in mehr als einer Komponente vorhanden war, kann ein kleiner Versuch und Fehler zwischen den einzelnen Komponenten erforderlich sein.
   5. Wenn ein Mindestchi² erreicht wurde, führen Sie eine Validierungsprüfung durch Klicken zurück ,das vorherige Fenster scheint zu überprüfen, ob die vorgenommenen Änderungen die ursprünglichen EFA-Plots drastisch geändert haben. Wenn sie weiterhin gültig aussehen, klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie auf EFA-Daten speichern, um die Plots zu speichern, und klicken Sie dann auf Fertig; , um das EFA-Fenster zu schließen.
      HINWEIS: Eine zweite Validierung besteht darin, das Kontrollkästchen neben jedem Komponentenbereich zu deaktivieren. Diese bieten eine positive Konzentrationseinschränkung für jede Komponente, und das Ausschalten wird überprüfen, ob diese den Datensatz erheblich beeinflussen. Wenn keine Änderung im Konzentrationsdiagramm zu sehen ist, sind die Daten gültig.
6. Zurück im RAW-Fenster klicken Sie auf die Registerkarte Profile in der Systemsteuerung, um die Kurven anzuzeigen, und auf der Registerkarte Manipulation der Systemsteuerung,bearbeiten Sie die Kurven weiter oder speichern Sie die Kurven als *.dat Dateien, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Datei klicken und ausgewählte Dateien aus dem Menü-Pop-up speichern auswählen. Speichern Sie die Datei. Verwenden Sie Streuung IV für die weitere Analyse.
   HINWEIS: Weitere Informationen und Anweisungen zu Dekonvolution und EFA BioXTAS RAW finden Sie unter https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/

4. SAXS-Eigenschaften bestimmen

HINWEIS: Ein ausführliches Tutorial zur SAXS-Bestimmung finden Sie unter Bioisis.net. Hier zeigen wir einen grundlegenden Schritt-für-Schritt-Ansatz, der die nützlichsten Schaltflächen in Scatter hervorhebt.

1. Drücken Sie auf der Registerkarte Streuanalyse die G-Taste für das manuelle Guinier-Analysetool rechts neben jeder Beispieldatei. Das Plot, das geöffnet wird, zeigt die ln[I(q)] im oberen Feld und die entsprechenden Residuen im unteren Feld. Fügen Sie Punkte so hinzu oder entfernen Sie sie, dass die Residuen keine Funktion "Lächeln" oder "Frown" aufweisen. Die ausgewählten Daten in der Guinier-Anpassung sollten die maximale q x Rg-Grenze von 1,3 nicht überschreiten.
2. Drücken Sie die Normalized Kratky-Taste; die Darstellung, die auftaucht, bietet eine semi-quantitative Bewertung des strukturellen Zustands des Makromoleküls, normalisiert für Masse und Konzentration.
   HINWEIS: Die Fadenkreuze bezeichnen den Guinier-Kratky-Punkt bei (√3, 1.1)¹⁹. Ein kompaktes, sphärisches Protein zeigt eine einzige Spitze mit dem maximalen Wert am Guinier-Kratky-Punkt. Ein intrinsisch gestörtes oder zylindrisches Biopolymer hätte ein Maximum größer als das Fadenkreuz und würde nicht abnehmen. Ein Protein, das sowohl gefaltete Domänen als auch langgestreckte unstrukturierte Regionen hatte, könnte durch das Fadenkreuz ein erhöhtes Maximum aufweisen, aber auch einen offensichtlich abnehmenden Trend bei höheren q x Rg zeigen.
3. Klicken Sie auf die Vc-Schaltfläche (Volumen der Korrelation), die zwei Diagramme, die gesamte streute Intensität und einen integrierten Bereich der gesamten streuten Intensität in Abhängigkeit von q, aufruft. Die Plots werden als Kurzreferenz verwendet, um die Qualität der Streukurve zu überprüfen.
   HINWEIS: Die gesamte streute Intensität ist empfindlich gegenüber dem I(0) und wenn dies nicht korrekt gemessen wurde, zeigt die Darstellung keine durchgehende Linie an. Das integrierte Flächendiagramm sollte idealerweise eine sigmoidale Linie mit einem verlängerten Plateau für jede SAXS-Kurve aufweisen. Wenn pufferinübereinstimmung/Subtraktion, Aggregation oder Interpartikelinterferenzen in der Stichprobe vorhanden sind, wird eine scharfe Steigung bei höheren q-Werten beobachtet.
4. Drücken Sie die Flexibilitätstaste, um die Flexibilitätsanalyse zu starten. Dadurch wird ein Fenster mit vier Paneelen und einem Schieberegler an der Unterseite geöffnet. Jedes geöffnete Panel zeigt ein Diagramm, das eine machtrechtliche Beziehung ausnutzt, die zwischen kompakten und längigen/flexiblen Biopolymeren besteht²³. Um es zu verwenden, bewegen Sie den Schieberegler am unteren Rand des Feldes von rechts nach links, wenn die linke Maustaste gedrückt wird. Bewegen Sie sich langsam nach links, bis ein Plateau in einem der Parzellen erreicht ist.
   HINWEIS: Wenn das Plateau im Porod-Debye-Plot zu sehen ist, dann ist die Probe kompakter Natur, was mit einem einzelnen Gipfel am Guinier-Kratky-Punkt in einem normalisierten Kratky-Plot übereinstimmen sollte. Wenn das Plateau zuerst im Kratky-Debye-Plot erreicht wird, ist die Probe höchstwahrscheinlich langgestreckt oder flexibel. Wenn das SIBYLS-Diagramm zuerst auf Plateau erfolgt, enthält die Probe höchstwahrscheinlich Bereiche von Kompaktheit und Flexibilität, ein Teilchen mit gemischten Zuständen. Die Theorie für diese Flexibilitätsbeziehung mit dem Porod-Debye-Gesetz wird in Rambo, et al.²³ exquisit thematisiert.
5. Klicken Sie auf Volume. Die Volumenermittlung sollte unmittelbar nach der Flexibilitätsanalyse von oben durchgeführt werden. Wenn nach der Flexibilitätsanalyse geöffnet wird, wird ein Pop-up mit drei weiteren Diagrammen generiert. In der unteren, linken Ecke erinnert sich das Porod-Debye-Diagramm daran, wo man den Schieberegler aus dem Flexibilitätsdiagramm verlassen hat, das den Plateaubereich anzeigt.
   1. Um das Volumen des Partikels zu berechnen, verschieben Sie den Start- und Endpunkt mithilfe der Pfeilschaltflächen oder geben Sie die Felder ein, sodass die blaue Linie auf dem Diagramm in den Plateaubereich passt. Für ein unvoreingenommenes Ergebnis sollten die Residuen im oberen rechten Porod-Debye Exponent Power-Law fit kein Muster aufweisen.
6. Drücken Sie die Registerkarte P(r). Die Real-Space-Verteilung befindet sich im linken Bereich und die Streukurve für die Probe im rechten Bereich. Ziel ist es, eine reale Raumdarstellung des Samples aus der sAXS-Kurve des wechselseitigen Raums zu erstellen. Idealerweise ist die Verteilungskurve glatt, ohne Wellen vorhanden und sollte nur sanft die x-Achse küssen.
   HINWEIS: Der gemessene q-Bereich des Geräts ist aufgrund schlechter Pufferübereinstimmung, Aggregation, Strahlungsschäden, suboptimaler Belichtungszeiten und niedriger Partikelkonzentrationen möglicherweise nicht vollständig verwendbar. Der P(r)-Bestimmungsschritt bestimmt grundsätzlich den verwendbaren q_min- und_{q-Max-Bereich} des SAXS-Datasets, und es sollte dieser Datenbereich sein, der für jede nachfolgende Modellierung oder Anpassung verwendet wird.
   1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Beispielnamen, und klicken Sie dann auf DMAX suchen, um ein neues Fenster zu öffnen. Die Grenzwerte für das d_max sind mit dem vorgeschlagenen q_max (maximal verwendete Datenpunkte), den unteren und oberen d_{max-Grenzwerten} und einem unteren und oberen Alpha-Score voreingestellt. Drei Modelle können gewählt werden (L1-Norm, Legendre und Moore) und die Verwendung von Hintergrund enthalten. Lassen Sie diese in erster Linie unverändert.
   2. Drücken Sie die Starttaste. Im linken Bereich wird eine zusammengesetzte Verteilung mit dem darunter geschriebenen d_max- und Alpha-Level erstellt. Wenn dies akzeptabel aussieht, schließen Sie das Fenster und kehren Sie zur Registerkarte P(r) zurück. Das gegenseitige Leerzeichen wurde zugeschnitten, um dem vorgeschlagenen q_maxzu entsprechen.
   3. Wählen Sie das Modell Moore, klicken Sie auf Hintergrund und legen Sie dann die Alpha-Ebene und d_max auf die vorgeschlagenen Werte aus dem Pop-up-Feld. Drücken Sie die Verfeinerungstaste. Es erscheint ein Kreuzvalidierungsdiagramm, das zeigt, ob Punkte abgelehnt werden mussten, die rot markiert sind. Wenn nur wenige Punkte abgelehnt werden und die Verteilung gut aussieht, dann ist das Modell gut.
      HINWEIS: Das Cross-Validierungsdiagramm hebt Bereiche der Daten hervor, die mit der ermittelten P(r)-Verteilung nicht übereinstimmen. Wenn sich die abgelehnte Region hauptsächlich in der Low-q-Region befindet, d. h. in der Region in der Nähe der y-Achse, deutet dies wahrscheinlich auf ein d_max hin, das zu kurz ist, das Vorhandensein von Aggregation oder Oligomeren höherer Ordnung. Er unterstreicht eine Inkonsistenz zwischen den Informationen mit höherer und niedrigerer Auflösung. Hier sollten d_max und q_min (erhöhter Startwert) mit einem manuellen Trial-and-Error-Ansatz angepasst werden. Wenn sich die abgelehnte Region hauptsächlich in der High-q-Region befindet, kann dies auf ein Problem mit der Hintergrundsubtraktion hinweisen oder darauf hinweisen, dass das Signal zu schwach ist, um sinnvoll durch die ermittelte P(r)-Verteilung erklärt zu werden. In diesem Fall sollte q_max abgeschnitten werden (abnehmendes Ende), bis keine zusätzlichen Daten abgelehnt werden. Im Idealfall sollten abgelehnte Punkte nach dem Zufallsprinzip verteilt werden und weniger als 5 % der verwendbaren Daten ausmachen. Ein richtig definiertes q_min, q_max und "d_max" erzeugt eine glatte Verteilung, bei der die d_max die x-Achse küsst. Erhöhen Sie diesen Wert jedoch nicht so sehr, dass die Guinier-Region vollständig entfernt wird. Dieser Punkt ist leicht zu finden, indem Sie das Feld q x l(q) (links im Bereich des Panels über der Tabelle) aktivieren. Die Streukurve wird durch das Diagramm "Total Scattered Intensity" ersetzt, auf dieser Kurve sind alle Punkte vor der maximalen Biegung Teil der Guinier-Region. Versuchen Sie nach dem Entfernen von Punkten erneut, das "d_max"zu erhöhen/verringern und dann noch einmal zu verfeinern. Wenn weiterhin Probleme auftreten, insbesondere wenn viele Punkte vom Anfang der Validierungskurve aus abgelehnt werden, deutet dies stark darauf hin, dass die Daten nicht ideal für die Strukturmodellierung sind.
7. Um einen Bericht zu drucken, navigieren Sie zurück zur Registerkarte Analyse, klicken Sie mit der linken Maustaste, um das Beispiel hervorzuheben, klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf den Beispielnamen, und wechseln Sie zu Bericht erstellen aus einem einzelnen Datensatz im Menü. Es wird ein Textfeld geöffnet, in dem Kommentare hinzugefügt werden können. Es wird ein PDF-Dokument mit allen generierten Zahlen und Werten erstellt.

Der Vorteil der Dekonvolution gegenüber der klassischen Rahmenauswahl13 besteht darin, den Einfluss von Arten aufeinander zu beseitigen und ein monodisperses Streusignal zu erzeugen. Dies wird auch oft mit einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis gefolgt. Wenn E9 exominus an DNA gebunden ist und mit SEC-SAXS ausgeführt wird, werden zwei Peaks beobachtet (Abbildung 1). Der erste, große Peak (ungefähr Frames 420-u202475)ist der E9-Exo-Minus-DNA-Komplex der zweite (ungefähr Frames 475-u2012540), der ungebundene Zustand (siehe Zusatzdaten: Abbildung 2). Während der klassische Ansatz der Auswahl von Rahmen eine stabile Rg des Komplexes in der ersten Spitze bietet (siehe Ergänzende Daten: Abbildung 3), wird der zweite Peak klar zusammengeführt und der Rg über das Diagramm zeigt, dass der zweite Gipfel des Interesses aufgrund der Kreuzspitzenkontamination keinen stabilen Rg hat. Es konnten nur 5 Frames verwendet werden, die einen halbstabilen Rg zeigten, wenn sie subtrahiert wurden, gaben sie ein Rg = 36,3 "(Abbildung 2, grün). Wenn die Spitzen mit EFA dekonvolutiert wurden, wurde die entsprechende Kurve für den zweiten Peak(Abbildung 2, blau) mit dem Original überlagert und zeigte eine deutliche Abnahme des Signals auf Rauschen, und ein niedrigerer Rg, 34,1 , wurde aufgezeichnet. Die Kratky-Plot (Abbildung 3) zeigt den Komplex mit dem deconvoluted Peak (blau) ist kugelförmiger. Dies wird durch die P(r)-Kurve (Abbildung 4) bestätigt, die für die deconvoluted-Kurve (blau) ein dmax. 108,5 - ergibt, während die nicht-dekonvolutierte mit einem dmax 120 ( grün) mehr länsiert ist, was höchstwahrscheinlich auf die Heterogenität zurückzuführen ist, die sich aus dem ungebundenen E9 exominusergibt.

Abbildung 1: Signaldiagramm von E9 exominus allein und mit DNA in Komplex.
Das obere Bedienfeld zeigt ein Diagramm des integralen Verhältnisses zum Hintergrund für jeden Frame eines SEC-SAXS-Laufs (hellblau). Die roten Punkte zeigen die Rg an jedem Frame über dem Gipfel. Das untere Panel zeigt die entsprechende Heatmap, die die Residuen für jeden Nachdruck nach der Durbin-Watson Autokorrelationsanalyse zeigt, Regionen mit hoher Ähnlichkeit sind cyan gefärbt, während unterschiedliche Rahmen je nach Schwere der Unähnlichkeit dunkleren Blautönen und schließlich zu Rot folgen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Diagramm der Intensität im Vergleich zum Streuvektor.
Eine Überlagerung der subtrahierten SAXS-Daten bilden das E9 exominus . In grünen 5 Rahmen (Rahmen 517-2012522) gemittelt und subtrahiert von einer Fläche von halbstabilen Rg und in blau die repräsentative Streukurve abgeleitet aus der EFA-Dekonvolution der SEC-SAXS Peak. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Dimensionlose Kratky-Kurve.
Die Überlagerung der dekonvolutierten (blauen) und nicht-devoluted (grünen) Kratky-Kurve, die E9 exominus zeigt, ist kugelförmig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: P(r)-Kurve.
Die Überlagerung der dekonvolutierten (blauen) und nicht-devoluted (grünen) Kurven für die E9 exominus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Daten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen 

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