Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei stark unterschiedlich exprimierenden Proteinen in lebenden Pseudomonas aeruginosa mit FLIM-FRET-Messungen. Das Protokoll umfasst Bakterienstammkonstruktionen, Bakterienimmobilisierung, Bildgebung und Nach-Imaging-Datenanalyseroutinen.
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Methodenartikel
FLIM-FRET Messungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Bakterien.
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) steuern verschiedene Schlüsselprozesse in Zellen. Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) in Kombination mit Förster Resonanzenergietransfer (FRET) liefern genaue Informationen über PPI in lebenden Zellen. FLIM-FRET stützt sich auf die Messung des Fluoreszenz-Lebensdauerzerfalls eines FRET-Spenders an jedem Pixel des FLIM-Bildes und liefert quantitative und genaue Informationen über PPI und ihre räumlichen zellulären Organisationen. Wir schlagen hier ein detailliertes Protokoll für FLIM-FRET-Messungen vor, das wir zur Überwachung von PPI in lebenden Pseudomonas aeruginosa im speziellen Fall von zwei interagierenden Proteinen angewendet haben, die mit sehr unterschiedlichen Kopiernummern ausgedrückt werden, um die Qualität und Robustheit der Technik bei der Aufdeckung kritischer Merkmale von PPI zu demonstrieren. Dieses Protokoll beschreibt detailliert alle notwendigen Schritte für die PPI-Charakterisierung - von bakteriellen Mutantenkonstruktionen bis zur Endanalyse mit neu entwickelten Tools, die erweiterte Visualisierungsmöglichkeiten für eine einfache Interpretation komplexer FLIM-FRET-Daten bieten.
Einleitung
Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) steuern verschiedene Schlüsselprozesse in Zellen1. Die Rollen von PPI unterscheiden sich je nach Proteinzusammensetzung, Affinitätsfunktionen und Positionen in Zellen2. PPI können mit verschiedenen Techniken untersucht werden3. Beispielsweise ist Die Co-Immunpräzipitation ein relativ einfaches, robustes und kostengünstiges, häufig verwendetes Werkzeug zur Identifizierung oder Bestätigung von PPI. Das Studium von PPI kann jedoch eine Herausforderung sein, wenn die interagierenden Proteine einen niedrigen Expressionsgrad aufweisen oder wenn die Wechselwirkunge....
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Protokoll
1. Plasmidkonstruktion
- Amplify by two PCR (PCR1 and 3) the DNA sequences (use genomic DNA of P. aeruginosa PAO1) of the 700 base pairs up und downstream of the regions corresponding to the insertion site in P. aeruginosa genome with high-fidelity DNA polymerase. Fügen Sie Restriktionssites zu Primern in Blau und Grün hinzu, und fügen Sie eine überlappende Sequenz mit mCherry zu Primern in Rot hinzu (Abbildung 2).
- Für PvdA, das am C-Terminus mit eGFP gekennzeichnet ist, verstärken Sie die 700 bp-Region stromaufwärts relativ zum Stop-Codon durch die Primer in Blau, und verstärken Sie den 700 bp downstream....
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Ergebnisse
Empirische kumulative Verteilungsfunktionen (ecdf) der fluoreszenz-Lebensdauern, die für die verschiedenen Bakterienstämme gemessen wurden, sind in Abbildung 8dargestellt. Tritt FRET auf, werden die Ecdfs in Richtung der kürzeren Lebensdauern verschoben (Abbildung 8A,8B). Beachten Sie, dass, wenn die Wechselwirkung der beiden Proteine zu einem langen Abstand zwischen den beiden Fluorophoren führt, kein FRET auftreten kann (A.......
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Diskussion
FLIM-FRET bietet einige wichtige Vorteile gegenüber der intensitätsbasierten FRET-Bildgebung. Die Fluoreszenzlebensdauer ist ein intrinsischer Parameter des Fluorophors. Infolgedessen ist sie weder von lokalen Fluorophorkonzentrationen noch von der Intensität der Lichterregung abhängig. Die Fluoreszenzlebensdauer wird zusätzlich auch durch Photobleichungen schlecht beeinflusst. Besonders interessant ist der Nachweis von PPI in Zellen, in denen die Konzentrationen lokaler Proteine in den subzellulären Kompartimenten oder .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir würdigen Dr. Ludovic Richert für seine wertvolle Unterstützung bei der FLIM-Datenerfassung und bei der technischen Wartung und Entwicklung des FLIM-Setups. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/) finanziert. VN wird von der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906) gefördert. YM dankt dem Institut Universitaire de France (IUL) für die Unterstützung und zusätzliche Zeit, um sich der Forschung zu widmen. IJS und JG würdigen das Institut für Arzneimittellieferung in Straßburg für seine finanzielle Unterstützung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 525/50 nm Bandpassfilter | F37-516, AHF, Deutschland | ||
| 680 nm Kurzpassfilter | F75-680, AHF, Deutschland | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammoniumsulfat (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA-Polymerase 5U/μ L | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fasergekoppelte Avalanche-Photodiode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glasdeckgläser (Dicke Nr. 1,5, 20-fach; 20mm | Knitel Glas | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA-Polymerase Phusion 2U/μ L | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogenese Bouillon (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesiumsulfat Heptahydrat (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Objektträger (25-fach; 75mm) | Knitel Glas | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel und PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Kaliumphosphat zweibasisch (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Natrium Succinat (Dinatrium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM Software | Becker & Hickl | ||
| Sterile Impföse | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA-Ligase 1U/μ L | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC Modul | SPC830, Becker & Hickl, Deutschland | ||
| Ti:Saphir Laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
Referenzen
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of....
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Nachdrucke und Genehmigungen
