Method Article

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

DOI:

10.3791/61612

⸱

July 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Abstract

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Transposon-Sequenzierung (Tn-seq) ist eine leistungsstarke Methode, die Transposon-Mutagenese und massive parallele Sequenzierung kombiniert, um Gene und Wege zu identifizieren, die zur bakteriellen Fitness unter einer Vielzahl von Umweltbedingungen beitragen. Tn-seq-Anwendungen sind umfangreich und haben nicht nur die Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen auf Organismusebene ermöglicht, sondern auch auf Populations-, Gemeinschafts- und Systemebene. Gram-negative Bakterien sind stark mit antimikrobiellen Resistenz Phänotypen verbunden, die erhöhte Vorfälle von Antibiotika-Behandlungsversagen hat. Antimikrobielle Resistenz ist definiert als bakterielles Wachstum in Gegenwart von ansonsten tödlichen Antibiotika. Das antimikrobielle Colistin der "letzten Linie" wird zur Behandlung von gramnegativen bakteriellen Infektionen eingesetzt. Jedoch, mehrere Gram-negative Krankheitserreger, einschließlich Acinetobacter baumannii kann Colistin-Resistenz durch eine Reihe von molekularen Mechanismen entwickeln, von denen einige mit Tn-seq charakterisiert wurden. Darüber hinaus variieren Signaltransduktionswege, die die Colistinresistenz regulieren, innerhalb gramnegativer Bakterien. Hier schlagen wir eine effiziente Methode der Transposon-Mutagenese in A. baumannii vor, die die Erzeugung einer sättigenden Transposon-Einfügungsbibliothek und amplicon-Bibliothekskonstruktion rationalisiert, indem die Notwendigkeit von Restriktionsenzymen, Adapterligation und Gelreinigung entfällt. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine eingehende Analyse molekularer Determinanten, die zur A. baumannii-Fitness beitragen, wenn sie mit Colistin herausgefordert werden. Das Protokoll gilt auch für andere Gram-negative ESKAPE-Erreger, die in erster Linie mit medikamentenresistenten Krankenhausinfektionen in Verbindung gebrachtwerden.

Introduction

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Die Entdeckung von Antibiotika ist zweifellos eines der folgenreichsten gesundheitsbezogenen Ereignisse des20. Jahrhunderts. Antibiotika lösen nicht nur schwere bakterielle Infektionen schnell auf, sie spielen auch eine zentrale Rolle in der modernen Medizin. Größere Operationen, Transplantationen und Fortschritte in der Neonatalmedizin und Chemotherapie lassen Patienten anfällig für lebensbedrohliche Infektionen und diese Therapien wären ohne Antibiotika nicht möglich1,2. Jedoch, schnelle Entwicklung und Ausbreitung der Antibiotikaresistenz unter menschlichen Krankheitserregern hat die Wirksamkeit aller klinisch wichtigen Klassen von Antibiotika deutlich verringert3. Viele bakterielle Infektionen, die einst leicht mit Antibiotika-Behandlung entimiert wurden, reagieren nicht mehr auf klassische Behandlungsprotokolle, was eine ernsthafte Bedrohung für die globale öffentlicheGesundheit1 . Antimikrobielle Resistenz (AMR) ist, wo Bakterienzellen in ansonsten tödlichen Konzentrationen von Antibiotika wachsen, unabhängig von der Behandlungsdauer4,5. Es ist dringend notwendig, molekulare und biochemische Faktoren zu verstehen, die AMR regulieren, was dazu beitragen wird, die alternative antimikrobielle Entwicklung zu steuern. Insbesondere ESKAPE-Erreger sind im klinischen Umfeld problematisch und mit umfangreicher AMR verbunden. Dazu gehören Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp. Während mehrere Mechanismen bei ESKAPE-Erregern zur AMR beitragen, sind die letzten vier Organismen gramnegativ.

Gram-negative Bakterien montieren eine definierende äußere Membran, die sie vor widrigen Umweltbedingungen schützt. Die äußere Membran dient als Durchlässigkeitsbarriere, um den Eintritt toxischer Moleküle wie Antibiotika in die Zelle zu beschränken. Im Gegensatz zu anderen biologischen Membranen ist die äußere Membran asymmetrisch. Die äußere Packungsbeilage ist mit oberflächenexponiertem Lipopolysaccharid angereichert, während die innere Packungsbeilage eine Mischung aus Phospholipiden6ist. Lipopolysaccharidmoleküle werden durch ein konserviertes Lipid A-Moiety, das in die Lipid-Bilayer7eingebettet ist, an der äußeren Membran verankert. Das kanonische Lipid Eine Domäne von Escherichia coli Lipopolysaccharid wird für das Wachstum der meisten Gram-negativen Bakterien benötigt und wird durch einen neunstufigen enzymatischen Weg synthetisiert, der einer der grundlegendsten und konserviertesten Wege in Gram-negativen Organismen6,7,8ist.

Polymyxine sind kationische antimikrobielle Peptide, die auf die Lipid-A-Domäne von Lipopolysaccharid abzielen, um die äußere Membran zu stören und die Zelle zu lysen. Die elektrostatische Wechselwirkung zwischen positiv geladenen Rückständen von Polymyxinen und den negativ geladenen Lipid-A-Phosphatgruppen stören die bakterielle Zellmembran, was letztlich zum Zelltod9,,10,11,12,13führt. Colistin (Polymyxin E) ist ein letztes Mittel antimikrobielle zur Behandlung von Infektionen durch multiresistente Gram-negative nosokomiale Krankheitserreger, wie Acinetobacter baumannii14,15,16. Erstmals 1947 entdeckt, werden Polymyxine von den Bodenbakterien Paenibacillus polymyxa17,18,19produziert. Polymyxine wurden zur Behandlung von Gram-negativen Infektionen jahrelang verschrieben, bevor ihre klinische Anwendung aufgrund von Berichten über signifikante Nephro- und Neurotoxizität20,21begrenzt war.

A. baumannii ist ein nosokomialer Gram-negativer Erreger, der die Morbidität und Sterblichkeit der Patientenergebnisse in den letzten Jahrzehnten dramatisch erhöht hat22. Was einst als ein schwacher Erreger galt, stellt heute ein erhebliches Risiko für krankenhauserworbene Infektionen auf der ganzen Welt aufgrund seiner unglaublichen Fähigkeit, AMR zu erwerben und hohes Risiko der Epidemie23,24. A. baumannii ist für mehr als 10% der nosokomialen Infektionen in den Vereinigten Staaten. Krankheit manifestiert sich als Lungenentzündung, Bakteriämie, Harnwegsinfektionen, Haut- und Weichteilinfektionen, Meningitis und Endokarditis25. Behandlungsmöglichkeiten für A. baumannii Infektionen sind aufgrund der Resistenz gegen fast alle Antibiotika-Klassen, einschließlich β-Lactams, Fluorchinolone, Tetracyclin, und Aminoglykoside23,24. Die Prävalenz multiresistenter, extensiv medikamentenresistenter und pan-drogenresistenter A. baumannii-Isolate hat zu einem Wiederaufleben der Colistin-Behandlung geführt, die als eine der wenigen verbleibenden therapeutischen Optionen angesehen wurde, die noch wirksam gegen multiresistente A. baumanniisind. Jedoch, erhöhte Colistin Resistenz unter A. baumannii Isolate hat seine Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit weiter verstärkt10,11,12,13,27,30,31.

Die jüngsten Fortschritte bei den Sequenzierungstechnologien mit hohem Durchsatz, wie z. B. die Transposonsequenzierung (Tn-seq), haben wichtige Werkzeuge geliefert, um unser Verständnis der bakteriellen Fitness in vitro und in vivozu verbessern. Tn-seq ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das genutzt werden kann, um Gennotyp-Phänotyp-Wechselwirkungen bei Bakterien zu untersuchen. Tn-seq ist allgemein anwendbar auf bakterielle Krankheitserreger, wo es traditionelle Transposon-Mutagenese mit massiver paralleler Sequenzierung zu schnellen Karteneinfügungsstellen kombiniert, die verwendet werden können, um DNA-Mutationen mit phänotypischen Varianten im genomweiten Maßstab32,33,34,35zu verknüpfen. Während Transposon-Mutagenese-Methoden bereits beschrieben wurden, sind die allgemeinen Schritte ähnlich33. Zunächst wird eine Insertionsbibliothek mittels Transposon-Mutagenese erzeugt, wobei jede Bakterienzelle innerhalb einer Population auf eine einzelne Transposon-Insertion in die genomische DNA (gDNA) beschränkt ist. Nach der Mutagenese werden einzelne Mutanten gepoolt. gDNA wird aus dem Insertionsmutantpool extrahiert und die Transposonknoten verstärkt und einer Hochdurchsatzsequenzierung unterzogen. Die Lesevorgänge stellen Einfügestellen dar, die dem Genom zugeordnet werden können. Transposon-Einfügungen, die die Fitness reduzieren, fallen schnell aus der Bevölkerung, während nützliche Einfügungen bereichert werden. Tn-seq war maßgeblich daran beteiligt, unser Verständnis dafür zu fördern, wie Gene die bakterielle Fitness in Stress beeinflussen33.

Das in pJNW684 kodierte Himar1-Marinetransposonsystem wurde speziell für die Transposon-Mutagenese konstruiert und optimiert. Es enthält ein Mariner-Familientransposon, das das Kanamycin-Resistenzgen flankiert, das für die Auswahl von Transposoninsertionsmutanten in A. baumannii verwendet wird. mariner Es kodiert auch einen A. baumannii spezifischen Promotor, der die Expression des Transposase-Codierungsgens36antreibt. Das marinebasierteTransposon enthält auch zwei translationale Terminatoren nach dem Kanamycin-Resistenzgen, die ein Durchlesen flussabwärts der Insertion37verhindern. pJNW684 enthält auch einen RP4/oriT/oriR6K-bedingten Replikationsursprung, der das vom Spenderstamm beigesteuerte 'pir-Gen erfordert, um38zu replizieren. In Ermangelung des Gens von 'pir' kann sich der pJNW684-Vektor, der die Transpositionsmaschinerie trägt, nicht im A. baumannii-Empfängerstamm 10,36,38replizieren. Daher wird während der bakteriellen Konjugation nur das Transposon in das Empfängergenom ohne Hintergrundeinfügung des Plasmids eingeführt, das das Transposase-Gen trägt. Dies ist wichtig, da der Verlust der Transposaseaktivität zusammen mit dem Plasmid zu einem einzigen, stabilen Transpositionsereignis führt, das verhindert, dass sich das Transposon an verschiedene Stellen bewegt, sobald es in das Empfängergenom einfügt.

pJNW648 wurde auch auf Aktivität in einem anderen gramnegativen Organismus, E. coli,getestet. Die erfolgreiche Montage einer sättigenden Tn-seq-Bibliothek im E. coli-Stamm W3110 zeigte, dass das System für die Durchführung von Mutagenese bei einer Vielzahl von Krankheitserregern, einschließlich Enterobacteriaceae, geeignet ist. Darüber hinaus kann der a. baumannii-spezifische Promotor, der den Transposase-Ausdruck antreibt, schnell mit einem artspezifischen Promotor ausgetauscht werden. Schließlich kann das Kanamycin-Resistenzgen in andere Resistenzkassetten ausgetauscht werden, abhängig vom AMR-Phänotyp des untersuchten Organismus.

Ein Faktor, der zur Colistinresistenz bei A. baumannii beiträgt, ist die Verabreichung unzureichender Dosen, bei denen Bakterien selektivem Druck auf nicht-tödlichen Ebenen ausgesetzt sind39. Mehrere Berichte zeigten, dass subhemmende antimikrobielle Konzentrationen regulierte Reaktionen induzieren können, die die Zellphysiologie verändern, um die Anfälligkeit der gesamten Bakterienpopulation zu reduzieren11,12,30,31. Mit Tn-seq entdeckten wir Faktoren, die die Colistinresistenz im A. baumannii-Stamm ATCC 17978 nach Exposition gegenüber hemmenden10 und subhemmenden Konzentrationen von Colistin regulieren. In diesem Beispiel wird eine Tn-seq-Methode erläutert, die den Aufbau und die Anreicherung einer gesättigten Transposon-Mutantenbibliothek mithilfe der auf Seetierenbasierenden Transposons-Familie40,41optimiert. Während mehrere Tn-seq-Protokolle 20.000 - 100.000 Mutanten35,42,43,44,45,46erzeugen, kann das hier beschriebene Protokoll schnell eine Transposonbibliothek von 400.000 + Mutanten erzeugen, was in etwa einer Transposoneinfügung in A. baumannii10entspricht. Darüber hinaus kann die Bibliotheksgröße ohne erheblichen zusätzlichen Aufwand vergrößert werden. Diese Methode eliminiert auch die Anforderung für Restriktionsendonukleasen, Adapterligation und Gelreinigung, die die endgültige Bibliotheksvielfalt reduzieren können.

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Protocol

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1. Bakterielle Stammvorbereitung

  1. Streichen Sie den "Spender"-Stamm (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Materialtabelle) für isolierte Kolonien auf Luria-Bertani-Agar, ergänzt mit 600 M Diaminopimelsäure (DAP), 100 mg/L Ampicillin und 25 mg/L Kanamycin. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Mit einer einzigen isolierten Kolonie, impfen 50 ml Luria Brühe (LB) ergänzt mit 600 'M DAP, 100 mg/L Ampicillin und 25 mg/L Kanamycin in einem 250 ml Erlenmeyer Kolben und kennzeichnen Sie es als "Spender".
  2. Streifen Sie den "Empfänger" Stamm (A. baumannii Stamm ATCC 17978, Tabelle der Materialien) für isolierte Kolonien auf Luria-Bertani Agar. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Mit einer einzigen isolierten Kolonie, impfen 50 ml LB in einem 250 ml Erlenmeyer Kolben und beschriften Sie es als "Empfänger".
  3. Inkubieren Sie beide Kulturen ("Spender" und "Empfänger") über Nacht bei 37 °C mit Schütteln.

2. Bakterielle Paarung

  1. Übernachtkulturen auf 50 ml konische Röhren übertragen.
  2. Pellet sowohl Empfänger- als auch Spenderkulturen mit Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
  3. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das "Spender"-Stammpellet in 35 ml LB, ergänzt mit DAP, wieder aus, um Restantibiotika abzuwaschen.
  4. Pellet der "Spender" Stammzellen mit Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
  5. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das "Spender"-Stammpellet in 4,5 ml LB, ergänzt durch DAP, wieder aus. Verwenden Sie eine 10 ml serologische Pipette.
  6. Übertragen Sie den resuspendierten "Spender"-Stamm in das "Empfänger"-Stammrohr, das die pelletierten "Empfänger"-Zellen enthält. Verwenden Sie die gleiche 10 ml serologische Pipette aus Schritt 2.5, um die Kulturen zu mischen. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt.
    HINWEIS: Das Gesamtvolumen der Endsuspension sollte 5 ml betragen.
  7. Verteilen Sie die Stecksuspension als einzelne 100-L-Tröpfchen auf LB-Agarplatten, ergänzt durch DAP (5-7 Tröpfchen pro Platte)(Abbildung 1A).
  8. Inkubieren Sie Platten bei Raumtemperatur für 30 min.
  9. Ohne die Tröpfchen zu stören, die Platten vorsichtig auf einen 37 °C-Inkubator übertragen und Kulturen für 1 h verpaarenlassen.
    HINWEIS: Inkubationszeiten von mehr als 1 h riskieren die Erzeugung von Schwestermutanten.
  10. Nach der Inkubation 1,5 ml LB auf jede Platte geben und ernten, indem Sie Bakterien von den Platten wieder aufhängen. Verwenden Sie eine 1 ml Mikropipette für die Resuspension. Das Endvolumen sollte ca. 12 - 15 ml betragen.
  11. Kombinieren Sie geerntete Zellen in einem 50 ml konischen Rohr.
  12. Pellet die gepaarten Zellen mit Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
  13. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie Zellen in 50 ml LB wieder auf, um Rest-DAP zu entfernen.
  14. Pellet die Paarung mit Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
  15. Wiederholen Sie den Waschschritt (Schritte 2.13 und 2.14).
  16. Mit einer 10 ml serologischen Pipette, setzen Sie das Pellet in 10 ml LB ergänzt mit 25% Glycerin.
  17. Mit gewaschenen Zellen fünf serielle Verdünnungen in LB-Brühe (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Verteilen Sie 100 l jeder Verdünnung auf 4 verschiedene Platten mit sterilen Glasperlen: Luria-Bertani Agar ergänzt mit Kanamycin, Agar mit Ampicillin ergänzt, Agar mit DAP und Agar nur ergänzt.
  19. Platten bei 37 °C über Nacht inkubieren.
  20. Die verbleibende Paarung in 1 ml Aliquots aliquotes aliquotieren und bei -80 °C lagern.

3. Bestimmen Sie die geeignete Verdünnung der Transposonbibliothek

  1. Zeichnen Sie koloniebildende Einheiten (CFU) von Nachtplatten auf.
  2. Stellen Sie sich eine Platte mit zählbaren Kolonien für jede einzelne Plattenbedingung vor (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Sowohl "Spender" als auch "Empfänger" Stämme sollten auf Agarplatten wachsen, die mit DAP ergänzt werden, so dass die meisten plattierten Verdünnungen einen Rasen ergeben. Nur die "Empfänger"-Sorte kann auf Agarplatten wachsen. Weder der "Spender" noch der "Empfänger" Stamm kann auf Agarplatten wachsen, die mit Ampicillin ergänzt werden, so dass es kein/minimales Wachstum geben sollte. Nur Zielstammzellen, die die Transposon-Einfügung kodieren, können auf Agarplatten wachsen, die mit Kanamycin ergänzt werden. Kolonien sollten in der Größe variieren, was auf Transposon-Einfügungen in Gene hindeutet, die zur Fitness auf Agar beitragen, die mit Kanamycin ergänzt werden.
  3. Berechnen Sie die Anzahl der Transposonmutanten in der gefrorenen Paarung, indem Sie die Anzahl der Kolonien auf LB-Agarplatten zählen, die mit Kanamycin ergänzt werden.
    HINWEIS: Für das A. baumannii Genom (ca. 4 Mbit/s) war das Ziel, etwa 400.000 Kolonien zu erhalten, um eine hochauflösende Mutantenbibliothek (etwa ein Transposoninsertion/10 Basenpaare) zu erzeugen. Diese Zahl sollte jedoch auf der Grundlage der Genomgröße der Zielart optimiert werden).

4. Generierung der endgültigen bakteriellen Mutantenbibliothek

  1. Ein Aliquot der gefrorenen Paarung auf Eis auftauen.
  2. Plattenpaarung auf 150 mm Luria-Bertani Agarplatten, ergänzt mit Kanamycin auf Basis von KBE, berechnet in Schritt 3.1. Passen Sie das Volumen mit LB an, um 13.333 Kolonien pro 150 l vor der Beschichtung zu ergeben.
    ANMERKUNG: Die KBE-Zahl wurde hier auf etwa 105 KBE/ml festgelegt, so dass das Paarungsvolumen angepasst wurde, um 13.333 Kolonien pro Platte zu erhalten, da dies eine optimale Anzahl von Kolonien auf 30 Platten für eine hochauflösende Mutantenbibliothek ohne Überfüllung der Platten bieten würde.
  3. Verwenden Sie sterile Glasperlen, um 150 l der Verdünnung pro Platte auf 30 x 150 mm Luria-Bertani Agarplatten zu verteilen, die mit Kanamycin ergänzt werden, um 400.000 Kolonien zu erhalten (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Sterile Stäbe oder jede Art von sterilem Streuwerkzeug (d. h. Glasperlen) können verwendet werden, um die Bakterien auf Platten zu verbreiten.
  4. Entsorgen Sie das verwendete Rohr, das eine übermäßige Paarung enthält.
    HINWEIS: Frost-/Tauzyklen erhöhen selektive Drücke auf die Bakterienkultur, die die Ergebnisse des Tn-seq-Experiments verzerren können. Verwenden Sie jedes Mal ein frisches Aliquot.
  5. Platten bei 37 °C für 14 h inkubieren.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit ist optimiert, um Überwucherung zu verhindern (Kolonien berühren). Es wird vorgeschlagen, das Wachstum durch verkürzung der Inkubationszeit zu minimieren.

5. Schätzen der Bibliotheksdichte und Pooling für die Speicherung

  1. Zählen Sie KBE auf jeder Platte, um die Gesamtmutanten in der Transposonbibliothek zu schätzen. Zählen Sie 20 % von mindestens 3 Platten, um die Schätzung der Kolonieanzahl für die gesamte Plattengruppe zu bestimmen (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass die Kolonien keine andere Kolonie berühren.
  2. Nach der Berechnung des geschätzten Kolonieertrags 3-5 ml (oder bei Bedarf mehr) zu jeder Platte hinzufügen und die Bakterien mit einem sterilen Abkratzwerkzeug abkratzen.
    HINWEIS: Sterile Impfschlaufen wurden verwendet, um Platten effizient zu kratzen.
  3. Bakterielle Suspensionen von allen Platten in 50 ml konische Rohre bündeln (Abbildung 1D). Dies erfordert mehrere 50 ml konische Rohre, mindestens 3.
  4. Pellet gepoolte bakterielle Suspension mit Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
  5. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie Pellet in 5 ml LB mit 30% Glycerin ergänzt auf.
  6. Aliquot 1 ml der Transposonbibliothek in Kryovials und lagern bei -80 °C.

6. Identifizierung von Faktoren, die die Colistinresistenz in A. baumannii regulieren

  1. 4 x 250 ml Erlenmeyerkolben mit jeweils 50 ml LB Brühe und Etikett als (Abbildung 2B) vorbereiten
    1. A. baumannii Stamm ATCC 17978 Tn-seq Bibliothek; (-) colistin_1
    2. A. baumannii Stamm ATCC 17978 Tn-seq Bibliothek; (-) colistin_2
    3. A. baumannii Stamm ATCC 17978 Tn-seq Bibliothek; (+) colistin_1
    4. A. baumannii Stamm ATCC 17978 Tn-seq Bibliothek; (+) colistin_2
      HINWEIS: In der hier beschriebenen Herausforderung wird jede Bedingung, (-) Colistin-Kontrolle und (+) Colistin-Herausforderung in doppelter Ausführung getestet. Daher erfordert die Einrichtung 4 x 250 ml Erlenmeyer Kolben, zwei pro Bedingung.
  2. 50 l mit 0,5 mg/L Colistin zu (+) Colistinkolben (6.1.3 und 6.1.4) und 50 l Wasser zu (-) Colistinkolben (6.1.1 und 6.1.2) hinzufügen.
  3. Tauen Sie eine gefrorene Tn-seq Bibliothek aliquot aus Schritt 5 auf Eis.
  4. Pipette 1 l der aufgetauten Bibliothek in 1 ml PBS.
  5. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und multiplizieren Sie sie mit 1.000.
    HINWEIS: Dies ermittelt OD600 von 1 L der Tn-Bibliothek.
  6. Basierend auf der Berechnung in Schritt 6.5, impfen Sie jeden Kolben mit 50 ml LB bis zu einem endgültigen OD600 0.001.
  7. Kulturen in einem Schüttelinkubator bei 37 °C bis OD600 0.5 anbauen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass Die Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase bleiben, sodass die OD600 angepasst werden muss, um sicherzustellen, dass sich die Kultur innerhalb der logarithmischen Wachstumsphase so oft wie möglich repliziert, wenn ihr Stamm während des exponentiellen Wachstums auf einer anderen OD600 liegt. Wenn sich die Kultur nur dreimal repliziert, ist die Fähigkeit, Fitnessfehler bei Mutanten zu erkennen, theoretisch auf 3-fache Unterschiede begrenzt. Da verschiedene Bakterien unterschiedliche Verdoppelungszeiten haben, ist es wichtig, die Kulturen an einem festen OD600 auszusäen, um das Beginneninokulum zu normalisieren. Dies gewährleistet eine konsistente Darstellung der gesamten Bibliothek in allen Kulturen.
  8. Erntekulturen mit Zentrifugation bei 5.000 x g bei 4 °C für 7 min.
  9. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 50 ml PBS.
  10. Pellet mit Zentrifugation bei 5.000 x g bei 4 °C für 7 min.
  11. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder auf. Aliquot - 200 l in 5 Mikrozentrifugenröhren.
  12. Pellet mit Zentrifugation bei 5.000 x g bei 4 °C für 5 min. Entfernen Sie den gesamten Überstand mit einer Pipettenspitze.
  13. Pellets bei -20 °C lagern oder mit der gDNA-Extraktion fortfahren.

7. gDNA-Extraktion

  1. Ein Zellpellet auf Eis auftauen.
  2. Fügen Sie 0,6 ml Lysepuffer (Materialtabelle) und Wirbel hinzu, um das Pellet vollständig wieder aufzuhängen.
  3. Bei 37 °C für 1 h inkubieren.
  4. 0,6 ml Phenol/Chlorform/Isoamylalkohol in die Probe geben und kräftig wirbeln.
  5. Separate Phasen mit Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur für 5 min.
  6. Übertragen Sie die obere wässrige Phase auf eine neue Röhre. Vermeiden Sie es, die Phasenschnittstelle während der Übertragung zu stören.
  7. Fügen Sie der oben erhaltenen wässrigen Phase ein gleiches Chloroformvolumen hinzu und wirbeln Sie kräftig.
  8. Separate Phasen mit Zentrifugation in Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur für 5 min.
  9. Übertragen Sie die obere wässrige Phase auf eine neue Röhre.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Schnittstelle während der Übertragung nicht zu stören.
  10. 2,5x wässrige Phase Volumen von kaltem 100 % Ethanol hinzufügen und schonend mischen. Gefällte DNA wird sichtbar sein.
  11. Rohr mindestens 1 h bei -80 °C stellen.
  12. Pellet-DNA mit Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C für 30 min.
  13. Entfernen Sie überstand es sorgfältig, ohne das DNA-Pellet zu stören, und waschen Sie es mit 150 l 70 % Ethanol durch Pipettieren.
  14. Pellet-DNA mit Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C für 2 min.
  15. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
  16. Wiederholen Sie Schritt 7.14 einmal. Entfernen Sie vorsichtig alle verbleibenden Ethanol.
  17. Trockene DNA durch Inkubation bei Raumtemperatur für 5-10 min.
  18. Resuspend DNA-Pellet in 100 l TE-Puffer durch Pipettieren.

8. DNA-Scherung (Abbildung 3A)

  1. Verdünnen Sie gDNA mit TE-Puffer auf eine Konzentration von 250 ng/ml bei einem Gesamtvolumen von 200 l.
  2. Rohre in einen Wasserbad-Beschallungsgerät legen.
  3. Beschallen Sie DNA, um Fragmente von etwa 300 Nukleotiden zu ergeben. Leistung: 60 %, Gesamtzeit: 20 min, Zyklen: 10 s EIN und 10 s AUS bei 4 °C (Abbildung 3A).
  4. Bestätigen Sie, dass die DNA angemessen geschert wird, indem 10 l ungehörte DNA und 10 l gescherte DNA auf einem 1% Agarose-Gel getrennt werden. Beschallung wiederholen oder nach Bedarf optimieren (Abbildung 3B).

9. Poly-C Schwanzzusatz zum 3'-Ende (Abbildung 3A)

  1. Poly-C-Reaktion gemäß Tabelle 1 einrichten.
  2. Inkubationsreaktion bei 37 °C für 1 h.
  3. Reinigen Sie die Poly-C-Reaktion mit 40 L paramagnetischen Perlen der Größenauswahl (Abbildung 3A), indem Sie die folgenden Schritte befolgen.
    1. Fügen Sie jeder Probe 40 L paramagnetische Perlen der Größenauswahl hinzu. Wirbel 5 s oder Pipette rauf und runter.
    2. Inkubieren Sie Proben bei Raumtemperatur für 5 min.
    3. Kurz gesagt, Zentrifugenrohre, um Flüssigkeit in der Unterseite des Rohres zu sammeln (ca. 2 s).
    4. Übertragen Sie die Rohre in ein magnetisches Rack und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für ca. 2 min, bis die Lösung klar ist.
    5. Mit Rohren auf magnetischen Rack, vorsichtig entfernen Sie den Überstand.
    6. Mit Rohren auf magnetischem Rack, fügen Sie 200 l frisch zubereitete 80% Ethanol (nicht stören Perlen).
    7. Inkubieren Sie Proben für mindestens 30 s, bis die Lösung klar ist.
    8. Mit Rohren auf magnetischen Rack, vorsichtig entfernen Sie den Überstand.
    9. Wiederholen Sie den Waschschritt (Schritte 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Sammeln Sie Flüssigkeit im Boden des Rohres mit einem kurzen Zentrifugationsschritt (ca. 2 s).
    11. Übertragen Sie Die Rohre auf das Magnetgestell und entfernen Sie die verbleibende Flüssigkeit.
    12. Bei Raumtemperatur für 2-5 min inkubieren, um Proben zu trocknen. Nicht übertrocknen.
    13. Entfernen Sie die Rohre aus dem magnetischen Rack und fügen Sie jeweils 25 L Wasser hinzu. Wirbel für 5 s oder Pipette rauf und runter.
    14. Kurz gesagt, Zentrifugenrohre, um Flüssigkeit in der Unterseite des Rohres zu sammeln (ca. 2 s).
    15. Übertragen Sie die Rohre auf das Magnetgestell und lassen Sie sie für ca. 2 min sitzen, bis die Lösung klar ist.
    16. Mit Röhren auf dem magnetischen Rack, entfernen Sie Flüssigkeit, ohne die Perlen zu stören und in ein neues Rohr zu übertragen (ca. 23 L DNA).

10. Transposon-Kreuzungsverstärkung (Abbildung 3A)

  1. PCR 1 wie in Tabelle 1 für die erste verschachtelte PCR beschrieben einrichten (Tabelle 2).
  2. Führen Sie PCR 1 unter Verwendung der in Tabelle 1 beschriebenen Bedingungen aus.
  3. Reinigen Sie PCR-Produkte mit 40 L paramagnetischen Perlen der Größenauswahl (Schritte 9.3.1 – 9.3-12). Elute in 50 l Wasser (Schritte 9.3.13 – 9.3.16). An dieser Stelle können die Proben bei -20 °C gelagert werden.
  4. Bereiten Sie Streptavidin-gekoppelte paramagnetische Perlen vor:
    1. Streptavidin Perlen durch kräftiges Schütteln resuspendieren.
    2. Fügen Sie 32 L Perlen pro Probe in ein frisches Mikrozentrifugenrohr.
      HINWEIS: Perlen für 6 + Proben können in einem einzigen Rohr hergestellt werden.
    3. Übertragen Sie das Rohr in ein magnetisches Rack. Inkubieren Sie für ca. 2 min, bis die Lösung klar ist.
    4. Mit Rohr auf magnetischen Rack, entfernen Überstand.
    5. Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Rack. Waschen Sie Perlen, indem Sie in 1 ml 1x B&W Puffer durch Pipettieren nach oben und unten.
    6. Übertragen Sie das Rohr auf magnetisches Rack. Inkubieren Sie für ca. 2 min, bis die Lösung klar ist.
    7. Entfernen Sie mit dem Rohr auf dem magnetischen Rack den Überstand.
    8. Wiederholen Sie den Waschschritt mit 1 ml 1x B&W Puffer (Schritte 10.4.5 – 10.4.7) zweimal mehr für insgesamt 3 Waschungen.
    9. Entfernen Sie die Röhre aus dem magnetischen Rack und setzen Sie die Perlen in 52 L 2x B&W-Puffer pro Probe wieder auf.
  5. Kombinieren Sie 50 l der vorbereiteten Perlen mit 50 l gereinigtem PCR1 (ab Schritt 10.3). Pipette zu mischen.
  6. Drehen Bei Raumtemperatur für 30 min.
  7. Ungebundene DNA wegwaschen:
    1. Kurz gesagt, Zentrifuge, um Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln (ca. 2 s).
    2. Übertragen Sie das Rohr auf magnetisches Rack. Inkubieren Sie für ca. 2 min, bis die Lösung klar ist.
    3. Entfernen Sie mit dem Rohr auf dem magnetischen Rack den Überstand.
    4. Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Rack, waschen Sie Perlen, indem Sie in 100 l 1x B&W Puffer und Pipettiernach oben und unten.
    5. Transferrohr auf magnetisches Rack. Inkubieren Sie für ca. 2 min, bis die Lösung klar ist.
    6. Mit Rohr auf magnetischen Rack, entfernen Überstand.
    7. Wiederholen Sie die Waschschritte mit 100 l LoTE (Schritte 10.7.4 – 10.7.6) zweimal mehr für insgesamt 3 Waschungen.
  8. PCR 2 wie in Tabelle 1 beschrieben einrichten, um Transposon-Knoten zu verstärken und jeder Stichprobe einen einzigen Barcode hinzuzufügen(Tabelle 2 und Tabelle 3).
  9. Führen Sie PCR 2 unter Verwendung der in Tabelle 1 beschriebenenBedingungen aus.
  10. Reinigen Sie mit 40 L paramagnetischen Perlen der Größenauswahl (Schritte 9.3.1 – 9.3.12). Elute in 17 l Wasser (Schritte 9.3.13 – 9.3.16), sammeln Sie 15 l.
  11. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. Die Endkonzentrationen sollten 50 bis 250 ng/l betragen.
  12. Beurteilung der DNA-Qualität mit einer chipbasierten Kapillarelektrophorese (Abbildung 4A).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die skizzierten Methoden beschreiben die Erzeugung einer Transposonbibliothek mit hoher Dichte im A. baumannii-Stamm ATCC 17978 durch bakterielle Konjugation mit E. coli MFD DAP- ,die das Plasmid pJNW684 repliziert (Abbildung 4B). Das detaillierte Protokoll verwendet die bielte bakterielle Konjugation für die Übertragung von pJNW684 vom E. coli-Pir+ Spenderstamm auf den A. baumannii-Empfängerstamm. Dies ist eine effiziente und kosteng...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. baumannii ist eine neue Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit aufgrund der schnellen Übernahme von AMR gegen "Last-Line"-Therapeutika, wie Colistin10,11,12,23,24,30,31. In den letzten Jahrzehnten hat Tn-seq eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung von Genotyp-Phänot...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des National Institute of Health (Grant AI146829 an J.M.B.) unterstützt und wird dankbar anerkannt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM ddCTP, 2',3'-Didesoxycytidin-5'-TriphosphatAffymetrix77112
100 mM dCTP 2'-Desoxycytidin-5'-TriphosphatInvitrogen10217-016
100bp DNA-Leiter MolekulargewichtsmarkerPromegaPR-G2101
100mm x 15mm PetrischalenCorning351029
150mm x 15mm PetrischalenCorning351058
1X B& WN/AN/AVerdünnung 2X B& W um die Hälfte, um 1X B&W zu erhalten.
2,6-DiaminopimelsäureAlfa AesarB2239103bei 600 & Mikro; M
2X B& WN/AN/AZugabe von 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7,5) in Wasser. Wird mit Streptavidin-Kügelchen verwendet. Lösungen halten sich bei Raumtemperatur.
50 ml konische sterile Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenFisher Scientific12-565-271
9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTPN/AN/A9,5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85,5 ml Wasser. Bei -20 °C lagern.
AccuPrimeTM Pfx DNA PolymeraseInvitrogen12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978ATCCN/AAmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)Fisher ScientificBP1760verwendet bei 100 mg/L
AMPure XP PCR-AufreinigungssystemBECKMAN COULTERA63881
BioAnalyzerAgilentG2939B
Bioanalysator Hochempfindliche DNA-AnalyseAgilent5067-4626
Desoxynukleotid-Lösungsmix (dNTP)New England Biolabs (NEB)N0447L
DynaMag-2 Magnetisches RackInvitrogen12321D
E.coli MFD Dap-N/AN/A N/ADAP Auxotroph, benötigt 600 mM exogen zugesetztes DAP, um zu wachsen. Enthält RP4-Maschinen für den Plasmidtransfer. Träger für JNW68 (36).
EthanolFisher ScientificA4094
Kryo-Fläschchen mit AußengewindeCorning09-761-71
GlasperlenCorning72684
GlycerolFisher ScientificG33
ImpfösenFisher Scientific22-363-602Schaberwerkzeug
KanamycinFisher ScientificBP906bei 25 mg/L
LB Agar, MillerFisher ScientificBP1425
LB Brühe, MillerFisher ScientificBP1426
LoTEN/AN/AZugabe von 3 mM Tris-HCl, 0,2 mM EDTA (pH 7,5) in Wasser. Wird mit Streptavidin-Kügelchen verwendet. Lösungen halten sich bei Raumtemperatur.
LysepufferN/AN/A9,34 mL TE Puffer; 600 ml 10 % SDS; 60 ml Proteinase K (20 mg/ml)
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1 Gemisch, pH 6,7/8,0, Liq.)Fisher ScientificBP1752I
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 10-fache LösungFisher ScientificBP39920verdünnt auf 1X
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33238
Qubit AnalyseröhrchenThermo FisherQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851
Ultraschallgerät mit Kühlschrank WasserbadQsonica SonicatorsQ2000FCE
Streptavidin Magnetic BeadsNew England Biolabs (NEB)S1420S
TE PufferN/AN/A10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8,0)
Endständige Desoxynukleotidyltransferase (rTdt)PromegaPR-M1875

References

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