Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Zusammenfassung

Transposon-Sequenzierung (Tn-seq) ist eine leistungsstarke Methode, die Transposon-Mutagenese und massive parallele Sequenzierung kombiniert, um Gene und Wege zu identifizieren, die zur bakteriellen Fitness unter einer Vielzahl von Umweltbedingungen beitragen. Tn-seq-Anwendungen sind umfangreich und haben nicht nur die Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen auf Organismusebene ermöglicht, sondern auch auf Populations-, Gemeinschafts- und Systemebene. Gram-negative Bakterien sind stark mit antimikrobiellen Resistenz Phänotypen verbunden, die erhöhte Vorfälle von Antibiotika-Behandlungsversagen hat. Antimikrobielle Resistenz ist definiert als bakterielles Wachstum in Gegenwart von ansonsten tödlichen Antibiotika. Das antimikrobielle Colistin der "letzten Linie" wird zur Behandlung von gramnegativen bakteriellen Infektionen eingesetzt. Jedoch, mehrere Gram-negative Krankheitserreger, einschließlich Acinetobacter baumannii kann Colistin-Resistenz durch eine Reihe von molekularen Mechanismen entwickeln, von denen einige mit Tn-seq charakterisiert wurden. Darüber hinaus variieren Signaltransduktionswege, die die Colistinresistenz regulieren, innerhalb gramnegativer Bakterien. Hier schlagen wir eine effiziente Methode der Transposon-Mutagenese in A. baumannii vor, die die Erzeugung einer sättigenden Transposon-Einfügungsbibliothek und amplicon-Bibliothekskonstruktion rationalisiert, indem die Notwendigkeit von Restriktionsenzymen, Adapterligation und Gelreinigung entfällt. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine eingehende Analyse molekularer Determinanten, die zur A. baumannii-Fitness beitragen, wenn sie mit Colistin herausgefordert werden. Das Protokoll gilt auch für andere Gram-negative ESKAPE-Erreger, die in erster Linie mit medikamentenresistenten Krankenhausinfektionen in Verbindung gebrachtwerden.

Einleitung

Die Entdeckung von Antibiotika ist zweifellos eines der folgenreichsten gesundheitsbezogenen Ereignisse des^20. Jahrhunderts. Antibiotika lösen nicht nur schwere bakterielle Infektionen schnell auf, sie spielen auch eine zentrale Rolle in der modernen Medizin. Größere Operationen, Transplantationen und Fortschritte in der Neonatalmedizin und Chemotherapie lassen Patienten anfällig für lebensbedrohliche Infektionen und diese Therapien wären ohne Antibiotika nicht möglich^1,2. Jedoch, schnelle Entwicklung und Ausbreitung der Antibiotikaresistenz unter menschlichen Krankheitserregern hat die Wirksamkeit ....

Protokoll

1. Bakterielle Stammvorbereitung

1. Streichen Sie den "Spender"-Stamm (E. coli MFD DAP^-/pJNW684, Materialtabelle) für isolierte Kolonien auf Luria-Bertani-Agar, ergänzt mit 600 M Diaminopimelsäure (DAP), 100 mg/L Ampicillin und 25 mg/L Kanamycin. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Mit einer einzigen isolierten Kolonie, impfen 50 ml Luria Brühe (LB) ergänzt mit 600 'M DAP, 100 mg/L Ampicillin und 25 mg/L Kanamycin in einem 250 ml Erlenmeyer Kolben und kennzeichnen Sie es als "Spender".
2. Streifen Sie den "Empfänger" Stamm (A. baumannii Stamm ATCC 17978, Tabelle der Materialien) für isolierte K....

Ergebnisse

Die skizzierten Methoden beschreiben die Erzeugung einer Transposonbibliothek mit hoher Dichte im A. baumannii-Stamm ATCC 17978 durch bakterielle Konjugation mit E. coli MFD DAP^{- ,}die das Plasmid pJNW684 repliziert (Abbildung 4B). Das detaillierte Protokoll verwendet die bielte bakterielle Konjugation für die Übertragung von pJNW684 vom E. coli-Pir+ Spenderstamm auf den A. baumannii-Empfängerstamm. Dies ist eine effiziente und kosteng.......

Diskussion

A. baumannii ist eine neue Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit aufgrund der schnellen Übernahme von AMR gegen "Last-Line"-Therapeutika, wie Colistin^{10,11,12,23,24,30,31}. In den letzten Jahrzehnten hat Tn-seq eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung von Genotyp-Phänot.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 mM ddCTP, 2',3'-Didesoxycytidin-5'-Triphosphat	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2'-Desoxycytidin-5'-Triphosphat	Invitrogen	10217-016
100bp DNA-Leiter Molekulargewichtsmarker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petrischalen	Corning	351029
150mm x 15mm Petrischalen	Corning	351058
1X B& W	N/A	N/A	Verdünnung 2X B& W um die Hälfte, um 1X B&W zu erhalten.
2,6-Diaminopimelsäure	Alfa Aesar	B2239103	bei 600 & Mikro; M
2X B& W	N/A	N/A	Zugabe von 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7,5) in Wasser. Wird mit Streptavidin-Kügelchen verwendet. Lösungen halten sich bei Raumtemperatur.
50 ml konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen	Fisher Scientific	12-565-271
9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP	N/A	N/A	9,5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85,5 ml Wasser. Bei -20 °C lagern.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	verwendet bei 100 mg/L
AMPure XP PCR-Aufreinigungssystem	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalysator Hochempfindliche DNA-Analyse	Agilent	5067-4626
Desoxynukleotid-Lösungsmix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetisches Rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-N	/A	N/A N/A	DAP Auxotroph, benötigt 600 mM exogen zugesetztes DAP, um zu wachsen. Enthält RP4-Maschinen für den Plasmidtransfer. Träger für JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Kryo-Fläschchen mit Außengewinde	Corning	09-761-71
Glasperlen	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Impfösen	Fisher Scientific	22-363-602	Schaberwerkzeug
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	bei 25 mg/L
LB Agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB Brühe, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Zugabe von 3 mM Tris-HCl, 0,2 mM EDTA (pH 7,5) in Wasser. Wird mit Streptavidin-Kügelchen verwendet. Lösungen halten sich bei Raumtemperatur.
Lysepuffer	N/A	N/A	9,34 mL TE Puffer; 600 ml 10 % SDS; 60 ml Proteinase K (20 mg/ml)
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1 Gemisch, pH 6,7/8,0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 10-fache Lösung	Fisher Scientific	BP39920	verdünnt auf 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Analyseröhrchen	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Ultraschallgerät mit Kühlschrank Wasserbad	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE Puffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8,0)
Endständige Desoxynukleotidyltransferase (rTdt)	Promega	PR-M1875