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Biology

Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Abstract

O sequenciamento transposon (Tn-seq) é um método poderoso que combina mutagênese transposon e sequenciamento paralelo maciço para identificar genes e caminhos que contribuem para a aptidão bacteriana sob uma ampla gama de condições ambientais. As aplicações tn-seq são extensas e não só permitiram o exame das relações genótipo-fenótipo a nível de organismo, mas também nos níveis populacional, comunitário e de sistemas. As bactérias gram-negativas estão altamente associadas com fenótipos de resistência antimicrobiana, o que aumentou os incidentes de falha no tratamento de antibióticos. A resistência antimicrobiana é definida como crescimento bacteriano na presença de antibióticos letais de outra forma. A colistina antimicrobiana de "última linha" é usada para tratar infecções bacterianas gram-negativas. No entanto, vários patógenos Gram-negativos, incluindo Acinetobacter baumannii podem desenvolver resistência à colistina através de uma série de mecanismos moleculares, alguns dos quais foram caracterizados usando Tn-seq. Além disso, as vias de transdução de sinais que regulam a resistência à colistina variam dentro das bactérias Gram-negativas. Aqui propomos um método eficiente de mutagênese transposon em A. baumannii que agiliza a geração de uma biblioteca de inserção transposon saturada e construção de biblioteca de amplicon, eliminando a necessidade de enzimas de restrição, ligadura adaptadora e purificação de gel. Os métodos aqui descritos permitirão uma análise aprofundada dos determinantes moleculares que contribuem para a aptidão de A. baumannii quando desafiados com colistina. O protocolo também é aplicável a outros patógenos ESKAPE gram negativos, que estão principalmente associados a infecções hospitalares resistentes amedicamentos.

Introduction

A descoberta de antibióticos é, sem dúvida, um dos eventos mais impactantes relacionados à saúde do séculoXX. Os antibióticos não só resolvem rapidamente infecções bacterianas graves, como também desempenham um papel fundamental na medicina moderna. Cirurgias de grande porte, transplantes e avanços em medicina neonatal e quimioterapia deixam pacientes suscetíveis a infecções que ameaçam a vida e essas terapias não seriam possíveis sem antibióticos1,,2. No entanto, o rápido desenvolvimento e disseminação da resistência a antibióticos entre patógenos humanos diminuiu significativamente a eficácia de todas as classes clinicamente importantes de antibióticos3. Muitas infecções bacterianas que antes eram facilmente eliminadas com tratamento de antibióticos, não respondem mais a protocolos clássicos de tratamento, causando uma grave ameaça à saúde pública global1. Resistência antimicrobiana (AMR) é onde as células bacterianas crescem em concentrações letais de antibióticos, independentemente da duração do tratamento4,5. É urgente compreender fatores moleculares e bioquímicos que regulam a RM, o que ajudará a orientar o desenvolvimento antimicrobiano alternativo. Especificamente, os patógenos ESKAPE são problemáticos em ambientes clínicos e associados a amr extensa. Estes incluem Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp. Enquanto vários mecanismos contribuem para a AMR em patógenos ESKAPE, os quatro últimos organismos são Gram-negativos.

Bactérias gram-negativas montam uma membrana externa que as protege de condições ambientais adversas. A membrana externa serve como uma barreira de permeabilidade para restringir a entrada de moléculas tóxicas, como antibióticos, na célula. Ao contrário de outras membranas biológicas, a membrana externa é assimétrica. O folheto externo é enriquecido com lipopólise exposto à superfície, enquanto o folheto interno é uma mistura de fosfolipídios6. Moléculas de lipopolisacarídeo são ancoradas na membrana externa por um lipídio conservado Uma moiety incorporada dentro da bicamada lipídica7. O lipídio canônico Um domínio de Escherichia coli lipopolysaccharide é necessário para o crescimento da maioria das bactérias Gram-negativas e é sintetizado por uma via enzimática de nove passos que é uma das vias mais fundamentais e conservadas em organismos Gram-negativos6,,7,,8.

Polimicônias são peptídeos antimicrobianos cônicos que visam o domínio lipídico A de lipopólise para perturbar a membrana externa e lise a célula. A interação eletrostática entre resíduos carregados positivamente de polimíxinos e os grupos lipídicos lipídicos abofíticos carregados negativamente interrompem a membrana celular bacteriana, levando à morte celular9,,10,,11,,12,13. Colistina (polimicina E) é um antimicrobiano de última instância usado para tratar infecções causadas por patógenos nosocomias gram-negativos multidrogas, como acinetobacter baumannii14,,15,16. Descoberto pela primeira vez em 1947, os polimíxinos são produzidos pelas bactérias do solo, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polimíxins foram prescritos para tratar infecções gram-negativas por anos antes de seu uso clínico ser limitado devido a relatos de nefrocígenidade significativa20,21.

A. baumannii é um patógeno gram-negativo nosocomial que aumentou drasticamente a morbidade e mortalidade dos desfechos dos pacientes nas últimas décadas22. O que antes era considerado um patógeno de baixa ameaça, agora representa um risco significativo para infecção hospitalar em todo o mundo devido à sua incrível capacidade de adquirir AMR e alto risco de epidemia23,24. A. baumannii é responsável por mais de 10% das infecções nosocomiais nos estados unidos. A doença se manifesta como pneumonia, bacteremia, infecções do trato urinário, infecções de pele e tecidos moles, meningite e endocardite25. As opções de tratamento para infecções de A. baumannii diminuíram devido à resistência contra quase todas as classes de antibióticos, incluindo β-lactams, fluoroquinolones, tetraciclina e aminoglycosides23,24. A prevalência de isolamentos a. baumannii, resistentes a medicamentos multidrogas, extensivamente resistentes a medicamentos e resistentes a medicamentos, levou a um ressurgimento do tratamento da colistina, que foi considerado uma das poucas opções terapêuticas remanescentes ainda eficazes contra a resistência multidroga A. baumannii. No entanto, o aumento da resistência à colistina entre os isolados A. baumannii ampliou ainda mais sua ameaça à saúde pública global10,11,12,13,27,30,31.

Os recentes avanços em tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, como o sequenciamento transposon (Tn-seq), forneceram ferramentas importantes para avançar nossa compreensão da aptidão bacteriana in vitro e in vivo. Tn-seq é uma ferramenta poderosa que pode ser aproveitada para estudar interações genótipo-fenótipo em bactérias. O Tn-seq é amplamente aplicável entre patógenos bacterianos, onde combina mutagênese transposon tradicional com sequenciamento paralelo maciço a locais de inserção de mapas rápidos, que podem ser usados para ligar mutações de DNA a variantes fenotípicas em uma escala de genoma32,,33,,34,35. Embora os métodos de mutagênese transposon tenham sido descritos anteriormente, os passos gerais são semelhantes33. Primeiro, uma biblioteca de inserção é gerada usando mutagênese transposon, onde cada célula bacteriana dentro de uma população é restrita a uma única inserção transposon dentro do DNA genômico (gDNA). Após mutagênese, mutantes individuais são agrupados. gDNA é extraído da piscina mutante de inserção e as junções transposon são amplificadas e submetidas a sequenciamento de alto rendimento. As leituras representam locais de inserção, que podem ser mapeados para o genoma. Inserções transposon que reduzem o condicionamento físico rapidamente caem da população, enquanto as inserções benéficas são enriquecidas. Tn-seq tem sido fundamental para avançar nossa compreensão de como os genes impactam a aptidão bacteriana no estresse33.

O sistema de transposon himar1 marítimo codificado em pJNW684 foi especificamente construído e otimizado para fins de mutagênese transposon. Inclui um transposon da família marinerflanqueando o gene de resistência à kanamicina, que é usado para a seleção de mutantes de inserção transposon em A. baumannii. Ele também codifica um promotor específico de A. baumannii que impulsiona a expressão do gene de codificação transposase36. O transposon baseado em marinheirotambém contém dois terminadores translacionais a jusante do gene de resistência à kanamicina, que impede a leitura a jusante da inserção37. pJNW684 também carrega uma origem RP4/oriT/oriR6K-condicional de replicação que requer o gene λpir contribuído pela cepa do doador para replicar38. Na ausência do gene λpir, o vetor pJNW684 que transporta o maquinário de transposição não poderá se replicar na cepa receptora A. baumannii 10,,36,38. Portanto, durante a conjugação bacteriana, apenas o transposon é inserido no genoma receptor sem inserção de fundo do plasmídeo, que carrega o gene transposase. Isso é significativo porque a perda da atividade de transposase juntamente com o plasmídeo resulta em evento de transposição único e estável que impede o transposon de se mover para diferentes locais uma vez que insere no genoma receptor.

pJNW648 também foi testado para atividade em outro organismo Gram-negativo, E. coli. A montagem bem sucedida de uma biblioteca Sn-seq saturada na cepa E. coli W3110 indicou que o sistema é capaz de realizar mutagênese em uma ampla gama de patógenos, incluindo Enterobacteriaceae. Além disso, o promotor específico A. baumannii que impulsiona a expressão transposase pode ser rapidamente trocado com um promotor específico da espécie. Por fim, o gene de resistência à kanamicina pode ser trocado por outras fitas de resistência, dependendo do fenótipo amr do organismo que está sendo estudado.

Um fator que contribui para a resistência à colistina em A. baumannii é a administração de doses insuficientes, onde as bactérias são expostas à pressão seletiva em níveis nãoletais 39. Vários relatos mostraram que concentrações antimicrobianas subinibitórias podem induzir respostas regulamentadas que alteram a fisiologia celular para reduzir a suscetibilidade de toda a população bacteriana11,,12,,30,,31. Usando Tn-seq, descobrimos fatores que regulam a resistência à colistina em A. baumannii cep ATCC 17978 após exposição a concentrações inibitórias10 e subinibitórias de colistina. Este exemplo detalha um método Tn-seq que agiliza a construção e o enriquecimento de uma biblioteca mutante transposon saturada usando a família detransposons40,41. Enquanto vários protocolos Tn-seq geram 20.000 - 100.000 mutantes35,42,43,44,45,46, o protocolo aqui descrito pode gerar rapidamente uma biblioteca transposon de 400.000 + mutantes, que equivale aproximadamente a uma inserção transposon a cada pares de 10 bases em A. baumannii10. Além disso, o tamanho da biblioteca pode ser ampliado sem um esforço adicional significativo. Este método também elimina a exigência de restrição de endonucleases, ligadura adaptador e purificação de gel, o que pode reduzir a diversidade final da biblioteca.

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Protocol

1. Preparação de cepas bacterianas

  1. Listrar a cepa "doador"(E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabela de Materiais) para colônias isoladas no ágar Luria-Bertani suplementado com ácido diaminopimelic de 600 μM (DAP), 100 mg/L de ampicillina e 25 mg/L de kanamicina. Incubar durante a noite a 37 °C. Utilizando uma única colônia isolada, inocular 50 mL de caldo de Luria (LB) suplementado com 600 μM DAP, 100 mg/L de ampicillina e 25 mg/L de kanamicina em um frasco erlenmeyer de 250 mL e rotulá-lo como "doador".
  2. Listrar a cepa "receptora"(A. baumannii cep ATCC 17978, Tabela de Materiais) para colônias isoladas no ágar Luria-Bertani. Incubar durante a noite a 37 °C. Usando uma única colônia isolada, inocular 50 mL de LB em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL e rotulá-lo como "destinatário".
  3. Incubar ambas as culturas ("doador" e "receptor") durante a noite a 37 °C com agitação.

2. Acasalamento bacteriano

  1. Transfira culturas durante a noite para tubos cônicos de 50 mL.
  2. Pelotas tanto culturas receptoras quanto doadoras usando centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
  3. Descarte o supernasal e resuspenque a pelota de cepa "doador" em 35 mL de LB complementada com DAP para lavar antibióticos residuais.
  4. Pelota as células de cepa "doador" usando centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
  5. Descarte o supernasal e resuspenque a pelota de esma de estirpe "doador" em 4,5 mL de LB complementada com DAP. Use uma pipeta sorológica de 10 mL.
  6. Transfira a cepa "doador" resuspended para o tubo de tensão "receptor", que contém as células "receptoras" pelleted. Use a mesma pipeta sorológica de 10 mL da etapa 2.5 para misturar as culturas. Mova-se imediatamente para o próximo passo.
    NOTA: O volume total da suspensão final deve ser de 5 mL.
  7. Distribua a suspensão de acasalamento individual de 100 μL em placas de ágar LB suplementadas com DAP (5-7 gotículas por placa)(Figura 1A).
  8. Incubar placas em temperatura ambiente por 30 minutos.
  9. Sem perturbar as gotículas, transfira cuidadosamente as placas para uma incubadora de 37 °C e permita que as culturas acasalem por 1h.
    NOTA: Períodos de incubação superiores a 1h arriscam a geração de mutantes irmãos.
  10. Após a incubação, adicione 1,5 mL de LB em cada placa e colher resutilheira das placas. Use uma micropipette de 1 mL para ressuspensão. O volume final deve ser de aproximadamente 12 a 15 mL.
  11. Combine células colhidas em um tubo cônico de 50 mL.
  12. Pelota as células acasaladas usando centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
  13. Descarte as células supernascidas e resuspendas em 50 mL de LB para remover o DAP residual.
  14. Pelota o acasalamento usando centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
  15. Repita a etapa de lavagem (passos 2.13 e 2.14).
  16. Utilizando uma pipeta sorológica de 10 mL, resuspense a pelota em 10 mL de LB suplementada com 25% de glicerol.
  17. Usando células lavadas, faça cinco diluições seriais no caldo LB (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000).
  18. Espalhe 100 μL de cada diluição em 4 placas diferentes usando contas de vidro estéreis: ágar Luria-Bertani suplementado com kanamicina, ágar suplementado com ampicillina, ágar suplementado apenas com DAP e ágar.
  19. Incubar placas a 37 °C durante a noite.
  20. Aliquot o acasalamento restante em alíquotas de 1 mL e armazene a -80 °C.

3. Determine a diluição apropriada da biblioteca transposon

  1. Registrar unidades formadoras de colônias (UFC) a partir de placas noturnas.
  2. Imagem uma placa com colônias contáveis para cada condição de placa diferente(Figura 2A).
    NOTA: Tanto as cepas de "doador" quanto "receptor" devem crescer em placas de ágar complementadas com DAP, de modo que a maioria das diluições banhadas produzirá um gramado. Apenas a cepa "receptora" pode crescer em placas de ágar. Nem o "doador" nem a cepa "receptora" podem crescer em placas de ágar suplementadas com ampicillina, por isso não deve haver nenhum/crescimento mínimo. Somente as células-alvo que codificam a inserção transposon podem crescer em placas de ágar suplementadas com kanamicina. As colônias devem variar de tamanho, indicando inserções transposon em genes que contribuem para o condicionamento físico no ágar suplementado com kanamicina.
  3. Calcule o número de mutantes transposon no acasalamento congelado contando o número de colônias em placas de ágar LB suplementadas com kanamicina.
    NOTA: Para o genoma A. baumannii (aproximadamente 4 Mbps), o objetivo era obter cerca de 400.000 colônias para gerar uma biblioteca mutante de alta resolução (aproximadamente uma inserção transposon/10 pares de bases). No entanto, esse número deve ser otimizado com base no tamanho do genoma da espécie-alvo).

4. Geração da biblioteca final de mutantes bacterianos

  1. Descongele uma alíquota do acasalamento congelado no gelo.
  2. Acasalamento de placas de 150 mm Placas de ágar Luria-Bertani complementadas com kanamicina baseada em UFC calculado na etapa 3.1. Ajuste o volume com LB para produzir 13.333 colônias por 150 μL antes de emplacamento.
    NOTA: A contagem da UFC aqui foi determinada em cerca de10 5 UFC/mL, de modo que o volume de acasalamento foi ajustado para obter 13.333 colônias por placa, pois isso forneceria um número ideal de colônias em 30 placas para uma biblioteca mutante de alta resolução sem superlotar as placas.
  3. Use contas de vidro estéreis para espalhar 150 μL da diluição por placa em placas de ágar Luria-Bertani de 30 x 150 mm complementadas com kanamicina para obter 400.000 colônias(Figura 1C).
    NOTA: Varas estéreis ou qualquer tipo de ferramenta de espalhador estéril (ou seja, contas de vidro) podem ser usadas para espalhar as bactérias em placas.
  4. Descarte o tubo usado contendo excesso de acasalamento.
    NOTA: Ciclos de congelamento/degelo adicionam pressões seletivas sobre a cultura bacteriana, o que pode distorcer os resultados do experimento Tn-seq. Use uma alíquota fresca cada vez.
  5. Incubar placas a 37 °C por 14 h.
    NOTA: O tempo de incubação é otimizado para evitar o crescimento excessivo (colônias tocando). Sugere-se minimizar o crescimento reduzindo o tempo de incubação.

5. Estimando a densidade da biblioteca e a agrupamento para armazenamento

  1. Conte CFUs em cada placa para estimar o total de mutantes na biblioteca transposon. Conte 20% de pelo menos 3 placas para determinar a estimativa de contagem de colônias para todo o grupo de placas (Figura 2A). Certifique-se de que as colônias não estão tocando outra colônia.
  2. Depois de calcular o rendimento estimado da colônia, adicione 3-5 mL de LB (ou mais, se necessário) a cada placa e raspe as bactérias usando uma ferramenta de raspagem estéril.
    NOTA: Laços inoculadores estéreis foram usados para raspar eficientemente as placas.
  3. Suspensões bacterianas da piscina de todas as placas em tubos cônicos de 50 mL(Figura 1D). Isso exigirá vários tubos cônicos de 50 mL, pelo menos 3.
  4. Suspensão bacteriana agrupada com centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
  5. Descarte a pelota supernascerante e resuspend em 5 mL de LB suplementada com 30% de glicerol.
  6. Aliquot 1 mL da biblioteca transposon em criovials e armazenar a -80 °C.

6. Identificação de fatores que regulam a resistência à colistina em A. baumannii

  1. Prepare frascos de 4 x 250 mL Erlenmeyer com cada um contendo caldo e etiqueta lb de 50 mL como (Figura 2B)
    1. A. baumannii cep ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (-) colistin_1
    2. A. baumannii cep ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (-) colistin_2
    3. A. baumannii cep ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (+) colistin_1
    4. A. baumannii cep ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (+) colistin_2
      NOTA: No desafio que o crescimento aqui descrito, cada condição, (-) controle de colistina e (+) desafio colistina, está sendo testada em duplicata. Portanto, a configuração requer frascos de 4 x 250 mL Erlenmeyer, dois por condição.
  2. Adicione 50 μL de 0,5 mg/L colistina aos (+) frascos de colistina (6.1.3 e 6.1.4) e 50 μL de água para (-) frascos de colistina (6.1.1 e 6.1.2).
  3. Descongele uma biblioteca Tn-seq congelada do passo 5 no gelo.
  4. Pipeta 1 μL da biblioteca descongelada em 1 mL de PBS.
  5. Meça a densidade óptica em 600 nm (OD600) e multiplique por 1.000.
    NOTA: Isso determina o OD600 de 1 μL da biblioteca Tn.
  6. Com base no cálculo da etapa 6.5, inocular cada frasco contendo 50 mL LB para um ODfinal 600 0.001.
  7. Cultivar culturas em uma incubadora de agitação a 37 °C a600 0,5.
    NOTA: É importante que as culturas permaneçam em fase de crescimento logarítmico, portanto, se sua cepa estiver em um OD600 diferente durante o crescimento exponencial, o OD600 precisa ser ajustado para garantir que a cultura se reproduza o máximo de vezes possível dentro da fase de crescimento logarítmico. Se a cultura só se replica 3 vezes, o poder de detectar defeitos de aptidão em mutantes é limitado a diferenças de 3 vezes, em teoria. Como diferentes bactérias têm tempos de duplicação diferentes, é importante semear as culturas em um OD600 fixo para normalizar o inóculo inicial. Isso garante uma representação consistente de toda a biblioteca em todas as culturas.
  8. Culturas de colheita usando centrifugação a 5.000 x g a 4 °C por 7 min.
  9. Retire o supernatante e lave com 50 mL de PBS.
  10. Pelota usando centrifugação a 5.000 x g a 4 °C por 7 min.
  11. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 1 mL de PBS. Aliquot ~ 200 μL em 5 tubos de microcentrífuga.
  12. Pelota usando centrifugação a 5.000 x g a 4 °C por 5 min. Remova todo o supernatante usando uma ponta de pipeta.
  13. Armazene pelotas a -20 °C ou proceda com extração gDNA.

7. extração gDNA

  1. Descongele uma bala de celular no gelo.
  2. Adicione 0,6 mL tampão de lise(Tabela de Materiais) e vórtice para resususpensar completamente a pelota.
  3. Incubar a 37 °C por 1 h.
  4. Adicione 0,6 mL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico à amostra e vórtice vigorosamente.
  5. Fases separadas usando centrifugação em uma microcentrifuagem a velocidade máxima na temperatura da sala por 5 minutos.
  6. Transfira a fase superior aquosa para um novo tubo. Evite perturbar a interface de fase durante a transferência.
  7. Adicione um volume igual de clorofórmio à fase aquosa obtida acima e vórtice vigorosamente.
  8. Fases separadas usando centrifugação em microcentrifuge a velocidade máxima na temperatura da sala por 5 minutos.
  9. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo.
    NOTA: Certifique-se de evitar perturbar a interface durante a transferência.
  10. Adicione 2,5x de volume de fase aquosa de 100 % de etanol frio e misture suavemente. DNA precipitado será visível.
  11. Coloque o tubo a -80 °C por pelo menos 1 h.
  12. DNA de pelota usando centrifugação a velocidade máxima a 4 °C por 30 min.
  13. Remova cuidadosamente o supernasce sem perturbar a pelota de DNA e lave com 150 μL de 70 % de etanol por pipetação.
  14. DNA de pelota usando centrifugação a velocidade máxima a 4 °C por 2 min.
  15. Remova cuidadosamente o supernatante.
  16. Repita o passo 7.14 uma vez. Remova cuidadosamente todo o etanol restante.
  17. DNA seco incubando na temperatura da sala por 5-10 min.
  18. Resuspend pellet de DNA em 100 μL TE tampão por pipetação.

8. Tesoura de DNA (Figura 3A)

  1. Diluir gDNA com tampão te para uma concentração de 250 ng/mL em um volume total de 200 μL.
  2. Coloque tubos em um sonicator de banho de água.
  3. Sonicate DNA para produzir fragmentos de aproximadamente 300 nucleotídeos. Potência: 60 %, Tempo total: 20 min, Ciclos: 10 s ON e 10 s OFF a 4 °C(Figura 3A).
  4. Confirme que o DNA é coletado apropriadamente separando 10 μL de DNA não emararado e 10 μL de DNA desarquiado em um gel de 1% de agarose. Repita a sonicação ou otimize conforme necessário(Figura 3B).

9. Adição da cauda poly-C ao final de 3'(Figura 3A)

  1. Configuração de reação poly-C de acordo com a Tabela 1.
  2. Incubar a reação a 37 °C por 1 h.
  3. Purifique a reação poli-C com 40 μL de contas paramagnéticas de seleção de tamanho(Figura 3A)seguindo os passos abaixo.
    1. Adicione 40 μL de contas paramagnéticas de seleção de tamanho a cada amostra. Vórtice ~ 5 s ou pipeta para cima e para baixo.
    2. Incubar amostras em temperatura ambiente por 5 minutos.
    3. Resumidamente, tubos centrífugas para coletar líquido na parte inferior do tubo (~ 2 s).
    4. Transfira os tubos para um rack magnético e incubar à temperatura ambiente por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    5. Com tubos no rack magnético, remova cuidadosamente o supernaspe.
    6. Com tubos no rack magnético, adicione 200 μL de etanol recém-preparado 80% (não perturbe as contas).
    7. Incubar amostras por pelo menos 30 s até que a solução esteja clara.
    8. Com tubos no rack magnético, remova cuidadosamente o supernaspe.
    9. Repita a etapa de lavagem (passos 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Colete líquido na parte inferior do tubo usando uma breve etapa de centrifugação (~ 2 s).
    11. Transfira os tubos para o rack magnético e remova qualquer líquido restante.
    12. Incubar em temperatura ambiente por 2-5 minutos para secar amostras. Não seque demais.
    13. Remova os tubos do rack magnético e adicione 25 μL de água a cada um. Vórtice para ~ 5 s ou pipeta para cima e para baixo.
    14. Resumidamente, tubos centrífugas para coletar líquido na parte inferior do tubo (~ 2 s).
    15. Transfira os tubos para o rack magnético e deixe descansar por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    16. Com tubos no rack magnético, remova o líquido sem perturbar as contas e transfira para um novo tubo (~ 23 μL de DNA).

10. Amplificação da junção Transposon(Figura 3A)

  1. Configuração PCR 1 conforme descrito na Tabela 1 para o primeiro PCR aninhado (Tabela 2).
  2. Execute o PCR 1 usando condições descritas na Tabela 1.
  3. Purificar produtos PCR com 40 μL de contas paramagnéticas de seleção de tamanho (etapas 9.3.1 – 9.3-12). Elute em 50 μL de água (etapas 9.3.13 – 9.3.16). Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C.
  4. Prepare contas paramagnéticas acopléticas a streptavidin:
    1. Resuspend Streptavidin implora tremendo vigorosamente.
    2. Adicione 32 μL de contas por amostra a um tubo de microcentrifutura fresco.
      NOTA: As contas para 6 + amostras podem ser preparadas em um único tubo.
    3. Transfira o tubo para um rack magnético. Incubar por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    4. Com tubo no rack magnético, remova o supernaspeso.
    5. Remova o tubo do rack magnético. Lave as contas reutilizando em 1 mL 1x tampão B&W por tubulação para cima e para baixo.
    6. Transfira o tubo para o rack magnético. Incubar por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    7. Com o tubo no rack magnético, remova o supernaspeso.
    8. Repita a etapa de lavagem com 1 mL 1x B&W buffer (passos 10.4.5 – 10.4.7) duas vezes mais para um total de 3 lavagens.
    9. Remova o tubo do rack magnético e retire as contas em 52 μL de tampão de B&W de 2x por amostra.
  5. Combine 50 μL das contas preparadas com 50 μL de PCR1 purificado (a partir da etapa 10.3). Pipeta para misturar.
  6. Gire em temperatura ambiente por 30 minutos.
  7. Lavar o DNA desvinculado:
    1. Resumidamente, centrífuga para coletar líquido na parte inferior do tubo (~ 2 s).
    2. Transfira o tubo para o rack magnético. Incubar por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    3. Com o tubo no rack magnético, remova o supernaspeso.
    4. Remova o tubo do rack magnético, lave as contas resusus pendentes em 100 μL 1x B&W tampão e pipetação para cima e para baixo.
    5. Transfira o tubo para o rack magnético. Incubar por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    6. Com tubo no rack magnético, remova o supernaspeso.
    7. Repita as etapas de lavagem com 100 μL LoTE (etapas 10.7.4 – 10.7.6) duas vezes mais para um total de 3 lavagens.
  8. Configuração PCR 2 conforme descrito na Tabela 1 para amplificar as junções transposon e adicionar um único código de barras a cada amostra(Tabela 2 e Tabela 3).
  9. Execute o PCR 2 usando condições descritas na Tabela 1.
  10. Purifique com 40 μL de contas paramagnéticas de seleção de tamanho (etapas 9.3.1 – 9.3.12). Elute em 17 μL de água (passos 9.3.13 – 9.3.16), coletar ~ 15 μL.
  11. Quantifique a concentração de DNA usando um fluorômetro. As concentrações finais devem ser de ~ 50 a 250 ng/μl.
  12. Avalie a qualidade do DNA utilizando eletroforese capilar baseada em chip(Figura 4A).

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Representative Results

Os métodos descritos descrevem a geração de uma biblioteca transposon de alta densidade em A. baumannii cep ATCC 17978 através de conjugação bacteriana utilizando E. coli MFD DAP-, que replica o plasmídeo pJNW684 (Figura 4B). O protocolo detalhado utiliza a conjugação bacteriana bi-parental para transferência de pJNW684 da cepa E. coli λpir+ doador para a cepa receptora A. baumannii. Este é um método eficiente e barato para gerar bibliotecas mutantes transposon densas. As bactérias foram misturadas em proporções otimizadas e acasalamentos foram acolchoados em placas de ágar Luria-Bertani por 1h(Figura 1A). Durante o acasalamento, o transposon foi transferido do doador para o receptor, onde inseriu no gDNA (Figura 1B). Foram coletados acasalamentos, aproximadamente 105 UFC/mL foram calculados e emplacados em placas de ágar de 150 mm x 15 mm complementadas com kanamicina. Após 14 horas de crescimento a 37 °C, as placas continham milhares de colônias de tamanho variado (Figura 1C) indicando uma geração bem sucedida de uma biblioteca mutante transposon. Os mutantes de inserção transposon foram agrupados(Figura 1D) e congelados em alíquotas para evitar ciclos repetidos de congelamento, o que poderia adicionar pressão seletiva na biblioteca de inserção.

A biblioteca mutante A. baumannii transposon foi usada para identificar fatores de aptidão importantes para a resistência à colistina sob concentrações subinibitórias do antimicrobiano (Figura 2B). A biblioteca mutante foi cultivada em fase logarítmica na ausência/presença de colistina de 0,5 mg/L em duplicata para esgotar células mutantes codificando inserções em genes que contribuem para a resistência à colistina. O gDNA total da piscina de biblioteca restante foi isolado do controle e culturas experimentais e processado para preparar o DNA para sequenciamento(Figura 3A).

O gDNA isolado foi fragmentado por meio de tesoura mecânica e uma cauda poli-C foi adicionada nos fragmentos de DNA(Figura 3A). Após a adição da cauda poly-C, o DNA foi purificado e as junções transposon-genoma foram enriquecidas usando o primer específico poly-C seguido por uma segunda rodada de PCR usando outro primer específico poli-C que introduziu o local de sequenciamento P7 que é necessário para ligar a célula de fluxo de Illumina e geração de cluster, e um código de barras de seis bases que é usado para demultiplex bibliotecas pós sequenciamento37,,47. As concentrações de DNA foram calculadas e as amostras foram analisadas utilizando-se eletroforese capilar baseada em chip para confirmar construções bem sucedidas da biblioteca(Figura 4A),que estão prontas para sequenciamento de alta produtividade.

Bibliotecas de DNA foram sequenciadas pelo sequenciamento da próxima geração. Foi realizada uma corrida de ciclo de 50 ciclos, que rendeu 30 milhões de leituras/amostras de alta qualidade, fornecendo cobertura de 62,5 vezes da biblioteca transposon. As junções transposon (leituras) foram mapeadas ao genoma de referência48, utilizando software de análise bioinformática disponível comercialmente. O número de leituras em cada local de inserção nas amostras de entrada, (-) condição de controle de colistina, foi comparado com o número de leituras nas amostras de saída, (+) condição experimental de colistina e escores de aptidão para cada local de inserção. Os escores de aptidão foram então agrupados por gene. Genes demonstrando escores reduzidos quando a biblioteca foi cultivada na presença de colistina em relação às amostras de entrada foram considerados determinantes de aptidão para a sobrevivência de A. baumannii em concentrações subinibitórias de colistina. Por exemplo, inserções transposon dentro do sistema pmrab de dois componentes estavam presentes na amostra de entrada, mas não foram encontradas na amostra de saída. O PMRAB regula diretamente a expressão do PMRC, que transfere fosfoetanolamina para lipídio A para neutralizar a carga na superfície celular12,31. Acredita-se que a neutralização da carga bacteriana da superfície reduza o potencial eletrostático necessário para a morte mediada por colistina. A identificação de genes esgotados conhecidos por contribuir para o fenótipo de resistência validou o método.

Figure 1
Figura 1: Esquema da construção da biblioteca mutante transposon. (A)Conjugação bacteriana. A cepa "doador", que codifica o maquinário de transposição, foi misturada com a cepa "receptora". A mistura foi avistada em placas de ágar LB e autorizada a acasalar por 1 h. (B) Geração da biblioteca transposon. O plasmídeo que transportava o maquinário de transposição foi transferido da cepa "doador" para a cepa "receptora" e o transposon foi inserido aleatoriamente em todo o genoma da cepa "receptora". (C)Seleção. As células resultantes foram banhadas em placas de ágar suplementadas com kanamicina para selecionar para mutantes de inserção transposon. (D) Biblioteca agrupada. Colônias foram raspadas de placas, resuspended em LB e agrupado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos de conjugação bacteriana e um esquema do experimento colistina Tn-seq. (A) Placa de seleção de kanamicina representativa. A placa é dividida em cinco seções iguais. Pontos azuis representam a contagem de colônias para estimativa de mutantes de inserção de A. baumannii transposon. Pelo menos três placas separadas foram contadas para calcular a estimativa final. (B) Identificação de fatores de aptidão nas concentrações de colistina subinibitória. A biblioteca transposon agrupada foi cultivada para fase de crescimento logarítmico, seja na ausência (controle) ou na presença (experimental) da colistina. Uma vez que as culturas atingiram densidade óptica adequada, as células foram pelotadas e gDNA foi extraído de cada amostra. Cada condição foi testada em duplicata para um total de quatro amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Fluxograma da construção da biblioteca de amplicon de DNA para sequenciamento paralelo maciço e gDNA de corte representativo. (A) Tn-seq biblioteca de DNA construir esquema. Após a extração, o GDNA foi fragmentado através de tesoura mecânica. A transferência deoxynucleotidyl terminal foi usada para adicionar uma cauda poli-C à extremidade 3 do DNA fragmentado antes da amplificação pcr das junções transposon-genoma e adição de código de barras. (B) 1% de gel agarose de bibliotecas mutantes A. baumannii desemaradas e tesouras após o passo de tesoura gDNA. 1 escada Kb foi usada como marcador de DNA. A mancha de gDNA com tesoura varia principalmente entre ~ 100 e 500 pares de base. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados do controle de qualidade representativo (QC) e mapa do plasmídeo carregando os genes de transposição. (A) Traço QC para uma construção de biblioteca de DNA. Há um pico de ~ 350 pares de base, indicando uma construção de biblioteca bem sucedida. Se algum DNA maior foi detectado nos resultados do QC, as amostras podem ser limpas ainda mais para remover grandes fragmentos de DNA. (B) Plasmid pJNW684 consiste em um transposon de marinheiro Himar1 (verde) com um de resistência à kanamicina (roxo) para seleção mutante, um gene codificando o subtencência hiperativo Himar1 C9 transposase (vermelho) sob controle de um promotor específico de A. baumannii 17978 (azul), um gene de resistência à ampicilina(bla,laranja) e uma origem RP4/oriT/oriR6K-condicional de replicação (amarelo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Reação Configuração Condições
Reação poly-C 30 μL de gDNA tesourado
2,5 μL de 9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP
10 μL de 5X Terminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt) tampão de reação
1,25 μL de rTdt
6,25 μL de água a 50 μL		 Incubar a 37ºC por 1 hora
PCR 1 23 μL 3'-poly-C DNA purificado (amostra inteira da etapa anterior)
10 μL 10x mistura de reação de polimerase de DNA de alta fidelidade
2 μL 10 mM dNTPs
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 510 biotina
3 μL 30 μM olj 376
0,5 μL polimerase de DNA de alta fidelidade
8,5 μL de água pura a 50 μL total		 1 ciclo: 2 min 94 ºC
15 ciclos: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 ciclo: 4 min 68 ºC
Porão: ∞ 4 ºC
PCR 2 Contas vinculadas ao DNA da etapa anterior
10 μL 10x mistura de reação de polimerase de DNA de alta fidelidade
2 μL 10 mM dNTP
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 511
1 μL 30 μM primer de código de barras (Tabela 2)
0,5 μL polimerase de DNA de alta fidelidade
33,5 μL de água pura a 50 μL		 1 ciclo: 2 min 94 ºC
15 ciclos: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 ciclo: 4 min 68 ºC
Porão: ∞ 4 ºC

Tabela 1: Configuração de reação. Configuração e condições para reações poli-C, PCR 1 e PCR 2.

Propósito Nome Seqüência
Anneals para transposon olj510-Biotina Biotin-GATGGCCTTTTTTTGTTTCTCTGCAGGGCGCG
Anneals para cauda poli-C olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGG
GGGGGGGGGGGGGGGG
Aninhado para adaptador Transposon + P5:
Local de captura P5 – Local de sequenciamento P5 - N5 -Tn		 olj511 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTCTCTTT
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNGGGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
Aninhado para olj376: local de sequenciamento P7
– código de barras XXXXXX – site de captura P7)		 Bc ## CAAGCAGAAGACGGCATACGATXXXXXXGTGA
CTGGAGTTCAGACGTGTG
ver Tabela 2 para códigos de barras específicos***

Tabela 2: Primers de amplificação PCR. Primers de amplificação PCR usados no protocolo para amplificar as junções transposon. O propósito de cada um está listado na primeira coluna.

Primer Ler Barras Seqüência
BC1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGT
GATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC2 CGATGT ACATCG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAC
ATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC3 TTAGGC GCCTAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCC
TAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC4 TGACCA TGGTCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
GGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC5 ACAGTG CACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC6 GCCAAT ATTGGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
TTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC7 CAGATC GATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC8 ACTTGA TCAAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC9 GATCAG CTGATC CAAGCAGAAGACGGCATACGA
TCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC10 TAGCTT AAGCTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC11 GGCTAC GTAGCC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC12 CTTGTA TACAAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
ACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC13 AGTCAA TTGACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC14 AGTTCC GGAACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC15 ATGTCA TGACAT CAAGCAGAAGACGGCATACGA
TTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC16 CCGTCC GGACGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC17 GTAGAG CTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC18 GTCCGC GCGGAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC19 GTGAAA TTTCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC20 GTGGCC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC21 GTTTCG CGAAAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC22 CGTACG CGTACG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGTGACTGGAGAGCAGACGTGTG
BC23 GAGTGG CCACTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
CACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC24 GGTAGC GCTACC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC25 ACTGAT ATCAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC26 ATGAGC GCTCAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC27 ATTCCT AGGAAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
GGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC28 CAAAAG CTTTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC29 CAACTA TAGTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC30 CACCGG CCGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CCGGTGGTGACTGGAGAGCAGACGTGTG
BC39 CTATAC GTATAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC40 CTCAGA TCTGAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGTGACTGGAGAGCAGACGTGTG
BC42 TAATCG CGATTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
GATTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC43 TACAGC GCTGTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC44 TATAAT ATTATA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATTATAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC45 TCATTC GAATGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GAATGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC46 TCCCGA TCGGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCGGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC47 TCGAAG CTTCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC48 TCGGCA TGCCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

Tabela 3: Primers de código de barras. Os primers de código de barras são usados na segunda etapa do PCR para amplificar as junções transposon, adicionando um local de sequenciamento P7 e códigos de barras ao amplicon. Nem todos os primers de código de barras são necessários para gerar uma biblioteca. Apenas primers de código de barras para o número de amostras são necessários.

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Discussion

A. baumannii é uma ameaça emergente à saúde pública global devido à rápida aquisição da AMR contra terapêuticas de "última linha", como colistina10,,11,12,,23,,24,,30,,31. Nas últimas décadas, tn-seq tem desempenhado um papel crítico na elucidação das interações genótipo-fenótipo em inúmeras espécies bacterianas e ampliando nossa compreensão da genética bacteriana34,,35,,42,,43. Os protocolos Tn-seq têm sido fundamentais na identificação de genes essenciais em diversas espécies bacterianas como Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, o patógeno periodontal Porphyromonas gingivalis, e até mesmo Mycobacterium tuberculosis37,49,50,51. Além da identificação de genes essenciais, tn-seq tem sido usado para identificar genes de resistência a antibióticos em Pseudomonas aeruginosa, vários genes condicionalmente essenciais em Salmonella typhimurium, e numerosas relações genótipo-fenótipo em Streptococcus pneumoniae52,53,54. Mais recentemente, o sequenciamento transposon de Vibrio cholerae foi empregado no modelo de coelho infantil da Cólera para identificar genes que são importantes para o condicionamento físico in vivo durante a infecção47. Esses estudos demonstram a versatilidade do Tn-seq, pois ele pode ser utilizado tanto para estudos in vitro quanto in vivo.

A principal vantagem do Tn-seq em relação a outros métodos, como tecnologias de microarray, eletroforese de gel 2D e qPCR, é que ele não requer conhecimento prévio do genoma ou informações genômicas55. Portanto, a mutagênese transposon aliada ao sequenciamento massivo-paralelo permite o estudo de genes e genomas conhecidos, bem como a descoberta de novas interações genéticas. Aqui apresentamos um método abrangente para a geração de uma biblioteca mutante transposon altamente densa em A. baumannii para identificar fatores que são essenciais para o condicionamento bacteriano quando expostos a concentrações subinibitórias de colistina. O método descrito também tem sido usado com sucesso em E. coli (dados não publicados), demonstrando que o sistema é capaz de realizar a análise de Tn-seq em outros patógenos Gram-negativos, incluindo Enterobacteriaceae.

O uso de transposons marítimos para mutagênese insercional tem várias vantagens. A família transposon originou-se de hospedeiros eucarióticos e têm sido amplamente utilizadas para gerar bibliotecas mutantes saturadas em diversas populações bacterianas. Os transposons mariner são independentes do hospedeiro, o que significa que inserções aleatórias estáveis podem ser alcançadas na ausência de fatores específicos de hospedeiro40,41. Além disso, os transposons marítimos têm um número definido de eventos de inserção porque inserem preferencialmente nos motivos de timina-adenina ("TA"), o que reduz o viés insercional e leva a uma análise estatística mais robusta37,,56,,57,58.

Vários métodos Tn-seq baseados em marinheirosusam digestão de restrição MmeI para fragmentação gDNA32,,42,43. Embora a fragmentação do DNA enzimático seja um método popular e bem sucedido, adiciona passos desnecessários ao procedimento e aumenta o viés potencial37. Essas técnicas não só requerem grandes quantidades de materiais iniciais, como também podem potencialmente levar à representação desigual das sequências de inserção em análises a jusante37,59. Como alguns outros métodos que não dependem da atividade nuclease mmei 52,60,61, o método aqui descrito depende de tesoura mecânica para fragmentar gDNA, e TdT para adicionar uma cauda poli-C à extremidade 3 dos fragmentos de DNA. Em comparação com os métodos de fragmentação enzimática de DNA e ligadura adaptador, essa abordagem requer quantidades significativamente menores de DNA inicial, ao mesmo tempo em que fornece resultados mais consistentes, também reduz o risco de contaminação cruzada do DNA e reduz a perda de amostras devido ao confinamento em um tubo selado37,59,62. Além disso, este método produz leituras mais longas e de alta qualidade de sequenciamento de 50 nucleotídeos que auxiliam no mapeamento mais eficaz e preciso das sequências e uma análise a jusante mais robusta37,59. A adição de uma cauda sintética poly-C desconsidera possíveis saliências que podem resultar da fragmentação, pois este método se baseia na cauda poli-C adicionada exógenamente como um local de reconhecimento para o primer reverso, que contém nucleotídeos de 16 dG no final de 3' e uma sequência específica para sequenciamento de próxima geração (por exemplo, sequência de illumina) no final de 5', para síntese primordial47,59. O uso de uma cauda nucleotídea sintética expande a aplicação deste método para muitos genomas distintos independentes de seu conteúdo nativo59. Posteriormente, as junções transposon-genoma são amplificadas usando o primer específico poly-C37. Essa alternativa simplifica o procedimento eliminando a necessidade de enzimas de restrição caras, ligadura adaptador, formação de dimers adaptadores e etapas de purificação de gel. Otimizamos ainda mais o protocolo para gerar eficientemente bibliotecas de inserção transposon altamente saturadas em vários patógenos ESKAPE gram negativos, incluindo Acinetobacter baumannii e podem ser usados para estudar interações genéticas sob diversas condições in vitro e in vivo 10.

Uma limitação da mutagênese Tn é que ela se baseia nos marcadores de resistência a antibióticos para seleção. No entanto, muitos patógenos ESKAPE gram-negativos são multidrug ou extensivamente resistentes a medicamentos, o que significa que o usuário pode precisar trocar o de resistência de acordo com o patógeno específico de interesse. Além disso, alguns isolados clínicos não são favoráveis à mutagênese transposon usando o transposon à base de marinheiros.

Um passo crítico do protocolo é calcular o número de mutantes Tn para chapar. Emplacamento de muitas colônias resultará em um gramado que pode complicar a análise a jusante. Se as colônias estiverem muito próximas ou tocando, elas podem adicionar pressão seletiva indesejada na biblioteca que pode resultar em artefatos. Idealmente, as colônias não seriam tocantes e espaçadas uniformemente através da placa, como demonstrado(Figura 2A). Por outro lado, se poucas colônias forem banhadas, será difícil isolar múltiplas inserções de Tn em cada gene.

Também é importante realizar os controles listados na etapa 2.18. Conforme indicado na Nota da seção 3. 2, nem a cepa "doador" ou "receptora" deve crescer em placas suplementadas com Ampicillina. Uma vez que o DAP exógeno é necessário para o crescimento da cepa "doador", qualquer crescimento indicaria que a cepa "receptora" replica pJNW684. Este é um problema significativo porque se o transposon não se integrar ao gDNA, leituras de sequenciamento só irão mapear o plasmídeo, não um site de integração. Neste caso, o experimento provavelmente não produzirá dados usuáveis.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por financiamento do Instituto Nacional de Saúde (Grant AI146829 a J.M.B.) e é reconhecido com gratidão.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologia Edição 161 transposon sequenciamento de alto rendimento Gram-negativo Acinetobacter baumannii,colistina ESKAPE
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Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

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