Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Diese Methode ist wichtig, weil sie in verschiedenen Bakterienarten verwendet werden kann, um essentielle Gene, Antibiotikaresistenzgene und Gene zu identifizieren, die für die In-vivo-Fitness während der Infektion wichtig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die mechanische Gemeinsamenutzung von genomischer DNA und Poly-CTL-Edition, die teure Restriktionsenzyme, Adapterstrahlung und Gelreinigung überflüssig machen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie problematischer bakterieller Infektionen, da Gene, die als wichtig für Infektionen oder Antibiotikaresistenzen identifiziert wurden, als Ziele für neuartige antimikrobielle Therapeutika dienen könnten.

Diese Methode kann Einblicke in komplexe Genotyp-, Phänotyp-Beziehungen zwischen gramnegativen und grampositiven Bakterienarten geben und unser aktuelles Verständnis der Bakteriengenetik verbessern. Um zu beginnen, übertragen Sie über Nacht Kulturen auf 50 Milliliter konische Röhren, und Pellet sowohl Empfänger-und Spenderkulturen mit Zentrifugation bei 5 000 mal G für 7 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.

Verwenden Sie eine 10 Milliliter serologische Pipette, um den Spenderstamm Pellet in 4,5 Milliliter LB, ergänzt mit Diaminopimelsäure, wieder aufzuhängen. Übertragen Sie den wieder suspendierten Spenderstamm in das Empfängerstammrohr. Und verteilen Sie sofort die Stecksuspension als einzelne 100 Mikroliter Tröpfchen auf LB Agarplatten, ergänzt mit Diaminopimelsäure Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 30 Minuten.

Dann übertragen Sie die Platten vorsichtig auf 37 Grad Celsius Inkubator und lassen Sie die Kulturen für eine Stunde zu paaren. Nach der Inkubation 1,5 Milliliter LB auf jede Platte geben und die Bakterien in ein 50 Milliliter Konikonröhre ernten. Pellet die gepaarten Zellen mit Zentrifugation bei 5.000 mal G für sieben Minuten.

Dann entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter LB, um die verbleibende Ndiaminopimelsäure Pellet die Zellen wieder zu entfernen, und wiederholen Sie die Wäsche mit LB. Wenn fertig, verwenden Sie eine 10 Milliliter serologische Pipette, um das Pellet in 10 Milliliter LB wieder aufzuhängen, ergänzt mit 25% Glycerin. Verteilen Sie die Zellen auf Platten, nach Manuskriptrichtungen. Dann bebrüten die Platten bei 37 Grad Celsius, über Nacht.

Erstellen Sie einen Milliliter Aliquots der verbleibenden Bakterien und speichern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Gießen Sie ein Aliquot der gefrorenen Paarung auf Eis. Verwenden Sie dann sterile Glasperlen, um 150 Mikroliter der Verdünnung auf jeweils 30 mal 150 Millimeter Luria-Bertani Agarplatte zu verteilen, ergänzt durch Kanamycin.

Entsorgen Sie das verwendete Rohr, das überschüssige Sendepaarungen enthält, und brüten Sie Platten bei 37 Grad Celsius für 14 Stunden. Nach der Inkubation zählen die Kolonie bildenden Einheiten auf jeder Platte, um die Gesamtmutanten in der Transposonbibliothek zu schätzen. Zählen Sie 20 % von mindestens drei Platten, um die Schätzung der Kolonieanzahl für die gesamte Plattengruppe zu bestimmen.

Nach der Berechnung des geschätzten Kolonieertrags fügen Sie drei bis fünf Milliliter LB zu jeder Platte hinzu und kratzen die Bakterien mit einem sterilen Abkratzwerkzeug ab. Ziehen Sie bakterielle Suspensionen von allen Platten in 50 Milliliter konische Röhren, und pellet die Suspensionen durch Zentrifugieren bei 5 000 mal G, für sieben Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter LB wieder auf, ergänzt durch 30% Glycerin.

Dann machen Sie einen Milliliter Aliquots der Transposon-Bibliothek in Kryovials und speichern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Verdünnen Sie die gDNA mit TE-Puffer auf eine Konzentration von 250 Nanogramm pro Mikroliter, in einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern, und legen Sie sie in das Wasserbad Beschaller. Beschallen Sie die DNA, um Fragmente von etwa 300 Nukleotiden zu ergeben.

Bestätigen Sie, dass die DNA durch das Ausführen von 10 Mikrolitern ungehörter DNA und 10 Mikroliter gescherter DNA auf einem 1%hog roast gel. Wiederholen Sie bei Bedarf die Beschallung. Um den Polly-Samenschwanz an das drei Hauptende der schieren DNA zu setzen, richten Sie die politische Reaktion ein, wie im Textmanuskript beschrieben, und inkubieren Sie die Reaktionsröhren für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Um die politische Reaktion zu reinigen, fügen Sie jeder Probe eine paramagnetische Nader mit 40 Mikrolitern Größenauswahl hinzu und wirbeln sie das Reaktionsröhrchen aus. Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Dann zentrifugieren Sie sie kurz, um die Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln.

Übertragen Sie die Rohre in ein magnetisches Rack und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für zwei Minuten oder bis die Lösung klar ist. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitetes, 80%Ethanol hinzu, ohne die Perlen zu stören. Inkubieren Sie die Proben, bis die Lösung klar ist.

Entfernen Sie dann den Überstand und wiederholen Sie die Ethanolwäsche. Zentrifugieren Sie die Rohre kurz und legen Sie sie wieder in das magnetische Rack, um die verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für zwei bis fünf Minuten, damit sie trocknen.

Und fügen Sie 25 Mikroliter Wasser zu jeder Röhre hinzu. Wirbel sie für etwa fünf Sekunden oder Pipette auf und ab. Zentrifugieren Sie dann die Rohre, um Flüssigkeit am Boden zu sammeln.

Übertragen Sie die Rohre auf das Magnetgestell und lassen Sie sie etwa zwei Minuten sitzen, bis die Lösung klar ist. Dann übertragen Sie den Überstand in eine neue Röhre, ohne die Perlen zu stören. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine Transposonbibliothek mit hoher Dichte im A-Baumannii-Stamm ATCC 17978 durch bakterielle Konjugation mit E-coli MFD DAP auxotroph zu erzeugen, die das Plasmid pJNW684 repliziert.

Die gezogene A-baumannii Transposon-Mutant-Bibliothek wurde verwendet, um Fitnessfaktoren zu identifizieren, die für die Colistin-Resistenz unter subhemmenden Konzentrationen der antimikrobiellen konzentrationen wichtig sind. Nach der Erschöpfung der mutierten Bibliothek von Genen, die zur Colistin-Resistenz beitragen, wurde die gesamte gDNA des verbleibenden Bibliothekszuges von Kontroll- und Experimentellen Kulturen isoliert. Die gDNA wurde mit mechanischem Scheren fragmentiert und den DNA-Fragmenten wurde ein Policy-Schwanz hinzugefügt, um die Sequenzierung vorzubereiten.

DNA-Konzentrationen wurden berechnet und die Proben wurden mit einer chipbasierten Kapillarelektrophorese analysiert, um erfolgreiche Bibliotheksbauten zu bestätigen. Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist, das Paarungsvolumen anzupassen, basierend auf CFU-Zahlen für bestimmte Zielstämme, um eine hochauflösende Mutantenbibliothek zu generieren. Zusätzlich muss der Empfängerstamm empfindlich auf den Antibiotikaresistenzmarker reagieren, indem er das Transposon vor der Mutagenese verwendet.

Nach diesem Verfahren kann die Genlöschung oder die Sound-Saying-Methode durchgeführt werden, um einzelne Köpfe aus Sequenzierungsergebnissen herauszuschlagen und Gene von Interesse unter angegriffenen Bedingungen zu validieren.