Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

Gram-negatif bakterilerde doymak üzere transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak ve daha sonra yüksek işlemli sıralama için DNA amplicon kütüphanelerinin hazırlanmasını tanımlayan bir yöntem. Örnek olarak, biz ESKAPE patojen, Acinetobacter baumanniiodaklanmak , ama bu protokol Gram-negatif organizmaların geniş bir yelpazede için münasip olduğunu.

Abstract

Transposon sıralama (Tn-seq) çevre koşulları geniş bir yelpazede bakteriyel fitness katkıda genler ve yollar belirlemek için transposon mutagenez ve büyük paralel sıralama birleştiren güçlü bir yöntemdir. Tn-seq uygulamaları geniştir ve sadece bir organizma düzeyinde değil, aynı zamanda nüfus, toplum ve sistem düzeylerinde genotip-fenotip ilişkilerinin incelenmesini sağlamıştır. Gram-negatif bakteriler yüksek antimikrobiyal direnç fenotipler ile ilişkilidir, hangi antibiyotik tedavi yetmezliği olayları artmıştır. Antimikrobiyal direnç aksi takdirde öldürücü antibiyotik varlığında bakteriyel büyüme olarak tanımlanır. "Son hat" antimikrobiyal kolistin Gram-negatif bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde kullanılır. Ancak, Acinetobacter baumannii de dahil olmak üzere çeşitli Gram-negatif patojenler, moleküler mekanizmalar bir dizi kolistin direnci gelişebilir, bazıları Tn-seq kullanılarak karakterize edildi. Ayrıca kolistin direncini düzenleyen sinyal iletim yolları Gram-negatif bakteriler içinde farklılık gösterir. Burada, restriksiyon enzimleri, adaptör ligasyonu ve jel saflaştırma ihtiyacını ortadan kaldırarak doygun bir transposon ekleme kütüphanesi ve amplicon kütüphane inşaatı nın neslini kolaylaştıran A. baumannii'de transpozon mutagenezinin etkili bir yöntemini öneriyoruz. Burada açıklanan yöntemler, kolistin ile meydan okunduğunda A. baumannii fitness katkıda moleküler determinantların derinlemesine analizini sağlayacaktır. Protokol aynı zamanda diğer Gram-negatif ESKAPE patojenleri için de geçerlidir, hangi öncelikle ilaca dirençli hastane kaynaklı enfeksiyonlar ileilişkilidir.

Introduction

Antibiyotiklerin keşfi şüphesiz20. Sadece antibiyotikler hızlı ciddi bakteriyel enfeksiyonları çözmek yok, onlar da modern tıpta önemli bir rol oynamaktadır. Büyük ameliyatlar, nakiller ve yenidoğan tıbbı ve kemoterapi gelişmeler hastaları hayatı tehdit eden enfeksiyonlara duyarlı bırakın ve bu tedaviler antibiyotik olmadan mümkün olmaz1,2. Ancak, hızlı gelişimi ve insan patojenler arasında antibiyotik direncinin yayılması önemli ölçüde antibiyotik lerin tüm klinik açıdan önemli sınıfların etkinliğini azaltmıştır3. Bir zamanlar kolayca antibiyotik tedavisi ile temizlendi birçok bakteriyel enfeksiyonlar, artık klasik tedavi protokolleri yanıt, küresel halk sağlığı için ciddi bir tehdit neden1. Antimikrobiyal direnç (AMR) bakteri hücrelerinin antibiyotik aksi takdirde ölümcül konsantrasyonlarda büyümek nerede, ne olursa olsun tedavi süresi4,5. Alternatif antimikrobiyal gelişime rehberlik edecek olan AMR'yi düzenleyen moleküler ve biyokimyasal faktörleri anlamak için acil bir ihtiyaç vardır. Özellikle, ESKAPE patojenleri klinik ortamlarda sorunlu ve geniş AMR ile ilişkilidir. Bunlar arasında Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa ve Enterobacter spp sayılabilir. ESKAPE patojenlerinde çeşitli mekanizmalar AMR'ye katkıda bulunurken, son dört organizma Gram-negatiftir.

Gram-negatif bakteriler, onları olumsuz çevre koşullarından koruyan tanımlayıcı bir dış zar ı bir araya toplarlar. Dış membran hücreiçine antibiyotik gibi toksik moleküllerin girişini kısıtlamak için bir geçirgenlik bariyeri olarak hizmet vermektedir. Diğer biyolojik zarların aksine dış zar asimetriktir. Dış broşür yüzeye maruz lipopolisakkarit ile zenginleştirilmiştir, iç broşür fosfolipidler karışımı ise6. Lipopolisakkarit molekülleri, lipid çift katmanlı7'niniçine gömülü korunmuş bir lipid a moiety ile dış zara demirlenir. Kanonik lipid Escherichia coli lipopolysaccharide bir etki alanı en Gram-negatif bakterilerin büyümesi için gereklidir ve Gram-negatif organizmaların en temel ve korunmuş yollarından biri olan dokuz adımlı enzimatik yol ile sentezlenir6,7,8.

Polimiksinler, lipid A etki alanını, dış zarı perturb ve hücre yiyiştirmek için hedef katyonik antimikrobiyal peptidlerdir. Poliksinlerin pozitif yüklü kalıntılar ve negatif yüklü lipid A fosfat grupları arasındaki elektrostatik etkileşim sonuçta hücre ölümüne yol açan bakteri hücre zarını bozabilir9,10,11,,12,13. Kolistin (polimiksin E) acinetobacter baumannii14,,15,16gibi çok ilaca dirençli Gram-negatif nosokomiyal patojenlerin neden olduğu enfeksiyonların tedavisinde kullanılan son çare bir antimikrobiyaldir. İlk keşfedilen 1947, polimiksinler toprak bakterileri tarafından üretilmektedir, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polimaksisinler, klinik kullanımları önemli nefro- ve nörotoksisite raporları nedeniyle sınırlı önce yıllarca Gram-negatif enfeksiyonları tedavi etmek için reçete edildi20,21.

A. baumannii son yıllarda hasta sonuçlarının morbidite ve mortalitesini önemli ölçüde artıran nosokomiyal Gram-negatif patojendir22. Ne bir zamanlar düşük tehdit patojen olarak kabul edildi, şimdi amr ve salgın yüksek risk elde etmek için inanılmaz yeteneği nedeniyle dünya çapında hastane kaynaklı enfeksiyon için önemli bir risk teşkil23,24. A. baumannii Amerika Birleşik Devletleri'nde nosokomiyal enfeksiyonların% 10'dan fazla hesapları. Hastalık pnömoni, bakteriyemi, idrar yolu enfeksiyonları, deri ve yumuşak doku enfeksiyonları, menenjit ve endokardit25olarak kendini gösterir. A. baumannii enfeksiyonları için tedavi seçenekleri β-laktamlar, florokinolonlar, tetrasiklin ve aminoglikozitler 23 dahil olmak üzere hemen hemen tüm antibiyotik sınıflarına karşı direnç nedeniyle azalmıştır ,,24.23 Çoklu ilaca dirençli, yaygın ilaca dirençli ve pan-ilaca dirençli A. baumannii izole prevalansı kolistin tedavisinde bir canlanma yol açmıştır, hangi hala çok ilaca dirençli A. baumanniikarşı etkili kalan birkaç tedavi seçeneklerinden biri olduğu düşünülmektedir . Ancak, A. baumannii izole arasında artan kolistin direnci daha da,küresel halk sağlığı10,11,12,,13,27,30,31için tehdit güçlendirdi .

Transposon sıralama (Tn-seq) gibi yüksek iş letme teknolojisindeki son gelişmeler, in vitro ve in vivobakteriyel fitness anlayışımızı ilerletmek için önemli araçlar sağlamıştır. Tn-seq bakterilerde genotip-fenotip etkileşimleri çalışma için kaldıraçlı olabilir güçlü bir araçtır. Tn-seq bakteriyel patojenler arasında geniş uygulanabilir, bu hızla ekleme siteleri harita için büyük paralel sıralama ile geleneksel transposon mutagenezi birleştirir, hangi bir genom çapında ölçekte henotypic varyantları DNA mutasyonları bağlamak için kullanılabilir32,33,34,35. Transpozon mutagenez yöntemleri daha önce tanımlanmış olsa da, genel adımlar benzer33. İlk olarak, bir ekleme kitaplığı transposon mutagenez kullanılarak oluşturulur, burada bir popülasyon içindeki her bakteri hücresi genomik DNA (gDNA) içinde tek bir transpozon ekleme ile sınırlıdır. Mutagenezi takiben, bireysel mutantlar bir araya gelir. gDNA ekleme mutant havuzundan çıkarılır ve transposon kavşakları yükseltilir ve yüksek işlem lisekite tabi tutulur. Okumalar, genoma eşlenen ekleme sitelerini temsil eder. Fitness azaltmak Transposon eklemeler hızla nüfus tan dışarı düşmek, yararlı eklemeler zenginleştirilmiş ise. Tn-seq genlerin stres33bakteriyel fitness nasıl etkilediğini anlayışımızı ilerletmek için etkili olmuştur.

PJNW684 kodlu Himar1 mariner transposon sistemi özel olarak inşa edilmiş ve transposon mutagenezi amacıyla optimize edilmiştir. A. baumannii'de transposon ekleme mutantlarının seçiminde kullanılan kanamisin direnci genini çevreleyen bir denizci-aile transposon içerir. Ayrıca transposaz kodlama geni36ekspresyonu sürücüler bir A. baumannii özel organizatörü kodlar. Marinertabanlı transposon da ekleme37okuma yoluyla engeller kanamisin direnç geni, iki çeviri terminatörleri içerir. pJNW684 ayrıca38'içoğaltmak için donör ünyatının katkıda bulunduğu λpir geni gerektiren bir RP4/oriT/oriR6K-koşullu çoğaltma kaynağı taşır. λpir geninin yokluğunda, transpozisyon mekanizmasını taşıyan pJNW684 vektörü A. baumannii alıcı suşu10,36,38'deçoğalamaz. Bu nedenle, bakteriyel konjugasyon sırasında, sadece transposon transposaz geni taşıyan plazmid, arka plan ekleme olmadan alıcı genom içine yerleştirilir. Bu önemli, çünkü transpozaz aktivitesinin ve plazmidin kaybı, transpozonun alıcı genoma girdikten sonra farklı konumlara taşınmasını engelleyen tek ve kararlı transpozisyon olayıyla sonuçlanır.

pJNW648 de başka bir Gram-negatif organizma, E. coliaktivite için test edilmiştir. E. coli suş W3110 bir doymak Tn-seq kütüphane başarılı montaj sistemin enterobacteriaceae dahil patojenler geniş bir yelpazede mutagenez gerçekleştirmek için münasip olduğunu belirtti. Ayrıca, transposaz ekspresyonu yönlendiren A. baumannii özel organizatörü hızla türe özgü bir promotör ile değiştirilebilir. Son olarak, kanamisin direnç geni, çalışılan organizmanın AMR fenotipine bağlı olarak diğer direnç kasetleri ile değiştirilebilir.

A. baumannii kolistin direncine katkıda bulunan bir faktör yetersiz dozların uygulanmasıdır, bakterilerin öldürücü olmayan seviyelerde seçici basınca maruz kaldığı39. Çeşitli raporlar subinhibitory antimikrobiyal konsantrasyonları tüm bakteri popülasyonunun duyarlılığını azaltmak için hücre fizyolojisi değiştirmek düzenlenmiş yanıtları neden olabilir gösterdi11,12,30,31. Tn-seq kullanarak, a. baumannii zorlanma ATCC 17978'de kolistin direncini düzenleyen10 faktörler keşfettik. Bu örnekte, 40,40,41, 41,mariner tabanlı transposon ailesi kullanılarak doymuş transposon mutant kütüphanesinin inşası ve zenginleşmesini kolaylaştıran bir Tn-seq yöntemi ayrıntıları. Birkaç Tn-seq protokolleri oluşturmak iken 20,000 - 100,000 mutantlar35,42,43,44,45,46, burada açıklanan protokol hızla 400.000 + mutantlar bir transposon kütüphane oluşturabilir, kabaca Bir transposon ekleme her 10-baz çiftleri eşittir.10 Ayrıca, kitaplık boyutu önemli bir ek çaba olmadan ölçeklendirilebilir. Bu yöntem aynı zamanda son kütüphane çeşitliliğini azaltabilen kısıtlama endonükleazları, bağdaştırıcı ligasyonu ve jel arınması gereksinimini de ortadan kaldırır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bakteriyel suş hazırlığı

  1. Çizgi "donör" suşu(E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tablo Malzemeler) Luria-Bertani agar üzerinde izole koloniler için 600 μM diaminopimelik asit ile takviye (DAP), 100 mg / L ampisilin ve kanamisin 25 mg / L. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Tek bir izole koloni kullanarak, 600 μM DAP, 100 mg/L ampisilin ve 25 mg/L kanamisin içeren 50 mL Luria suyu (LB) 250 mL Erlenmeyer şişesinde inoküle edin ve "donör" olarak etiketlendi.
  2. Luria-Bertani agar üzerinde izole koloniler için "alıcı" suşu(A. baumannii zorlanma ATCC 17978, Malzeme Tablosu)çizgi. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Tek bir izole koloni kullanarak, 250 mL Erlenmeyer şişesinde 50 mL LB aşılamak ve "alıcı" olarak etiket.
  3. Her iki kültürü de ("donör" ve "alıcı") bir gecede 37 °C'de sallayarak kuluçkaya yatırın.

2. Bakteriyel mite

  1. Gece kültürlerini 50 mL konik tüplere aktarın.
  2. Pelet hem alıcı hem de donör kültürlerde santrifüj kullanarak 5.000 x g 7 dk.
  3. Supernatant atın ve artık antibiyotikleri temizlemek için DAP ile desteklenen LB 35 mL "donör" suş pelet resuspend.
  4. Pelet "donör" gerinim hücreleri 7 dakika için 5.000 x g santrifüj kullanarak.
  5. Supernatant atın ve DAP ile desteklenen LB 4.5 mL "donör" suşu pelet resuspend. 10 mL serolojik pipet kullanın.
  6. Yeniden askıya alınan "donör" türünü peletli "alıcı" hücreleri içeren "alıcı" gerinim tüpüne aktarın. Kültürleri karıştırmak için adım 2.5'ten aynı 10 mL serolojik pipeti kullanın. Hemen bir sonraki adıma geçin.
    NOT: Son süspansiyonun toplam hacmi 5 mL olmalıdır.
  7. Dap (plaka başına 5-7 damlacık) ile desteklenen LB agar plakalarında tek tek 100 μL damlacıklar olarak miyon süspansiyon dağıtın (Şekil 1A).
  8. 30 dakika oda sıcaklığında inkübasyon plakaları.
  9. Damlacıkları rahatsız etmeden, plakaları dikkatlice 37 °C'lik bir kuluçka makinesine aktarın ve kültürlerin 1 saat çiftleşmesinibekleyin.
    NOT: 1 saati aşan kuluçka süreleri kardeş mutantların neslini riske eder.
  10. Kuluçkadan sonra, her plakanın üzerine 1,5 mL LB ekleyin ve tabaklardan bakterileri yeniden susuutarak hasat edin. Resuspension için 1 mL mikropipet kullanın. Son hacim yaklaşık 12 - 15 mL olmalıdır.
  11. Hasat edilen hücreleri 50 mL konik bir tüpte birleştirin.
  12. Pelet 7 dk için 5.000 x g santrifüj kullanarak çiftleştirilmiş hücreler.
  13. Arta kalan DAP'yi gidermek için 50 mL LB'deki süpernatant ve resuspend hücreleri atın.
  14. Pelet 7 dk için 5.000 x g santrifüj kullanarak muvarimi.
  15. Yıkama adımını (adım 2.13 ve 2.14) tekrarlayın.
  16. 10 mL serolojik pipet kullanarak, LB 10 mL içinde pelet resuspend 25% gliserol ile takviye.
  17. Yıkanmış hücreleri kullanarak, LB suyu beş seri seyreltme yapmak (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Spread 100° Steril cam boncuklar kullanarak 4 farklı plakaüzerinde her seyreltme: Luria-Bertani agar kanamisin ile desteklenmektedir, agar ampisilin ile desteklenmektedir, agar DAP ve agar sadece ile desteklenir.
  19. Bir gecede 37 °C'de kuluçka plakaları.
  20. Aliquot kalan miyrelik 1 mL aliquots ve saklamak -80 °C.

3. Transposon kütüphanesinin uygun seyreltilmesini belirlemek

  1. Gece plakalarından koloni oluşturan birimleri (CFU) kaydedin.
  2. Her farklı plaka koşulu için sayılabilir kolonilere sahip bir plaka görüntüle(Şekil 2A).
    NOT: Hem "donör" hem de "alıcı" suşları DAP ile takviye agar plakaları üzerinde büyümek gerekir, bu yüzden en kaplama seyreltme bir çim verecektir. Sadece "alıcı" zorlanma agar plakaları üzerinde büyüyebilir. Ne "donör" ne de "alıcı" suşu ampisilin ile desteklenen agar plakaları üzerinde büyüyebilir, bu yüzden hiçbiri / minimal büyüme olmalıdır. Transposon ekleme kodlama sadece hedef zorlanma hücreleri kanamisin ile desteklenen agar plakaları üzerinde büyüyebilir. Koloniler boyutu nda değişiklik olmalıdır, kanamisin ile desteklenen agar fitness katkıda genlerde transpozon eklemeler gösteren.
  3. Kanamisin ile desteklenen LB agar plakaları üzerinde kolonilerin sayısını sayarak dondurulmuş miyon mutantların sayısını hesaplayın.
    NOT: A. baumannii genomu (yaklaşık 4 Mbps) için amaç, yüksek çözünürlüklü bir mutant kütüphanesi (yaklaşık bir transposon ekleme/10 baz çifti) oluşturmak için yaklaşık 400.000 koloni elde etmekti. Ancak, bu sayı hedef türün genom büyüklüğüne göre optimize edilmelidir).

4. Son bakteriyel mutant kütüphane üretimi

  1. Buz üzerinde donmuş kenetürenin bir aliquot'unu erit.
  2. Adım 3.1'de hesaplanan CPU'lar dayalı kanamisin ile desteklenen 150 mm Luria-Bertani agar plakaları üzerinde plaka eşleme. Kaplamadan önce 150°L'de 13.333 koloni elde etmek için LB ile hacmi ayarlayın.
    NOT: Buradaki CFU sayısı nın yaklaşık 105 CFU/mL olduğu belirlendi, bu nedenle yüksek çözünürlüklü mutant kütüphane için 30 plaka üzerinde optimum sayıda koloni sağlayabileceğinden, plaka başına 13.333 koloni elde etmek için birleşme hacmi ayarlandı.
  3. 400.000 koloni elde etmek için kanamisin ile takviye edilmiş 30 x 150 mm Luria-Bertani agar plakaları üzerinde plaka başına seyreltme 150 μL yaymak için steril cam boncukkullanın(Şekil 1C).
    NOT: Steril çubuklar veya her türlü steril spreader aracı (yani, cam boncuklar) plakalar üzerinde bakteri yaymak için kullanılabilir.
  4. Aşırı mipling içeren kullanılan tüpü atın.
    NOT: Donma/çözülme döngüleri bakteri kültürü üzerinde seçici baskılar ekler, bu da Tn-seq deney sonuçlarını çarpıtabilir. Her seferinde taze bir aliquot kullanın.
  5. 37 °C'de 14 saat boyunca kuluçka plakaları.
    NOT: Kuluçka süresi aşırı büyümeyi (kolonilerin birbirine değmesini) önlemek için optimize edilmiştir. Kuluçka süresini kısaltarak büyümeyi en aza indirmek önerilmektedir.

5. Kütüphane yoğunluğunu tahmin etme ve depolama için havuzoluşturma

  1. Transposon kütüphanesindeki toplam mutantları tahmin etmek için her plakadaki CPU'ları say. Tüm plaka grubu için koloni sayımı tahminini belirlemek için en az 3 plakanın %20'sini sayın(Şekil 2A). Kolonilerin başka bir koloniye dokunmadığından emin ol.
  2. Tahmini koloni verimi hesaplandıktan sonra, her plakaya 3-5 mL LB (veya gerekirse daha fazla) ekleyin ve steril bir kazıma aleti kullanarak bakterileri kazıyın.
    NOT: Plakaları verimli bir şekilde kazımak için steril aşılama döngüleri kullanılmıştır.
  3. Tüm plakalardan 50 mL konik tüplere havuz bakteri süspansiyonları(Şekil 1D). Bu birden fazla 50 mL konik tüpler, en az 3 gerektirir.
  4. Pelet 7 dk için 5.000 x g santrifüj kullanarak bakteriyel süspansiyon havuzlu.
  5. % 30 gliserol ile desteklenen LB 5 mL supernatant ve resuspend pellet atın.
  6. Transposon kütüphanesinin 1 mL'si cryovial'lara ve -80 °C'de saklayabilirsiniz.

6. A. baumannii'de kolistin direncini düzenleyen faktörlerin belirlenmesi

  1. Her biri 50 mL LB et suyu ve etiketli 4 x 250 mL Erlenmeyer şişeleri hazırlayın (Şekil 2B)
    1. A. baumannii strain ATCC 17978 Tn-seq kütüphanesi; (-) colistin_1
    2. A. baumannii strain ATCC 17978 Tn-seq kütüphanesi; (-) colistin_2
    3. A. baumannii strain ATCC 17978 Tn-seq kütüphanesi; (+) colistin_1
    4. A. baumannii strain ATCC 17978 Tn-seq kütüphanesi; (+) colistin_2
      NOT: Burada açıklanan meydan okuma da, her koşul, (-) kolistin kontrolü ve (+) kolistin mücadelesi, yinelenen olarak test edilmektedir. Bu nedenle, kurulum 4 x 250 mL Erlenmeyer şişeleri, durum başına iki gerektirir.
  2. (+) kolistin şişelerine (+) kolistin şişelerine (6.1.3 ve 6.1.4) 50 μL su ve (-) kolistin şişelerine (6.1.1 ve 6.1.2) 50 μL su ekleyin.
  3. Buz üzerinde adım 5 bir dondurulmuş Tn-seq kütüphane aliquot çözülme.
  4. Pipet 1 μL çözülmüş kitaplığın 1 mL PBS içine.
  5. Optik yoğunluğu 600 nm (OD600)olarak ölçün ve 1.000 ile çarpın.
    NOT: Bu, Tn-kitaplığın 1 μL'lik OD600'unu belirler.
  6. Adım 6.5'teki hesaplamaya göre, 50 mL LB içeren her şişeyi son bir OD600 0,001'e kadar inoküle edin.
  7. 37 °C'den OD600 0.5'e kadar sallanan bir kuluçka makinesinde kültürleri büyütün.
    NOT: Kültürlerin logaritmik büyüme evresinde kalması önemlidir, bu nedenle eğer zorlanmanız üstel büyüme sırasında farklı bir OD600'deyse, kültürün logaritmik büyüme evresinde mümkün olduğunca çok kez çoğalmasını sağlamak için OD600'ün ayarlanması gerekir. Kültür sadece 3 kez çoğalırsa, mutantlarda fitness kusurları tespit etme gücü teoride 3 kat farklarla kaplanır. Farklı bakterilerin farklı katlama süreleri olduğundan, başlangıç inokülü normalleştirmek için sabit bir OD600'de kültürleri tohumlamak önemlidir. Bu, tüm kültürlerde tüm kütüphanenin tutarlı bir şekilde temsil edilmesini sağlar.
  8. 4 °C'de 5000 x g'de 7 dk santrifüj kullanarak hasat kültürleri.
  9. Supernatant çıkarın ve PBS 50 mL ile yıkayın.
  10. Pelet 7 dk için 4 °C'de 5.000 x g santrifüj kullanarak.
  11. Supernatant çıkarın ve PBS 1 mL pelet resuspend. Aliquot ~ 200 μL içine 5 mikrosantrifüj tüpler.
  12. 5 dakika boyunca 4 °C'de 5.000 x g'de santrifüj kullanan pelet. Bir pipet ucu kullanarak tüm supernatant çıkarın.
  13. Peletleri -20 °C'de saklayın veya gDNA ekstraksiyonuna devam edin.

7. gDNA çıkarma

  1. Buz üzerinde bir hücre pelet eritin.
  2. Peleti tamamen yeniden askıya almak için 0,6 mL lysis tampon(Malzeme Tablosu)ve girdap ekleyin.
  3. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  4. Numuneye ve girdaba kuvvetle 0,6 mL fenol/kloroform/izoamyl alkol ekleyin.
  5. 5 dakika oda sıcaklığında maksimum hızda bir mikrosantrifüj santrifüj kullanarak ayrı aşamaları.
  6. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Aktarım sırasında faz arabirimini rahatsız etmekten kaçının.
  7. Yukarıda elde edilen sulu faz ve girdap şiddetle kloroform eşit hacimli ekleyin.
  8. 5 dakika oda sıcaklığında maksimum hızda mikrosantrifüj santrifüj kullanarak ayrı aşamaları.
  9. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın.
    NOT: Aktarım sırasında arabirimi rahatsız etmekten kaçının.
  10. Soğuk 2.5x sulu faz hacmi ekleyin 100% etanol ve yavaşça karıştırın. Çökelmiş DNA görünür olacak.
  11. Tüpü -80 °C'de en az 1 saat yerleştirin.
  12. Pelet DNA 30 dakika boyunca 4 °C'de maksimum hızda santrifüj kullanarak.
  13. DNA peletini bozmadan supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve pipetleme ile %70 etanolün 150°L'sini yıkayın.
  14. Pelet DNA'sı maksimum hızda 4 °C'de 2 dk santrifüj kullanır.
  15. Dikkatle supernatant çıkarın.
  16. 7.14 adımLarını bir kez tekrarlayın. Kalan tüm etanolleri dikkatlice çıkarın.
  17. 5-10 dakika oda sıcaklığında kuluçka yadarak kuru DNA.
  18. 100 μL TE tamponundaki DNA peletini pipetleme ile yeniden askıya alın.

8. DNA kesme (Şekil 3A)

  1. TOPLAM 200 μL hacimde 250 ng/mL konsantrasyonuna TE tamponu ile seyreltin.
  2. Bir su banyosu sonicator tüpler yerleştirin.
  3. Yaklaşık 300 nükleotit parçası elde etmek için SONICate DNA. Güç: %60, Toplam Süre: 20 dk, Döngüler: 10 s ACI ve 10 s KAPALI 4 °C(Şekil 3A).
  4. DNA'nın %1'lik agarose jelüzerinde 10 μL'lik sheared DNA ve 10 μL'lik yığılmış DNA'yı ayırarak uygun şekilde ayrıştırır. Sonication tekrarlayın veya gerektiğinde optimize (Şekil 3B).

9. 3' ucuna Poly-C kuyruk ilavesi (Şekil 3A)

  1. Tablo 1'e göre kurulum poli-C reaksiyonu.
  2. 37 °C'de 1 saat boyunca kuluçka reaksiyonu.
  3. Aşağıdaki adımları izleyerek 40 μL boyut seçimi paramanyetik boncuklar(Şekil 3A)ile poli-C reaksiyonu arındırın.
    1. Her numuneye 40 μL boyut seçimi paramanyetik boncuk ekleyin. Girdap ~ 5 s veya pipet yukarı ve aşağı.
    2. 5 dakika oda sıcaklığında inkübasyon örnekleri.
    3. Kısaca, merkezci tüpler tüpün altında sıvı toplamak için (~ 2 s).
    4. Tüpleri manyetik bir rafa aktarın ve çözelti netolana kadar oda sıcaklığında ~ 2 dk kuluçkaya yatırın.
    5. Manyetik raf tüpleri ile, dikkatle supernatant çıkarın.
    6. Manyetik raf üzerindeki tüplerle, 200 μL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin (boncukları rahatsız etmeyin).
    7. Çözelti temizolana kadar en az 30 s'lik kuluçka numuneleri.
    8. Manyetik raf tüpleri ile, dikkatle supernatant çıkarın.
    9. Yıkama adımını tekrarlayın (9.3.6 - 9.3.8 adımları).
    10. Kısa bir santrifüj adımı (~ 2 s) kullanarak tüpün alt kısmında sıvı toplayın.
    11. Tüpleri manyetik rafa aktarın ve kalan sıvıları çıkarın.
    12. Kuru numuneler için 2-5 dk oda sıcaklığında kuluçka. Kuru üzerinde etmeyin.
    13. Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve her birine 25°L su ekleyin. Girdap ~ 5 s veya pipet yukarı ve aşağı için.
    14. Kısaca, merkezci tüpler tüpün altında sıvı toplamak için (~ 2 s).
    15. Tüpleri manyetik rafa aktarın ve çözelti temizolana kadar ~ 2 dk boyunca oturun.
    16. Manyetik rafüzerindeki tüplerle, boncukları rahatsız etmeden sıvıyı çıkarın ve yeni bir tüpe (~ 23 μL DNA) aktarın.

10. Transpozon kavşak amplifikasyonu (Şekil 3A)

  1. İlk iç içe pcr için Tablo 1'de açıklandığı gibi KURULUM PCR 1 (Tablo 2).
  2. PcR 1'i Tablo 1'de açıklanan koşulları kullanarak gerçekleştirin.
  3. PCR ürünlerini 40 μL boyut seçimi paramanyetik boncuklarla arındırın (9.3.1 – 9.3-12. adım). 50 μL suda (9.3.13 - 9.3.16 adım) elute. Bu noktada numuneler -20 °C'de saklanabilir.
  4. Streptavidin-çift paramanyetik boncukhazırlayın:
    1. Şiddetle sallayarak Streptavidin boncukresuspend.
    2. Taze bir mikrosantrifüj tüpüne numune başına 32 μL boncuk ekleyin.
      NOT: 6 + numune ler için boncuklar tek bir tüpte hazırlanabilir.
    3. Tüpü manyetik bir rafa aktarın. Çözelti temiz olana kadar ~ 2 dk için kuluçka.
    4. Manyetik raf üzerinde tüp ile, supernatant çıkarın.
    5. Tüpü manyetik raftan çıkarın. 1 mL 1x B&W tamponunda yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak boncukları yıkayın.
    6. Tüpü manyetik rafa aktarın. Çözelti temiz olana kadar ~ 2 dk için kuluçka.
    7. Manyetik raf üzerinde tüp ile, supernatant çıkarın.
    8. Toplam 3 yıkama için 1 mL 1x B&W tampon (adım 10.4.5 – 10.4.7) ile yıkama adımını tekrarlayın.
    9. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve numune başına 52 μL'lik 2x B&W tamponunda boncukları yeniden askıya alın.
  5. Hazırlanan boncukların 50 μL'sini 50 μL saflaştırılmış PCR1 ile birleştirin (adım 10.3'ten itibaren). Pipet karıştırmak için.
  6. 30 dakika oda sıcaklığında döndürün.
  7. Bağlanmamış DNA'yı yıkayın:
    1. Kısaca, tüpün altında sıvı toplamak için santrifüj (~ 2 s).
    2. Tüpü manyetik rafa aktarın. Çözelti net olana kadar ~ 2 dk için kuluçka.
    3. Manyetik raf üzerinde tüp ile, supernatant çıkarın.
    4. Tüpü manyetik raftan çıkarın, 100 μL 1x B&W tamponu ve yukarı ve aşağı borulama ile boncukları yıkayın.
    5. Tüpü manyetik rafa aktarın. Çözelti net olana kadar ~ 2 dk için kuluçka.
    6. Manyetik raf üzerinde tüp ile, supernatant çıkarın.
    7. Toplam 3 yıkama için 100 μL LoTE (adım 10.7.4 – 10.7.6) ile yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
  8. Transpozon kavşaklarını yükseltmek ve her örneğe tek barkod eklemek için Tablo 1'de açıklandığı gibi KURULUM PCR2 (Tablo 2 ve Tablo 3).
  9. Tablo 1'deaçıklanan koşulları kullanarak PCR 2'yi gerçekleştirin.
  10. 40 μL boyutu seçimli paramanyetik boncuklarla arındırın (9.3.1 – 9.3.12. adım). 17 μL suda (9.3.13 - 9.3.16 adım) elute, ~ 15 μL toplayın.
  11. Florometre kullanarak DNA konsantrasyonu ölçün. Son konsantrasyonlar ~ 50 ila 250 ng/μl olmalıdır.
  12. Çip esaslı kılcal elektroforez kullanarak DNA kalitesini değerlendirin(Şekil 4A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Özetlenen yöntemler E. coli MFD DAP kullanarak bakteriyel konjugasyon yoluyla A. baumannii suşu ATCC 17978 bir yüksek yoğunluklu transposon kütüphane nin nesil açıklar-plazmid pJNW684 çoğaltır (Şekil 4B). Ayrıntılı protokol, pJNW684'ün E. coli λpir+ donör süzmesinden A. baumannii alıcıya transferi için iki ebeveynli bakteriyel konjugasyon unu kullanır. Bu yoğun transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak için verimli ve ucuz bir yöntemdir. Bakteriler optimize edilmiş oranlarda karıştırıldı ve luria-Bertani agar plakalarında 1 saat(Şekil 1A)arasında miyrelikler tespit edildi. Migrleme sırasında transpozon donörden alıcı yaslanmasına transfer edilerek gDNA'ya(Şekil 1B)sokuldu. Maneler toplandı, yaklaşık 105 CFU/mL hesaplandı ve 150 mm x 15 mm agar plakalar üzerinde kanamisin ile takviyeedildi. 37 °C'de 14 saat büyümeden sonra, plakalar transposon mutant kütüphanesinin başarılı bir şekilde neslini gösteren değişen büyüklükte(Şekil 1C)binlerce koloni içeriyordu. Transposon ekleme mutantları bir araya getirildi(Şekil 1D)ve ekleme kitaplığı üzerinde seçici basınç ekleyebilir tekrarlanan donma-çözülme döngüleri önlemek için aliquots dondurulmuş.

Havuzlu A. baumannii transposon mutant kütüphanesi, antimikrobiyalin subinhibitory konsantrasyonları altında kolistin direnci için önemli olan fitness faktörlerini belirlemek için kullanılmıştır (Şekil 2B). Mutant kütüphane, kolistin direncine katkıda bulunan genlerdeki eklemeleri kodlayan mutant hücreleri tüketmek için yinelenen 0.5 mg/L kolistin yokluğunda/varlığında logaritmik faza kadar büyüdü. Kalan kütüphane havuzunun toplam gDNA'sı kontrol ve deneysel kültürlerden izole edilmiş ve DNA'yı sıralamaya hazırlamak için işlenmiştir(Şekil 3A).

İzole gDNA mekanik kırpma kullanılarak parçalandı ve DNA parçalarına poli-C kuyruğu eklendi(Şekil 3A). Poly-C kuyruğu eklenmesinden sonra, DNA saflaştırılmış ve transposon-genom kavşakları poli-C spesifik astar kullanılarak zenginleştirilmiş ve ardından ikinci bir pcr turu kullanılarak, Illumina akış hücresi ve neslinin bağlanması için gerekli olan P7 sıralama bölgesini tanıtan başka bir poly-C spesifik astar ve küme kümeleme kitaplıkları sıralama için kullanılan altı bazlı barkod37,47. DNA konsantrasyonları hesaplandı ve örnekler, yüksek iş lenme ye hazır olan başarılı kütüphane yapılarını(Şekil 4A)doğrulamak için çip tabanlı kılcal elektroforez kullanılarak analiz edildi.

DNA kütüphaneleri yeni nesil dizilemeile sıralandı. Transposon kitaplığı 62,5 kat kapsama sağlayan 30 milyon yüksek kaliteli okuma/örnek sağlayan tek uçlu, 50 döngülü bir çalışma gerçekleştirildi. Transposon kavşakları (okumalar) referans genom48eşlenmiştir , ticari olarak kullanılabilir biyoinformatik analiz yazılımı kullanılarak. Giriş örneklerindeki her ekleme yerindeki okuma sayısı, (-) kolistin kontrol koşulu, çıktı örneklerindeki okuma sayısı, (+) kolistin deneysel durumu ile karşılaştırıldı ve her ekleme sitesi için uygunluk puanları hesaplandı. Fitness skorları daha sonra gen tarafından gruplandırıldı. Giriş örneklerine göre kolorin varlığında kütüphane nin varlığında azaltılmış skorlar gösteren genler, kolistinin subinhibitory konsantrasyonlarında A. baumannii sağkalım için fitness belirleyicileri olarak kabul edildi. Örneğin, PmrAB iki bileşenli sistem içindeki transpozon eklemeler giriş örneğinde mevcuttu, ancak çıktı örneğinde bulunamadı. PmrAB doğrudan pmrCifadesini düzenler , hangi lipid Üzerine fosfoetanolamine aktarAn A hücre yüzeyinde şarj nötralize etmekiçin 12,31. Bakteriyel yüzey yükünün nötralizasyonunun kolistin aracılı öldürme için gerekli elektrostatik potansiyeli azalttığı düşünülmektedir. Direnç fenotipine katkıda bulunduğu bilinen tükenmiş genlerin tanımlanması yöntemi doğruladı.

Figure 1
Şekil 1: Transposon mutant kütüphane inşaatı şeması. (A) Bakteriyel konjugasyon. Transpozisyon makinelerini kodlayan "donör" türü , "alıcı" suşuyla karıştırıldı. Karışım LB agar plakaları üzerinde tespit edildi ve 1 saat için çiftleşmek için izin (B) Transposon kütüphane üretimi. Transpozisyon mekanizmasını taşıyan plazmid "donör" suşundan "alıcı" türüne aktarıldı ve transpozon "alıcı" suşunun genomuna rastgele yerleştirildi. (C) Seçimi. Elde edilen hücreler transposon ekleme mutantları için seçmek için kanamisin ile takviye agar plakaları üzerine kaplandı. (D) Havuzlu kütüphane. Koloniler tabaklardan kazınmış, LB'de yeniden askıya alınmış ve havuza alınmış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Temsili bakteriyel konjugasyon sonuçları ve kolistin Tn-seq deney şeması. (A) Temsilci kanamisin seçim plakası. Plaka beş eşit bölüme ayrılmıştır. Mavi nokta, A. baumannii transposon ekleme mutantlarının tahmini için koloni sayma larını temsil eder. Son tahmini hesaplamak için en az üç ayrı plaka sayıldı. (B) Subinhibitory kolistin konsantrasyonlarında fitness faktörlerinin belirlenmesi. Havuzlu transpozon kütüphanesi, kolistinin yokluğunda (kontrol) veya varlığında (deneysel) logaritmik büyüme aşamasına kadar büyütüldü. Kültürler uygun optik yoğunluğa ulaştıktan sonra hücreler peletlenmiş ve her örnekten gDNA çıkarılmıştır. Her koşul toplam dört örnek için çoğaltılmış olarak test edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: DNA amplicon kütüphanesinin akış şeması, büyük paralel sıralama ve temsili sheared gDNA için inşa edin. (A) Tn-seq DNA kütüphanesi şematik oluşturur. Çıkarma işleminin ardından gDNA mekanik kesme ile parçalandı. Terminal deoksinükleodil transferaz transposon-genom kavşakları ve barkod ekleme PCR amplifikasyon önce parçalanmış DNA 3 ' sonuna bir poli-C kuyruk eklemek için kullanılmıştır. (B) GDNA kesme adımını takip eden unsheared ve sheared A. baumannii mutant kütüphanelerin % 1 agarose jel. 1 Kb merdiven DNA belirteci olarak kullanılmıştır. Sheared gDNA yayma öncelikle ~ 100 ve 500 baz çiftleri arasında değişmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Temsili kalite kontrol (QC) sonuçları ve transpozisyon genlerini taşıyan plazmid haritası. (A) BIR DNA kitaplığı oluşturmak için QC iz. ~ 350 baz çiftleri, başarılı kütüphane inşa gösteren bir tepe vardır. QC sonuçlarında daha büyük bir DNA tespit edildiyse, büyük DNA parçalarını çıkarmak için numuneler daha da temizlenebilir. (B) Plazmid pJNW684 mutant seçimi için bir kanamisin direnci kaset (mor) ile Himar1 mariner transposon (yeşil) oluşur, hiperaktif denizci Himar1 C9 transposase (kırmızı) bir A. baumannii 17978 özel organizatörü (mavi), bir ampisilin direnç geni(bla, turuncu) ve replikasyon (sarı) rp4/oriT/oriR6K-koşullu kökeni kontrolü altında kodlama bir gen. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Reaksiyon Kurulum Koşul -ları
Poli-C reaksiyonu 30 μL'lik sheared gDNA
2.5 μL 9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP
10 μL 5X Terminal deoksinükleotidyl transferaz (Tdt) reaksiyon tamponu
1.25 μL rTdt
50 μL'ye 6,25°L su		 37ºC'de 1 saat kuluçka
PCR 1 23 μL 3'-poly-C saflaştırılmış DNA (önceki adımdan tüm örnek)
10 μL 10x yüksek doğruluklu DNA polimeraz reaksiyon karışımı
2 μL 10 mM dNTPs
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 510 biotin
3 μL 30 μM olj 376
0.5 μL yüksek sadakatli DNA polimeraz
8,5 μL saf su ile 50°L toplam		 1 devir: 2 dk 94 ºC
15 döngü: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 dk 68 ºC
1 devir: 4 dk 68 ºC
Bekleme: ∞ 4 ºC
PCR 2 Önceki adımdan DNA bağlı boncuklar
10 μL 10x yüksek doğruluklu DNA polimeraz reaksiyon karışımı
2 μL 10 mM dNTP
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 511
1 μL 30 μM barkod astarı (Tablo 2)
0.5 μL yüksek sadakatli DNA polimeraz
50 μL'ye 33,5 l saf su		 1 devir: 2 dk 94 ºC
15 döngü: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 dk 68 ºC
1 devir: 4 dk 68 ºC
Bekleme: ∞ 4 ºC

Tablo 1: Reaksiyon kurulumu. Poly-C, PCR 1 ve PCR 2 reaksiyonları için kurulum ve koşullar.

Amaç Adı Sıra
Transposon için Anneals olj510-Biotin Biotin-GATGGCCTTTTTTTGCGTTTCTACCTGCAGGGCGCG
Poly-C kuyruğuna annelik olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCtTCCGATCTGG
GGGGGGGGGGGGGGGG
Transpozon + P5 adaptörü için iç içe:
P5 yakalama sitesi – P5 sıralama sitesi– N5 –Tn		 olj511 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTTT
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGGGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
Olj376 iç içe: P7 sıralama sitesi
– barkod XXXXXX – P7 yakalama sitesi)		 M.ö ## CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxXXXGTGA
CTGGAGTTCAGACGTGTG
belirli barkodlar için Tablo 2'ye bakınız***

Tablo 2: PCR amplifikasyon astarları. Transpozon kavşaklarını yükseltmek için protokolde kullanılan PCR amplifikasyon astarları. Her birinin amacı ilk sütunda listelenir.

Astar Okuma Barkod Sıra
M.Ö. 1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGT
GATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
Bc2 CGATGT ACATCG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAC
ATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 3 TTAGGC GCCTAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCC
TAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
Bc4 TGACCA TGGTCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
GGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 5 ACAGTG KACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CACTGTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 6 GCCAAT ATTGGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
TTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 7 ÇAĞATAY GATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 8 ACTTGA TCAAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 9 GATCAG CTGATC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 10 TAGCTT AAGCTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 11 GGCTAC GTAGCC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 12 CTTGTA TACAAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
ACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 13 AGTCAA TTGACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 14 AGTTCC GGAACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 15 ATGTCA TGACAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 16 CCGTCC GGACGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 17 GTAGAG CTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 18 GTCCGC GCGGAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 19 GTGAAA TTTCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC20 GTGGCC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 21 GTTTCG CGAAAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC22 CGTACG CGTACG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
Bc23 GAGTGG CCACTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
CACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC24 GGTAGC GCTACC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 25 ACTGAT ATCAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATCAGTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
Bc26 ATGAGC GCTCAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 27 ATTCCT AGGAAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
GGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 28 CAAAAG CTTTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 29 CAACTA TAGTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 30 CACCGG CCGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CCGGTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
M.Ö. 39 CTATAC GTATAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC40 CTCAGA TCTGAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC42 TAATCG CGATTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
GATTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC43 TACAGC GCTGTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC44 TATAAT ATTATA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATTATAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
Bc45 TCATTC GAATGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GAATGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC46 TCCCGA TCGGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCGGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
Bc47 TCGAAG CTTCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
Bc48 TCGGCA TGCCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

Tablo 3: Barkod astarlar. Barkod astarlar, amplicon'a P7 sıralama alanı ve barkod eklerken transposon kavşaklarını yükseltmek için ikinci PCR adımında kullanılır. Bir kitaplık oluşturmak için tüm barkod astarları gerekli değildir. Sadece örnek sayısı için barkod astargereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A. baumannii kolistin,10 ,11,12,2310,,24,30,31gibi "son satır" terapötikkarşı AMR hızlı edinimi nedeniyle küresel halk sağlığı için ortaya çıkan birtehdittir. Son yıllarda, Tn-seq çok sayıda bakteri türleri arasında genotip-fenotip etkileşimleri açıklığa kavuşturucu kritik bir rol oynamıştır ve bakteriyel genetik anlayışımızı genişleterek34,35,42,43. Tn-seq protokolleri Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, periodontal patojen Porphyromonas gingivalis, ve hatta Mycobacterium tüberküloz37,49,50,51gibi çeşitli bakteri türlerinde temel genlerin belirlenmesinde etkiliolmuştur. Temel genlerin belirlenmesi ötesinde, Tn-seq Pseudomonas aeruginosaantibiyotik direnci genleri tanımlamak için kullanılmıştır , Salmonella typhimurium çeşitli koşullu temel genler, ve Streptococcus pneumoniaeçok sayıda genotip-fenotip ilişkileri52,53,54. Daha yakın zamanda, Vibrio kolera transposon sıralama enfeksiyon sırasında in vivo fitness için önemli olan genleri belirlemek için Kolera bebek tavşan modeli nde kullanılmıştır47. Bu çalışmalar hem in vitro hem de in vivo çalışmalarda kullanılabilen Tn-seq'nin çok yönlülüğünü göstermektedir.

Tn-seq'nin mikrodizi teknolojileri, 2D jel elektroforez ve qPCR gibi diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, genom veya genomik bilgi nin önceden bilinmesini gerektirmemesidir55. Bu nedenle transpozon mutagenezi, büyük-paralel dizileme ile birleştiğinde bilinen gen ve genomların incelenmesinin yanı sıra yeni genetik etkileşimlerin keşfini de mümkün kılmasını sağlar. Burada kolistin subinhibitory konsantrasyonları maruz bakteriyel fitness için gerekli faktörleri belirlemek için A. baumannii son derece yoğun bir transpozon mutant kütüphane oluşturmak için kapsamlı bir yöntem sunduk. Açıklanan yöntem aynı zamanda E. coli 'de (yayınlanmamış veriler) başarıyla kullanılmıştır ve sistemin Enterobacteriaceae dahil olmak üzere diğer Gram-negatif patojenlerde Tn-seq analizinin yapAbilmesini nisbeten göstermiştir.

Insertional mutagenez için mariner transpozons kullanarak çeşitli avantajları vardır. Transposon ailesi ökaryotik konaklardan türemiş ve çeşitli bakteri popülasyonlarında doymak üzere mutant kütüphaneler oluşturmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Mariner transpozonlar konaktan bağımsızdır, bu da belirli konak faktörlerinin yokluğunda kararlı rastgele eklemelerin elde edilebildiği anlamına gelir40,41. Ayrıca, mariner transposons tercihen timin-adenin içine eklemek çünkü ekleme olayları tanımlı bir sayı var ("TA") motifleri, hangi eklemesel önyargı azaltır ve daha sağlam istatistiksel analiz37yol açar,56,57 ,58,58.

Birkaç marinertabanlı Tn-seq yöntemleri gDNA parçalanma için MmeI kısıtlama sindirim kullanın32,42,43. Enzimatik DNA parçalanması popüler ve başarılı bir yöntem olmakla birlikte, prosedüre gereksiz adımlar ekler ve potansiyel önyargıyı artırır37. Sadece bu teknikler başlangıç malzemelerin büyük miktarlarda gerektirir, onlar da potansiyel downstream analizleri ekleme dizileri eşit olmayan temsil yol açabilir37,59. MmeI nükleaz aktivitesi52,,60,,61dayanmayan diğer bazı yöntemler gibi, burada özetlenen yöntem gDNA parçalamak için mekanik kesme dayanır, ve TdT DNA parçalarının 3 ' sonuna bir poli-C kuyruk eklemek için. Enzimatik DNA parçalama ve adaptör ligasyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu yaklaşım daha tutarlı sonuçlar sağlarken DNA başlangıç önemli ölçüde daha küçük miktarlarda gerektirir, aynı zamanda DNA çapraz kontaminasyon riskini azaltır ve kapalı bir tüp37,,59,62hapsi nedeniyle örnek kaybını azaltır. Ayrıca, bu yöntem daha uzun verimleri, dizilerin daha etkili ve hassas haritalama ve daha sağlam bir downstream analizi 37 yardımcı 50 nükleotitler yüksek kaliteli sıralama okur37,59. Sentetik bir poli-C kuyruğunun eklenmesi, bu yöntemin dışa duyarlı bir şekilde eklenen poli-C kuyruğuna dayandığı için, 3' sonunda 16 dG nükleotiti ve 5'in sonunda yeni nesil sıralamaya özgü bir dizi (örneğin, Illumina sıralama) içeren ters astar için bir tanıma alanı olarak eklenmiş poli-C kuyruğuna dayandığı için potansiyel çıkıntıları göz ardı eder, asalsentez eki 47,59. Sentetik nükleotit kuyruk kullanımı, bu yöntemin uygulanmasını kendi doğal içeriğinden bağımsız birçok farklı genomagenişletir 59. Daha sonra, transposon-genom kavşakları poli-C spesifik astar37kullanılarak yükseltilir. Bu alternatif pahalı restriksiyon enzimleri, adaptör ligasyonu, adaptör dimer oluşumu ve jel arıtma adımları ihtiyacını ortadan kaldırarak prosedürü basitleştirir. Biz daha verimli Acinetobacter baumannii dahil olmak üzere çeşitli Gram-negatif ESKAPE patojenlerde son derece doymuş transposon ekleme kütüphaneleri oluşturmak için protokolü optimize var ve çeşitli in vitro ve in vivo koşullar altında genetik etkileşimleri incelemek için kullanılabilir10.

Tn mutagenez bir sınırlama seçim için antibiyotik direnç belirteçleri dayanır. Ancak, birçok Gram-negatif ESKAPE patojenleri çok ilaç veya yaygın ilaca dirençli, kullanıcı ilgi belirli patojen göre direnç kaset değişimi gerekebilir anlamına gelir. Ayrıca, bazı klinik izole ler mariner tabanlı transposon kullanarak transpozon mutagenezi için münasip değildir.

Protokolün kritik bir adımı, Tn mutantlarının plakaya olan sayısını hesaplamaktır. Kaplama çok fazla koloni aşağı analizi zorlaştırabilir bir çim neden olacaktır. Koloniler çok yakın veya dokunaklıysa, kitaplık üzerinde yapıtlara neden olabilecek istenmeyen seçici baskı ekleyebilirler. İdeal olarak, koloniler dokunmadan olmaz ve plaka boyunca eşit aralıklı, gösterildiği gibi (Şekil 2A). Tersine, çok az koloni kaplanmışsa, her gende birden fazla Tn eklemesi izole etmek zor olacaktır.

Adım 2.18'de listelenen denetimleri gerçekleştirmek de önemlidir. 3. bölümün Notunda belirtildiği gibi. 2, ne "donör" ne de "alıcı" suşu Ampicillin ile takviye tabaklarda büyümemelidir. Eksojen DAP "donör" suşu büyüme için gerekli olduğundan, herhangi bir büyüme "alıcı" zorlanma pJNW684 çoğaltır gösterir. Bu önemli bir sorundur, çünkü transpozon gDNA'ya entegre edilmezse, sıralama okumaları bir entegrasyon sitesi değil, yalnızca plazmidle eşlenir. Bu durumda deneme büyük olasılıkla kullanılabilir veri verim olmaz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (Grant AI146829 to J.M.B.) finansmanı ile desteklenmiş ve minnetle kabul edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
  2. Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), Florence, Italy. Spec No 1 159-172 (2001).
  3. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
  4. Scholar, E. M., Pratt, W. B. The antimicrobial drugs. , Oxford University Press. New York. (2000).
  5. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  6. Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
  7. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  8. Raetz, C. R. H., Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annual Review of Biochemistry. 71 (1), 635-700 (2002).
  9. Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
  10. Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
  11. Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478 (2015).
  12. Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
  13. Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
  14. Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
  15. Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
  16. Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
  17. Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263 (1947).
  18. Benedict, R. G., Langlykke, A. F. Antibiotic activity of Bacillus polymyxa. Journal of Bacteriology. 54 (1), 24 (1947).
  19. Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
  20. Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
  21. Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
  22. Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
  23. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
  24. Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
  25. Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
  26. Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503 (2013).
  27. Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
  28. Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
  29. Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28 (2017).
  30. Chin, C. -Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
  31. Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
  32. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
  33. Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
  34. Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, Clifton, N.J. 39-49 (2017).
  35. Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
  36. Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163 (2014).
  37. Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578 (2012).
  38. Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
  39. Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
  40. Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
  41. Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
  42. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  43. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033 (2013).
  44. Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
  45. Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
  46. Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
  47. Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
  48. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
  49. Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
  50. Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291 (2009).
  51. Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251 (2011).
  52. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315 (2011).
  53. Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
  54. van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
  55. Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
  56. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  57. Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298 (2014).
  58. Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
  59. Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
  60. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  61. Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  62. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).

Tags

Biyoloji Sayı 161 transposon yüksek iş bölümü Gram-negatif Acinetobacter baumannii kolistin ESKAPE
Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter