Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Zusammenfassung

CRISPR/Cas9 wird zunehmend zur Charakterisierung der Genfunktion in Nicht-Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Knock-out-Linien von Culex pipienserzeugt, von der Vorbereitung von Injektionsmischungen über die Gewinnung und Injektion von Moskitoembryonen bis hin zur Aufzucht, Kreuzung und dem Screening injizierter Moskitos und ihrer Nachkommen auf gewünschte Mutationen.

Zusammenfassung

Culex-Moskitos sind die Hauptvektoren mehrerer Krankheiten, die sich negativ auf die Gesundheit von Mensch und Tier auswirken, einschließlich west-Nil-Virus und Krankheiten, die durch filariale Nematoden wie Hundeherzwurm und Elefantenasis verursacht werden. Vor kurzem wurde CRISPR / Cas9-Genom-Editing verwendet, um ortsgerichtete Mutationen zu induzieren, indem ein Cas9-Protein, das mit einer Leit-RNA (gRNA) komplexiert wurde, in frisch gelegte Embryonen mehrerer Insektenarten injiziert wurde, einschließlich Moskitos, die zu den Gattungen Anopheles und Aedesgehören. Die Manipulation und Injektion von Culex-Moskitos ist etwas schwieriger, da diese Moskitos ihre Eier aufrecht in Flößen ablegen und nicht einzeln wie andere Mückenarten. Hier beschreiben wir, wie man gRNAs entwirft, sie mit Cas9-Protein komplexiert, weibliche Moskitos von Culex pipiens dazu bringt, Eier zu legen, und wie man neu gelegte Embryonen für die Mikroinjektion mit Cas9 / gRNA vorbereitet und injiziert. Wir beschreiben auch, wie man injizierte Moskitos auf die gewünschte Mutation rückt und abschirmt. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass diese Technik verwendet werden kann, um ortsgerichtete Mutationen im Genom von Culex-Moskitos zu induzieren und mit leichten Modifikationen auch bei anderen Mückenarten Nullmutanten zu erzeugen.

Einleitung

Culex-Moskitos sind in den gemäßigten und tropischen Regionen der Welt verbreitet und übertragen mehrere tödliche Viren, darunter West-Nil-Virus^1,St. Louis-Enzephalitis² sowie filariale Nematoden, die Hundeherzwurm³ und Elephantiasis⁴verursachen. Mitglieder des Culex pipiens-Komplexes, zu dem Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens und Cx. pipiens molestusgehören , zeigen auffällige Variationen in vielen Aspekten ihrer Biologie. Zum Beispiel, während Cx. quinquefasciatus und Cx. pipiens molestus nicht....

Protokoll

In den meisten Forschungseinrichtungen muss ein genehmigtes Biosicherheitsprotokoll vorhanden sein, bevor transgene Insekten erzeugt oder gepflegt werden, um sicherzustellen, dass genetisch veränderte Organismen nicht entweichen oder aus der Laboreinrichtung entfernt werden. Möglicherweise gelten auch zusätzliche staatliche Vorschriften. Bevor Sie ein Projekt dieser Art beginnen, überprüfen Sie alle institutionellen Richtlinien und Verfahren, um festzustellen, welche Dokumente und Genehmigungen erforderlich sind.

1. Entwicklung von gRNAs und Herstellung von Injektionsmischungen

1. Entwerfen Sie 2-5 gRNAs für jedes Zi....

Ergebnisse

Mit dem beschriebenen Protokoll konnten wir erfolgreich Embryonen von Cx. pipiensinjizieren und beobachteten eine hohe Überlebensrate unter den injizierten Embryonen (~ 55%, Abbildung 1). Frühere Studien hatten einen geringeren Prozentsatz des Überlebens, wahrscheinlich, weil der vordere Teil des Eifollikels am medizinischen Verbandsstreifen befestigt war, was verhinderte, dass Mückenlarven aus dem Chorion entweichen und erfolgreich ins Wasser schwammen. Die Sicherstellung, dass sic.......

Diskussion

Dieses Protokoll stellt Methoden vor, um spezifische Mutationen in das Genom von Culex-Moskitos einzuführen und kann verwendet werden, um auch das Genom anderer Moskitos zu bearbeiten. Das Protokoll ist insoweit von Bedeutung, als es nicht nur spezifische Details zur Vorbereitung der Injektionsmaterialien enthält, sondern auch einen detaillierten Videoüberblick darüber, wie Moskitos dazu veranlasst werden, Eier zu legen, sowie wie diese Eier zubereitet und injiziert werden. Wir fassen auch zusammen, wie man die.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Künstliche Membranzuführung	Hemotek	SP5W1-3	Firmenstandort: Blackburn, UK
ATP	Invitrogen	18330019	Firmenstandort: Carlsbad, CA, USA
Borosilikatglas Mirokapillarrohre, 1 mm Außendurchmesser	World Precision Instruments	1B100-6	Firmenstandort: Sarasota, FL, USA
BV10 Nadelanfaser	Sutter Instruments	BV-10-B	Firmenstandort: Nobato, CA, USA
Whatman Zirkuläres Filterpapier (12,5 cm)	Sigma Aldrich	WHA1001125	Firmenstandort: St. Louis, MO, USA
Konisches Rohr (50 mL)	Thermo Fisher Scientific	339652	Firmenstandort: Waltham, MA, USA
Fisherbrand Kursfilterpapier mit schneller Durchflussrate	Thermo Fisher Scientific	09-800	Firmenstandort: Waltham, MA, USA
Deckglas (24 x 40 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	Firmenstandort: Waltham, MA, USA
Kofferdam	Henry Schein Inc	1010171	Firmenstandort: Melville, NY
USA Scotch doppelseitiges Klebeband	Thermo Fisher Scientific	NC0879005	Unternehmensstandort: Waltham, MA, USA
FemtoJet 4i Mikroinjektor	Eppendorf	5252000021	Unternehmensstandort: Hamburg, Deutschland
Glasfläschchen (2 dram)	Thermo Fisher Scientific	033401C	Firmenstandort: Waltham, MA, USA
Halogenkohlenwasserstofföl	Sigma Aldrich	H8898-50ML	Firmenstandort: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle Puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Firmenstandort: Nobato, CA, USA
Parafilm	Thermo Fisher Scientific	50-998-944	Firmenstandort: Waltham, MA, USA
PC-100 Weighted Needle Puller	Narishige	PC-100	Dies ist kompatibel mit dem früheren PC-10-Modell, das eingestellt wurde. Firmenstandort: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F140WH	Firmenstandort: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%)	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	Firmenstandort: Waltham, MA, USA
Quarzglas Mirokapillarrohre, 1 mm Außendurchmesser	Kapillarrohr Lieferungen Limited	QGCT 1.0	Firmenstandort: Cornwall, UK
Guide-it&Handel; sgRNA-Screening-Kit	Takara, Bio USA	632639	Mit diesem Kit können Sie feststellen, ob gRNAs DNA-Sequenzen in vitro schneiden. Firmenstandort: Mountain View, CA, USA
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Firmenstandort: St. Louis, MO, USA
Kleine Petrischalen (35X10 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-190-0273	Firmenstandort: Waltham, MA, USA
Natriumcitrat Hühnerblut	Lampire Biologika	7201406	Firmenstandort: Everett, PA, USA
Fisherbrand Quadratische Petrischale (10 cm x 10 cm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875711A	Unternehmen Standort: Waltham, MA, USA
Tegaderm	Henry Schein Inc.	7771180	Firmenstandort: Melville, NY USA
Tropisches Fischfutter	Tetramin N	/A
Whatman Filterpapier	Thermo Fisher Scientific	09-927-826	Firmenstandort: Waltham, MA, USA
Whatman Filterpapier, 4,25 cm	Sigma Aldrich	1001-042	Firmenstandort: St. Louis, MO, USA