Methodenartikel

Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

DOI:

10.3791/61662

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6. Oktober 2020

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1Brudnick Neuropsychiatric Research Institute, Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School, 2Interdisciplinary Graduate Program, University of Massachusetts Medical School, 3UMMS MD/PhD Program, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.

Zusammenfassung

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Die Elektroporation hat sich als kritische Methode etabliert, um bestimmte Gene in Zellen zu übertragen, um ihre Funktion zu verstehen. Hier beschreiben wir eine Einzelzell-Elektroporationstechnik, die die Effizienz (~ 80%) der In-vitro-Gentransfektion in exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen in organotypischer Hippocampus-Slice-Kultur von Mäusen maximiert. Mit großen Glaselektroden, Tetrodotoxin-haltiger künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit und milden elektrischen Impulsen lieferten wir ein interessantes Gen in kultivierte Hippocampus-CA1-Pyramidenneuronen und inhibitorische Interneuronen. Darüber hinaus konnte die Elektroporation in kultivierten Hippocampus-Scheiben bis zu 21 Tage in vitro ohne Verringerung der Transfektionseffizienz durchgeführt werden, was die Untersuchung unterschiedlicher Entwicklungsstadien der Scheibenkultur ermöglichte. Mit wachsendem Interesse an der Untersuchung der molekularen Funktionen von Genen in einer Vielzahl von Zelltypen zeigt unsere Methode einen zuverlässigen und unkomplizierten Ansatz für die In-vitro-Gentransfektion im Gehirngewebe von Mäusen, der mit vorhandenen elektrophysiologischen Geräten und Techniken durchgeführt werden kann.

Einleitung

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In der Molekularbiologie ist eine der wichtigsten Überlegungen für einen Forscher, wie man ein Gen von Interesse in eine Zelle oder Zellpopulation liefert, um seine Funktion aufzuklären. Die verschiedenen Verabreichungsmethoden können entweder als biologisch (z. B. ein viraler Vektor), chemisch (z. B. Calciumphosphat oder Lipid) oder physikalisch (z. B. Elektroporation, Mikroinjektion oder Biolistik)1,2kategorisiert werden. Biologische Methoden sind hocheffizient und können zelltypspezifisch sein, sind aber durch die Entwicklung spezifischer genetischer Werkzeuge begrenzt. Chemische Ansätze sind in vitro sehr ....

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Protokoll

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Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Massachusetts Medical School überprüft und genehmigt. Scheibenkulturvorbereitung, Plasmidvorbereitung und Elektroporation sind ebenfalls in unseren zuvor veröffentlichten Methoden detailliert beschrieben und können für zusätzliche Informationen10erwähnt werden.

1. Zubereitung der Scheibenkultur

  1. Bereiten Sie organotypische Hippocampus-Scheibenkulturen der Maus wie zuvor beschrieben11vor, wobei postnatale 6 bis 7 Tage alte Mäuse beiderlei Geschlechts verwendet werden.
    1. Präparierm....

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Ergebnisse

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Unsere Einzelzellelektroporation ist in der Lage, Gene präzise in visuell identifizierte exzitatorische und hemmende Neuronen zu liefern. Wir haben drei verschiedene neuronale Zelltypen zu drei verschiedenen Zeitpunkten elektroporiert. Parvalbumin (Pv) oder vesikuläre Glutamat Typ 3 (VGT3) exprimierende Neuronen wurden visualisiert, indem Pvcre (JAX #008069) oder VGT3cre (JAX #018147) Linien mit TdTomato (eine Variante des rot fluoreszierenden Proteins) Reporterlinie (Jax #007905) überquert wurden, .......

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Diskussion

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Wir beschreiben hier eine Elektroporationsmethode, die sowohl exzitatorische als auch hemmende Neuronen mit hoher Effizienz und Präzision transfiziert. Unser optimiertes Elektroporationsprotokoll verfügt über drei innovative Durchbrüche, um eine hocheffiziente Gentransfektion zu erreichen. Unsere erste Modifikation bestand darin, die Pipettengröße im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten Protokollen3,5,6zuerhöhen. Diese Veränd.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von National Institutes of Health Grants (R01NS085215 bis K.F., T32 GM107000 und F30MH122146 bis A.C.) unterstützt. Die Autoren danken Frau Naoe Watanabe für die geschickte technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Plasmidaufbereitung
Plasmid-AufreinigungskitQiagen12362
Organotypische Schnittkulturvorbereitung
6 Well PlattenGREINER BIO-ONE657160
Dumont #5/45 PinzetteFST#5/45Abgewinkelte Dissektionszange für die organotypische Herstellung von Schnittkulturen
KolbenfiltereinheitMilliporeSCHVU02REFiltration und Lagerung von Nährmedien
InkubatorBinderBD C150-UL
McIlwain Tissue ChopperTED PELLA, INC.10180Gewebezerkleinerer für die organotypische Schnittkulturvorbereitung
Millicell Zellkultureinsatz, 30 mmMilliporePIHP03050Organotypische Schnittkultureinsätze
OsmometerPrecision SystemsOSMETTE II
PTFE beschichtete SpachtelCole-ParmerSK-06369-11
SchereFST14958-09
Stereo MikroskopOlympusSZ61
Steriles VakuumfiltrationssystemMilliporeSCGPT01REFiltration und Lagerung von aCSF
Elektrodenvorbereitung
KapillargläsernWarner Instruments640796
MikropipettenabzieherSutter InstrumentP-1000Puller
Oven BinderBD (E2)
Puller FilamentSutter InstrumentFB330BPuller
Einzelzell-Elektroporation und Fluoreszenzbildgebung #1
3,5 mm Falcon PetrischalenBD Falcon353001
AirtableTMC63-7512E
CCD-KameraQ ImagingRetiga-2000DCKamera
ElektroporationssystemMolecular DevicesAxoporator 800AElektroporator
FluoreszenzbeleuchtungssystemPriorLumen 200
ManipulatorSutter InstrumentMPC-385Manipulator
Metamorph SoftwareMolekulare BauelementeBilderfassung
SchlauchpumpeRaininDynamax, RP-2Perfusionspumpe
SchalttischLuigs & Neuman240 XY-Lautsprecher
UnbekanntLautsprecher, die an den Elektroporator angeschlossen
sind StereomikroskopOlympusSZ30
Tisch-InkubatorThermo ScientificMIDI 40
Aufrechte MikroskopieOlympusBX61WI
strong>Fluoreszenz Bildgebung #2
All-in-One-FluoreszenzmikroskopKeyenceBZ-X710
<

Referenzen

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  1. Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
  2. Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22....

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Schlagwörter

Hippocampale Neuronen der MausGentransfektionexzitatorische und inhibitorische NeuronenGlaselektrodentechnikTetrodotoxin ACSFElektroporationskammerPressure Cycling MethodeCA1 Pyramidenneuronen

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