Summary
Presenteras här är ett protokoll för encellig elektroporering som kan leverera gener i både excitatoriska och hämmande nervceller över en rad in vitro hippocampal slice kultur åldrar. Vårt tillvägagångssätt ger ett exakt och effektivt uttryck för gener i enskilda celler, som kan användas för att undersöka cellautonoma och intercellulära funktioner.
Abstract
Elektroporering har etablerat sig som en kritisk metod för att överföra specifika gener till celler för att förstå deras funktion. Här beskriver vi en encellig elektroporationsteknik som maximerar effektiviteten (~ 80%) av in vitro gentransfektion i excitatoriska och klassspecifika hämmande nervceller i mus organotypiska hippocampal skiva kultur. Med hjälp av stora glaselektroder, tetrodotoxininnehållande konstgjord cerebrospinalvätska och milda elektriska pulser levererade vi en gen av intresse till odlade hippocampal CA1 pyramidala nervceller och hämmande interneuroner. Dessutom kunde elektroporation utföras i odlade hippocampal skivor upp till 21 dagar in vitro utan minskning av transfection effektivitet, vilket möjliggör studier av olika skiva kultur utvecklingsstadier. Med intresse för att undersöka geners molekylära funktioner över ett brett spektrum av celltyper visar vår metod en pålitlig och enkel inställning till in vitro-gentransfektion i mushjärnvävnad som kan utföras med befintlig elektrofysiologiutrustning och tekniker.
Introduction
Inom molekylärbiologi är en av de viktigaste övervägandena för en prövare hur man levererar en gen av intresse till en cell eller population av celler för att klargöra dess funktion. De olika leveransmetoderna kan kategoriseras som antingen biologiska (t.ex. en virusvektor), kemiska (t.ex. kalciumfosfat eller lipider) eller fysiska (t.ex. elektroporation, mikroinjektion eller biolistik)1,2. Biologiska metoder är mycket effektiva och kan vara celltypspecifika men begränsas av utvecklingen av specifika genetiska verktyg. Kemiska metoder är mycket kraftfulla in vitro, men transfektioner är i allmänhet slumpmässiga; Dessutom är dessa metoder mestadels reserverade endast för primära celler. Av de fysiska metoderna är biolistik den enklaste och enklaste ur teknisk synvinkel, men producerar återigen slumpmässiga transfection-resultat med relativt låg effektivitet. För applikationer som kräver överföring till specifika celler utan behov av att utveckla genetiska verktyg tittar vi mot encellselektroporation3,4.
Medan elektroporering som används för att endast hänvisa till fältelektroporation, under de senaste tjugo åren, flera in vitro- och in vivo encelliga elektroporeringsprotokoll har utvecklats för att förbättra specificitet ocheffektivitet 5,6,7, vilket visar att elektroporering kan användas för att överföra gener till enskilda celler och kan därför vara extremt exakt. Förfarandena är dock tekniskt krävande, tidskrävande och relativt ineffektiva. Faktum är att nyare artiklar har undersökt genomförbarheten av mekaniserade elektroporationsriggar8,9, vilket kan bidra till att eliminera flera av dessa hinder för utredare som är intresserade av att installera sådan robotteknik. Men för dem som letar efter enklare medel förblir problemen med elektroporering, nämligen celldöd, transfection misslyckande och pipett igensättning, fortfarande ett problem.
Vi utvecklade nyligen en elektroporeringsmetod som använder större tippade glaspipetter, mildare elektriska pulsparametrar och ett unikt tryckcyklingssteg, som genererade en mycket högre transfektionseffektivitet i excitatoriska neuroner än tidigare metoder, och gjorde det möjligt för oss för första gången att transfektera gener i hämmande interneuroner, inklusive somatostatin-uttryckande hämmande interneuroner i hippocampal CA1-regionen av musorganotypisk skivakultur 10. Tillförlitligheten hos denna elektroporation metod i olika hämmande interneuron typer och neuronal utvecklingsmässiga stadier har dock inte åtgärdats. Här visade vi att denna elektroporationsteknik kan överföra gener till både excitatoriska nervceller och olika klasser av interneuroner. Viktigt, transfection effektivitet var hög oavsett dagar in vitro (DIV) skiva kultur ålder testas. Denna etablerade och användarvänliga teknik rekommenderas starkt till alla prövare som är intresserade av att använda encellig elektroporering för olika celltyper i samband med in vitro-mushjärnvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprotokoll granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Massachusetts Medical School. Skiva kulturberedning, plasmidpreparat och elektroporering beskrivs också i våra tidigare publicerade metoder och kan hänvisas till för ytterligare information10.
1. Skiva kulturberedning
- Förbered musorganotypiska hippocampal slice kulturer som tidigare beskrivits11, med postnatala 6- till 7-dagars gamla möss av båda könen.
- Förbered dissekeringsmedier för organotypisk skiva som består av (i mM): 238 sackaros, 2,5 KCl, 1 CaCl2,4 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4och 11 glukos i avjoniserat vatten, sedan gas med 5% CO2/95% O2 till ett pH på 7,4.
- Förbered organotypiska skiva kulturmedier bestående av: 78,8% (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, 20% (v/v) hästserum, 17,9 mM NaHCO3,26,6 mM glukos, 2 M CaCl2,2 M MgSO4,30 mM HEPES, insulin (1 μg/ml) och 0,06 mM askorbinsyra, pH justerat till 7,3. Justera osmolariteten till 310-330 osmol med hjälp av en osmometer.
- Dissekera hippocampi ut från hela hjärnan med hjälp av två spatlar och skiva (400 μm) med hjälp av en vävnadshacker. Separera skivorna med hjälp av två tångar och överför till 30 mm cellkulturinsatser i en 6 brunnsplatta fylld med odlingsmedier (950 μL) under skären.
- Förvara organotypiska segmentkulturer i en inkubator för vävnadskultur (35°C, 5% CO2)och byt skiva kultur media varannan dag.
2. Plasmid beredning
- Förbered plasmiden för genen av intresse.
- Subclone förbättrade gröna fluorescerande protein (EGFP) genen i en pCAG vektor.
- Rena pCAG-EGFP-plasmid med ett endotoxinfritt reningskit och lös upp i en intern lösning som består av dietyllam pyrokarbonatbehandlat vatten som innehåller 140 mM K-metansulfonat. 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2och 10 mM HEPES, justerat till pH 7,3 med KOH (plasmidkoncentration: 0,1 μg/μL).
3. Glaspipettberedning
- Dra borosilikatglaspipetter (4,5 – 8 MΩ) på en mikropipettedragare (Figur 1A).
OBS: De glaspipetter som används för inspelning av plåsterklämmor i hela cellen är idealiska för elektroporering. - Grädda glaspipetter över natten vid 200°C för att sterilisera.
- Kontrollera pipettspetsens storlek under ett dissektionsmikroskop för att approximera det elektriska motståndet.
- Tillval:Kontrollera pipettmotståndet genom att fästa pipetten på elektroporationselektroden och använd mikromanipulatorn för att manövrera pipettspetsen i filtersteriliserad konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) som innehåller (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 och 11 glukos i avjoniserat vatten, gasad med 5% CO2/95% O2 till ett pH på 7,4. Bekräfta det faktiska motståndet med hjälp av avläsningen på elektroporatorn.
OBS: Ju skarpare pipettspetsen är, desto större är det elektriska motståndet. Pipettmotståndet ska vara under 10 MΩ. Glaspipetter med hög pipettbeständighet (Figur 1B) täpper ofta till vid spetsen under upprepad elektroporering.
- Tillval:Kontrollera pipettmotståndet genom att fästa pipetten på elektroporationselektroden och använd mikromanipulatorn för att manövrera pipettspetsen i filtersteriliserad konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) som innehåller (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 och 11 glukos i avjoniserat vatten, gasad med 5% CO2/95% O2 till ett pH på 7,4. Bekräfta det faktiska motståndet med hjälp av avläsningen på elektroporatorn.
4. Installation av elektroporeringsrigg
- Installera elektroporatorn på en vanlig helcellig elektrofysiologirigg, utrustad med ett upprätt mikroskop monterat på ett skiftande bord med en mikromanipulator och peristaltisk pump.
- Montera elektroporatorns huvudsteg på en mikromanipulator och anslut ett par högtalare till elektroporatorn. Anslut elektroporatorn till en fotpedal som kan användas för att skicka en puls när den är klar.
OBS: Högtalarna avger en ton när den är påst, vilket är en indikator på elektrodens elektriska motstånd. Detta gör det möjligt att bestämma relativa förändringar i motståndet utan att dra uppmärksamheten bort från proceduren.
5. Elektroporeringspreparat
- Överför skärkulturinsatser från 6 brunnstallrikar till 3 cm Petri-rätter laddade med 900 μL odlingsmedier och förvara i en bordsskiva CO 2-inkubator tills de är redo att utföra elektroporering.
- Förinkubera färska odlingsinsatser med skiva odlingsmedier (1 ml) i minst 30 min i en 3,5 cm Petriskål till kulturskivor efter elektroporering.
- Rengör och förbered riggen för elektroporering.
- Granska linjerna med 10% blekmedel i 5 minuter för att sterilisera slangen och kammaren innan du börjar experimentet för dagen.
- Granska linjerna med avjoniserat autoklaverat vatten i minst 30 minuter för att skölja helt.
- Granska linjerna med filtersteriliserat aCSF som innehåller 0,001 mM tetrodotoxin (TTX).
OBS: TTX minimerar cellulär toxicitet och död på grund av överexcitation av interneurons10.
- Ställ in elektroporatorns pulsparametrar: amplitud på –5 V, kvadratpuls, tåg på 500 ms, frekvens på 50 Hz och en pulsbredd på 500 μs.
- Fyll glaspipetten med 5 μL plasmidhaltig intern lösning.
- Ta bort eventuella instängda luftbubblor från pipettspetsen genom att snärta och knacka försiktigt på spetsen flera gånger.
- Kontrollera att spetsen är skadad genom att visualisera den under ett dissekeringsmikroskop eller genom att upprepa steg 3.3.1 för att kontrollera pipettmotståndet.
OBS: Om spetsen är skadad måste glaspipetten kasseras och detta steg måste upprepas med en ny glaspipett som tidigare förberetts i steg 3.
- Fäst pipettspetsen ordentligt på elektroden och sätt på högtalarna. Spela in elektroporatorns avläsning (pipettens motstånd) när spetsen har kommit i kontakt med aCSF-mediet.
- Skär odlingsinsatsmembranet med ett vasst blad och isolera en skiva kultur. Överför försiktigt skärkulturen till elektroporeringskammaren genom att använda vassa vinklade tångar och fixera dess position med ett skivankare.
- Håll inte skivan utanför inkubatorn i mer än 30 minuter åt gången för att förhindra biverkningar såsom förändringar i neuronal hälsa eller funktion12.
6. Elektroporatceller av intresse
- Applicera positivt tryck på pipetten med munnen eller genom att använda en 1 ml spruta (0,2 - 0,5 ml tryck) fäst vid slangen.
- Använd mikromanipulatorns 3-dimensionella rattkontroller för att manövrera pipettspetsen nära skivans yta.
- Välj en målcell och närma dig den, håll det positiva trycket applicerat tills en dimple bildas på cellytan, synlig på mikroskopet.
- Utför tryckcykler.
- Applicera snabbt milt undertryck genom munnen så att en lös tätning bildas mellan pipettspetsen och plasmamembranet, som indikeras visuellt av membranet som går upp i pipettspetsen något. Observera en ökning (~ 2,5x det ursprungliga motståndet) i pipettmotståndet genom att lyssna efter en ökning av tonen som kommer från högtalarna. Applicera snabbt positivt tryck igen så att dimple bildas igen.
- Slutför omedelbart minst två tryckcykler till utan paus och håll sedan undertrycket i 1 s.
OBS: Paus mellan cykler, tryck eller att hålla undertrycket för länge kan orsaka betydande cellskador och eventuellt orsaka att cellen dör under elektroporering.
- Pulsera snabbt elektroporatorn en gång med fotpedalen när tonen från högtalarna når en stabil topp i tonhöjd, vilket indikerar topp elektrisk resistans. Vänta inte vid toppmotståndet i mer än 1 s innan du skickar pulsen.
OBS: Vi har inte observerat någon off-target elektroporering när du använder detta protokoll10. Endast de celler som kom i kontakt med glaspipetten under tryckcyklerna transfekterades. Positionering av pipetten nära andra nervceller resulterar inte i gentransfektion. - Dra försiktigt tillbaka pipetten cirka 100 μm från cellen utan att trycka.
- Applicera positivt tryck igen och kontrollera att motståndet liknar den inspelade avläsningen i steg 5.5 och närma dig sedan nästa cell.
- Avlägsna potentiella träskor, som indikeras visuellt eller med en signifikant ökad (>15% högre) pipettbeständighet efter elektroporering, genom att applicera positivt tryck.
OBS: Om det inte finns någon synlig träsko och motståndet fortfarande är betydligt högre, kassera pipetten och använd en ny. I genomsnitt kan en pipett användas för upp till 20 elektroporeringshändelser om användaren är försiktig10.
- Avlägsna potentiella träskor, som indikeras visuellt eller med en signifikant ökad (>15% högre) pipettbeständighet efter elektroporering, genom att applicera positivt tryck.
- Efter elektroporering, överför skivakulturen till en ny odlingsinsats och inkubera vid 35 °C i inkubatorn i upp till 3 dagar.
7. Fixering, färgning och avbildning av organotypiska hippocampal slice kulturer
- Fixera elektroporerade organotypiska skivor kulturer 2 – 3 dagar efter transfection med 4% paraformaldehyd och 4% sackaros i 0,01 M fosfat buffrad saltlösning (1x PBS) i 1,5 h vid rumstemperatur.
- Ta bort fixativa och inkubera skivor i 30% sackaros i 0,1 M fosfatbuffert (1x PB) i 2 timmar.
- Placera skivor på ett glidglas och frys dem genom att lägga glidglaset ovanpå krossad torris. Tina skivorna vid rumstemperatur och överför dem till en 6 brunnsplatta fylld med 1x PBS.
- Färga skivorna med mus anti-GFP och kanin anti-RFP antikroppar i GDB buffert (0,1% gelatin, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl och 32% 1x PB, pH 7,4) för 2 h vid rumstemperatur.
- Tvätta skivor med 1x PBS tre gånger vid rumstemperatur i 10 min varje tvätt.
- Inkubera skivor med antimus Alexa 488-konjugerad sekundär antikropp och antikanin Alexa 594-konjugerad sekundär antikropp i GDB-buffert i 1 h vid rumstemperatur. Inkubera skivor med DAPI (4 μg/ml) i 1x PBS i 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta skivor med 1x PBS tre gånger vid rumstemperatur i 3 min varje tvätt.
- Montera skivor på glasrutschbanor med monteringsmedium och utför fluorescensavbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår encelliga elektroporation kan exakt leverera gener till visuellt identifierade excitatoriska och hämmande nervceller. Vi elektroporerade tre olika neuronala celltyper vid tre olika tidpunkter. Parvalbumin (Pv) eller vesicular glutamat typ 3 (VGT3) uttrycker nervceller visualiserades genom att korsa Pvcre (JAX #008069) eller VGT3cre (JAX #018147) linjer med TdTomato (en variant av röda fluorescerande protein) reporter linje (Jax #007905), respektive heter Pv /TdTomato och VGT3/TdTomato linjer. Organotypiska skiva kulturer var beredda från C57BL/6J, Pv/TdTomato och VGT3/TdTomato möss.
Först utfördes elektroporation i CA1 pyramidala nervceller (Py) vid antingen 7, 14 eller 21 dagar in vitro (DIV). EGFP transfecteds in i 5-20 pyramidal neurons i hippocampal CA1 område över dessa skiva kultur åldrar (Figur 2B-D). CA1 pyramidala nervceller identifierades med differential interferens kontrast (DIC). För att påvisa anatomisk fördelning och morfologiska skillnader mellan pyramidala nervceller och hämmande interneuroner i skiva kultur, CA1 pyramidal nervceller var elektroporerade med EGFP i en DIV7 Pv/TdTomato mus och nukleära motståning utfördes för att visa den distinkta platsen för EGFP-positiva nervceller i CA1 pyramidal cell lager (Figur 2A).
Därefter tillämpades detta protokoll också på TdTomato-positiva Pv och VGT3 interneurons. EGFP elektroporation utfördes i 1-10 fluorescerande märkta interneurons. TdTomato-positiva Pv (Figur 3) och VGT3 (Figur 4) nervceller var framgångsrikt elektroporerade i hippocampal CA1 området. Intressant nog påverkades transfection av EGFP genen av intresse i alla dessa hämmande neuronal typer inte signifikant av DIV och skilde sig inte med transfection effektivitet (~ 80%) observeras i CA1 pyramidala nervceller (Figur 5).
Bild 1: Två representativa glaspipettbilder.
(A) Visa pipetter med lägre motstånd (6,5 MΩ), som används i detta protokoll,och ( B) högre motståndspipetter (10,4 MΩ) som är typiska för elektroporeringsprotokoll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Organotypiska hippocampal slice kulturer var elektroporerade med EGFP (grön) vid tre olika tidpunkter.
A)Representativ organotypisk hippocampal skiva kultur i en DIV7 Pv/TdTomato mus. CA1 pyramidala nervceller var elektroporerade med EGFP (gröna, vita pilspetsar) och visade ingen överlappning med TdTomato (TdT)-positiva Pv interneurons (röda, gula pilspetsar). DAPI kärn- counterstaining (blått) utfördes. DG: dentate gyrus. (B-D) CA1 pyramidala nervceller var elektroporerade med EGFP vid tre olika tidpunkter: (B) DIV7, (C) DIV14 och (D) DIV21. Organotypiska skiva kulturer var fasta med 4% sackaros, 4% paraformaldehyd/ 1x PBS och avbildas utan ytterligare sektionering. Övre vänstra, låga förstoringsbilder av hippocampal CA1-området. Pilspetsar representerar enskilda CA1 pyramidala nervceller riktade mot elektroporation. Transfekterade nervceller med gula pilspetsar zoomas in i de nedre panelerna. Vita pilspetsar betecknar ytterligare elektroporerade nervceller utanför den höga förstoringsvyn. Övre högra, låg förstoring bilder av överlagrade (Sup) fluorescerande och Nomarski bilder. Skalstänger: 500, 50, 100 respektive 20 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Pv/TdTomato organotypiska hippocampal slice kulturer var elektroporerade med EGFP (grön) vid tre olika tidpunkter.
A)DIV7,B)DIV14 ochC)DIV21. Överlappning med Pv-märkta TdTomato (TdT)-positiva celler (röd) observerades i hippocampal CA1 pyramidal cell lager och oriens. I de låga förstorings insets (översta raden), representerar gula pilspetsar enskilda Pv interneurons riktade mot elektroporation. Vita pilspetsar betecknar ytterligare TdTomato-positiva Pv interneurons elektroporerade utanför den höga förstoringsvyn. Skalstänger: 50, 20 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: VGT3/TdTomato organotypiska hippocampal slice kulturer var elektroporerade med EGFP (grön) vid tre olika tidpunkter.
A)DIV7,B)DIV14 ochC)DIV21. Överlappning med VGT3-märkta TdTomato (TdT)-positiva celler (röd) observerades i hippocampal CA1 pyramidal cell lager och oriens. I de låga förstorings insets (översta raden), gula pilspetsar representerar enskilda VGT3 interneurons riktade för elektroporation. Vita pilspetsar betecknar ytterligare TdTomato-positiva VGT3 interneurons elektroporerade utanför den höga förstoringsvyn. Skalstänger: 50, 20 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Jämförbara nivåer av transfection effektivitet i CA1 pyramidala nervceller, Pv/TdTomato och VGT3/TdTomato interneurons vid tre olika in vitro skiva kultur åldrar.
Sammanfattningsfältgrafer för tre olika segmentkulturålder: DIV7 (vänster), DIV14 (mitten) och DIV21 (höger). Varje symbol representerar den transfection effektivitet som erhålls från en organotypisk skiva kultur CA1 Py: DIV7 (12 skiva kulturer från 2 möss), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); Pv: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). Enkelvägs ANOVA; (inte signifikant). Data som visas är ± SEM. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver här en elektroporeringsmetod som transfektar både excitatoriska och hämmande nervceller med hög effektivitet och precision. Vårt optimerade elektroporationsprotokoll har tre innovativa genombrott för att uppnå högeffektiv gentransfection. Vår första ändring var att öka pipettstorleken jämfört med tidigare publicerade protokoll3,5,6. Denna förändring gjorde det möjligt för oss att elektroporera många nervceller utan pipett igensättning. Dessutom är det möjligt att de lägre motståndspipetterna möjliggör användning av mildare elektriska pulsparametrar jämfört med tidigare metoder samtidigt som önskat resultatuppnåddes 3. Därefter minskade upprepade tryckcykling före elektroporation markantcelldöden 10. Vi observerade ofta att med tillämpning av en enda puls av undertryck innan elektroporerande, plasmamembran fastnat på insidan av pipettspetsen, skadar cellen. Tryckcyklerna hjälpte mycket mindre plasmamembran att hålla sig till pipetten, vilket förbättrade cellöverlevnaden och återhämtningen under proceduren10. Slutligen förbättrade tillsatsen av TTX i aCSF avsevärt framgången för elektroporering i hämmande nervceller10. Vi anser att elektroporering kan orsaka dödlig cell överexcitation som kan förhindras av TTX. Framför allt erbjuder dessa kritiska förbättringar anmärkningsvärt höga framgångsgrader inom elektroporering till både excitatoriska och hämmande nervceller (figur 5). Även om vi hittade inga elektrofysiologiska avvikelser i våra nervceller efter transfection meddenna metod 10 i de riktade cellerna, har det rapporterats att lokala pH förändringar under elektroporation minskar cell livskraft och optimering av elektroporation parametrar kan vara relativt svårt jämfört med andra gen transfectionmetoder 13,14. Därför är det viktigt att överväga oförutsedda biverkningar av elektroporering och att optimera de elektriska parametrarna efter behov för att uppnå en hög transfection effektivitet för varje specifik applikation.
Mikroinjektionsteknik har också använts som ett kraftfullt tillvägagångssätt för att leverera transgener tillcellerna 2,15,16. Detta tillvägagångssätt ger dock i allmänhet ett lägre utbyte av transfection och kräver en hög nivå av skicklighet. Däremot kan vår metod användas relativt enkelt och till minimal kostnad för laboratorier som rutinmässigt utför helcellselektrofysiologiska studier.
Nyligen visade vi att flera gener kan överföras till både excitatoriska och somatostatin uttrycker hämmande nervceller utan biverkningar på elektrofysiologiska egenskaper10. I denna studie visar vi att denna elektroporeringsmetod är mycket effektiv i CA1 pyramidala nervceller (figur 2) och Pv (Figur 3) och VGT3 (Figur 4) hämmande interneuroner. Dessutom tillåter denna elektroporationsteknik oss att transfekter gener av intresse med en ~ 80% framgångsgrad oavsett celltyp eller antal dagar in vitro (Figur 5). Även om tekniken endast har testats in vitro, organotypiska hippocampal skiva kulturer vid samma DIV tidpunkter vi testade har visat sig följa ålder-matchade in vivo synaptic morfologi och aktivitet, som ses i akut beredda hippocampal skivor17. Dessutom, eftersom vi bara har testat denna metod i hippocampal nervceller, är det möjligt att det kan finnas oväntade utmaningar med att tillämpa denna teknik på nervceller i andra hjärnregioner. Metoden inbjuder till utforskning av gener under organotypisk segmentkulturutveckling där synaptisk överföring och densitet, bland andra egenskaper, förändras över tid.
Detta protokoll är en förbättring jämfört med tidigare etablerade genom att det samtidigt är lågkostnads- och mindre tekniskt utmanande och effektivare när det gäller att generera transfekt5,6,7,8,9. Det verkar också vara en förbättring jämfört med tidigare metoder när det gäller lägre frekvenser av cellskador eller död, eftersom vi observerade att ~ 80% av cellerna framgångsrikt transfekterades och friska efter proceduren. Denna metod ger därför en ny möjlighet att undersöka genernas roller i flera neuronala celltyper med hjälp av fluorescerande musmodeller. Framtida studier med denna metod kan fokusera på proteinproteininteraktioner mellan celler för att undersöka specifika molekylära eller fysiologiska funktioner, inklusive transsynaptiska proteininteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants (R01NS085215 till K.F., T32 GM107000 och F30MH122146 till A.C.). Författarna tackar Ms. Naoe Watanabe för skicklig teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A.
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F.
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).
