Summary
Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.
Abstract
La electroporación se ha establecido como un método crítico para transferir genes específicos a las células para entender su función. Aquí, se describe una técnica de electroporación unicelular que maximiza la eficiencia (~ 80%) de la transfección genética in vitro en las neuronas inhibitorias excitatorias y específicas de la clase en el cultivo organotípico de la rebanada del hipocampo de ratón. Usando los electrodos de cristal grandes, el líquido cerebroespinal artificial tetrodotoxina-que contenía y los pulsos eléctricos suaves, entregamos un gene del interés en las neuronas piramidales hippocampal cultivadas CA1 y las interneuronas inhibitorias. Por otra parte, la electroporación podría llevarse a cabo en rodajas de hipocampo cultivadas hasta 21 días in vitro sin reducción en la eficiencia de transfección, lo que permite el estudio de diferentes etapas de desarrollo del cultivo en rodajas. Con el creciente interés en examinar las funciones moleculares de los genes a través de una amplia gama de tipos de células, nuestro método demuestra un enfoque confiable y sencillo para la transfección de genes in vitro en el tejido cerebral de ratón que se puede realizar con el equipo y las técnicas de electrofisiología existentes.
Introduction
En biología molecular, una de las consideraciones más importantes para un investigador es cómo entregar un gen de interés en una célula o población de células para dilucidar su función. Los diferentes métodos de administración pueden clasificarse como biológicos (por ejemplo, un vector viral), químicos (por ejemplo, fosfato de calcio o lípidos) o físicos (por ejemplo, electroporación, microinyección o biolística)1,2. Los métodos biológicos son altamente eficientes y pueden ser específicos del tipo celular, pero están limitados por el desarrollo de herramientas genéticas específicas. Los enfoques químicos son muy potentes in vitro, pero las transfecciones son generalmente aleatorias; además, estos enfoques se reservan principalmente para las células primarias solamente. De los enfoques físicos, la biolística es la más simple y fácil desde un punto de vista técnico, pero de nuevo produce resultados de transfección aleatoria con una eficiencia relativamente baja. Para aplicaciones que requieren transferencia a células específicas sin necesidad de desarrollar herramientas genéticas, miramos hacia la electroporación unicelular3,4.
Mientras que la electroporación solía referirse únicamente a la electroporación de campo, en los últimos veinte años se han desarrollado múltiples protocolos de electroporación unicelular in vitro e in vivo para mejorar la especificidad y la eficiencia5,6,7,demostrando que la electroporación puede utilizarse para transferir genes a células individuales y, por lo tanto, puede ser extremadamente precisa. Sin embargo, los procedimientos son técnicamente exigentes, lentos y relativamente ineficientes. De hecho, artículos más recientes han investigado la viabilidad de las plataformas de electroporación mecanizadas8,9,que pueden ayudar a eliminar varias de estas barreras para los investigadores interesados en instalar dicha robótica. Pero para aquellos que buscan medios más simples, los problemas con la electroporación, a saber, la muerte celular, la falla de transfección y la obstrucción de pipetas, siguen siendo una preocupación.
Recientemente desarrollamos un método de electroporación que utiliza pipetas de vidrio de punta más grande, parámetros de pulso eléctrico más suaves y un paso único de ciclo de presión, que generó una eficiencia de transfección mucho mayor en las neuronas excitatorias que los métodos anteriores, y nos permitió por primera vez transfectar genes en interneuronas inhibitorias, incluidas las interneuronas inhibitorias que expresan somatostatina en la región ca1 hipocampal del cultivo de rebanadas organotípicas de ratón10. Sin embargo, la confiabilidad de este método de electroporación en diferentes tipos de interneurona inhibitoria y etapas de desarrollo neuronales no se ha abordado. Aquí, hemos demostrado que esta técnica de electroporación es capaz de transfectar genes en las neuronas excitatorias y diferentes clases de interneuronas. Es importante destacar que la eficiencia de transfección fue alta, independientemente de los días de edad de cultivo en rodajas in vitro (DIV) probados. Esta técnica establecida y fácil de usar es muy recomendable para cualquier investigador interesado en el uso de electroporación unicelular para diferentes tipos de células en el contexto del tejido cerebral de ratón in vitro.
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Protocol
Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts. La preparación del cultivo en rodajas, la preparación del plásmido y la electroporación también se detallan en nuestros métodos publicados anteriormente y pueden ser referidos para obtener información adicional10.
1. Preparación del cultivo de la rebanada
- Prepare los cultivos organotípicos de la rebanada hippocampal del ratón según lo descritopreviamente 11,usando los ratones postnatales de 6 a 7 días viejos de cualquier sexo.
- Preparar medios de disección para cultivo organotípico en rodajas consistentes en (en mM): 238 sacarosa, 2,5 KCl, 1 CaCl2,4 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2 PO4,y 11 glucosa en agua desionizada, luego gas con 5% deCO2/95%O2 a un pH de 7,4.
- Preparar medios organotípicos de cultivo en rodajas compuestos por: 78,8% (v/v) Mínimo Esencial Medio Águila, 20% (v/v) de suero de caballo, 17,9 mM NaHCO3,26,6 mM de glucosa, 2 M CaCl2,2 M MgSO4,30 mM HEPES, insulina (1 μg/mL), y 0,06 mM de ácido ascórbico, pH ajustado a 7,3. Ajuste la osmolaridad a 310-330 osmol usando un osmómetro.
- Diseccione el hipocampo de todo el cerebro usando dos espátulas, y rebanada (400 μm) usando un helicóptero de tejido. Separe las rebanadas mediante el uso de dos fórceps y transfiera a 30 mm las inserciones de cultivo celular en una placa de 6 pozos llena de medios de cultivo (950 μL) debajo de las inserciones.
- Almacene los cultivos organotípicos en rodajas en una incubadora de cultivos de tejidos (35 °C, 5% deCO2)y cambie el medio de cultivo en rodajas cada dos días.
2. Preparación del plásmido
- Preparar el plásmido para el gen de interés.
- Subclone aumentó el gen de la proteína fluorescente verde (EGFP) en un vector del pCAG.
- Purificar el plásmido pCAG-EGFP con un kit de purificación libre de endotoxinas y disolverlo en una solución interna que consiste en agua tratada con pirocarbonato de dietilo que contiene 140 mM de K-metanosulfonato, 0,2 mM de EGTA, 2 mM de MgCl2y 10 mM de HEPES, ajustada a pH 7,3 con KOH (concentración de plásmido: 0,1 μg/μL).
3. Preparación de pipetas de vidrio
- Tire de pipetas de vidrio de borosilicato (4.5 – 8 MΩ) en un tirador de micropipeta (Figura 1A).
NOTA: Las pipetas de vidrio utilizadas para grabaciones de abrazaderas de parches de celda entera son ideales para la electroporación. - Hornear pipetas de vidrio durante la noche a 200 °C para esterilizar.
- Compruebe el tamaño de la punta de la pipeta bajo un microscopio de disección para aproximarse a la resistencia eléctrica.
- Opcional: Verifique la resistencia de la pipeta uniendo la pipeta al electrodo de electroporación y use el micromanipulador para maniobrar la punta de la pipeta en el líquido cefalorraquídeo artificialesterilizado por filtro (aCSF) que contiene (en mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5MgCl 2, 26 NaHCO3,1 NaH2PO4 y 11 glucosa en agua desionizada, gaseado con 5% de CO2/ 95% O2 a un pH de 7.4. Confirme la resistencia real utilizando la lectura en el electroporador.
NOTA: Cuanto más nítida sea la punta de la pipeta, mayor será la resistencia eléctrica. La resistencia de la pipeta debe estar por debajo de 10 MΩ. Las pipetas de vidrio con alta resistencia a las pipetas(Figura 1B)a menudo se obstruyen en la punta durante la electroporación repetida.
- Opcional: Verifique la resistencia de la pipeta uniendo la pipeta al electrodo de electroporación y use el micromanipulador para maniobrar la punta de la pipeta en el líquido cefalorraquídeo artificialesterilizado por filtro (aCSF) que contiene (en mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5MgCl 2, 26 NaHCO3,1 NaH2PO4 y 11 glucosa en agua desionizada, gaseado con 5% de CO2/ 95% O2 a un pH de 7.4. Confirme la resistencia real utilizando la lectura en el electroporador.
4. Configuración de la plataforma de electroporación
- Instale el electroporador en un equipo de electrofisiología de celda entera estándar, equipado con un microscopio vertical montado en una mesa de cambio con un micromanipulador y una bomba peristáltica.
- Instale el cabezal del electroporador en un micromanipulador y conecte un par de altavoces al electroporador. Conecte el electroporador a un pedal de pie que se puede utilizar para enviar un pulso cuando esté listo.
NOTA: Los altavoces emiten un tono cuando se encienden, que es un indicador de la resistencia eléctrica en el electrodo. Esto permite determinar los cambios relativos en la resistencia sin desviar la atención del procedimiento.
5. Preparación de electroporación
- Transfiera los insertos de cultivo de rebanadas de 6 placas de pozo a placas de Petri de 3 cm cargadas con 900 μL de medios de cultivo y guárdelos en una incubadora de CO2 de mesa hasta que esté listo para realizar la electroporación.
- Preincubar inserciones de cultivo fresco con medios de cultivo en rodajas (1 mL) durante al menos 30 min en una placa de Petri de 3,5 cm para cultivar rodajas después de la electroporación.
- Limpie y prepare la plataforma para la electroporación.
- Perfundir las líneas con 10% de lejía durante 5 minutos para esterilizar el tubo y la cámara antes de comenzar el experimento para el día.
- Perfunda las líneas con agua autoclave desionizada durante al menos 30 minutos para enjuagar completamente.
- Perfunda las líneas con aCSF esterilizado por filtro que contiene 0,001 mM de tetrodotoxina (TTX).
NOTA: TTX minimiza la toxicidad celular y la muerte debido a la sobreexcitación de interneuronas10.
- Establezca los parámetros de pulso del electroporador: amplitud de –5 V, pulso cuadrado, tren de 500 ms, frecuencia de 50 Hz y un ancho de pulso de 500 μs.
- Llene la pipeta de vidrio con 5 μL de solución interna que contenga plásmido.
- Retire las burbujas de aire atrapadas de la punta de la pipeta moviendo y tocando suavemente la punta varias veces.
- Compruebe si hay daños en la punta visualizándolo con un microscopio de disección o repitiendo el paso 3.3.1 para comprobar la resistencia de la pipeta.
NOTA: Si la punta está dañada, la pipeta de vidrio debe desecharse, y este paso debe repetirse con una nueva pipeta de vidrio previamente preparada en el paso 3.
- Acople de forma segura la punta de la pipeta al electrodo y encienda los altavoces. Registre la lectura (la resistencia de la pipeta) del electroporador cuando la punta haya hecho contacto con el medio aCSF.
- Corte la membrana del inserto de cultivo usando una cuchilla afilada y aísle una rebanada. Transfiera cuidadosamente el cultivo de la rebanada a la cámara de electroporación mediante el uso de autorórceps en ángulo agudo y fije su posición con un anclaje de rebanada.
- No mantenga el cultivo en rodajas fuera de la incubadora durante más de 30 minutos a la vez para prevenir efectos secundarios como cambios en la salud neuronal o la función12.
6. Celdas electroporadas de interés
- Aplique presión positiva a la pipeta con la boca o usando una jeringa de 1 ml (0.2 - 0.5 mL de presión) unida a la tubería.
- Utilice los controles de perilla de 3 dimensiones del micromanipulador para maniobrar la punta de la pipeta cerca de la superficie del cultivo de rebanadas.
- Elija una célula diana y acérquese a ella, manteniendo la presión positiva aplicada hasta que se forme un hoyuelo en la superficie celular, visible en el microscopio.
- Realizar ciclos de presión.
- Aplique rápidamente una presión negativa leve por vía oral para que se forme un sello suelto entre la punta de la pipeta y la membrana plasmática, indicado visualmente por la membrana que sube un poco en la punta de la pipeta. Observe un aumento (~ 2.5x la resistencia inicial) en la resistencia de la pipeta escuchando un aumento en el tono proveniente de los altavoces. Vuelva a aplicar rápidamente la presión positiva para que el hoyuelo se vuelva a formar.
- Complete inmediatamente al menos dos ciclos de presión más sin pausar, luego mantenga la presión negativa durante 1 s.
NOTA: Hacer una pausa entre ciclos, aplicar demasiada presión o mantener la presión negativa durante demasiado tiempo puede causar daño celular significativo y posiblemente causar que la celda muera durante la electroporación.
- Pulse rápidamente el electroporador una vez usando el pedal del pie cuando el tono de los altavoces alcanza un ápice estable en el tono, lo que indica una resistencia eléctrica máxima. No espere en la resistencia máxima durante más de 1 s antes de enviar el pulso.
NOTA: No hemos observado electroporación fuera del objetivo cuando se utiliza este protocolo10. Solamente las células en contacto con la pipeta de cristal durante ciclos de la presión fueron transfectadas. Colocar la pipeta cerca de otras neuronas no resulta en la transfección de genes. - Retraiga suavemente la pipeta aproximadamente 100 μm de la célula sin aplicar presión.
- Vuelva a aplicar presión positiva, verificando que la resistencia sea similar a la lectura registrada en el paso 5.5, luego acerque a la siguiente celda.
- Eliminar los zuecos potenciales, indicados visualmente o por una resistencia a la pipeta significativamente mayor (>15% mayor) después de la electroporación, mediante la aplicación de presión positiva.
NOTA: Si no hay obstrucción visible y la resistencia sigue siendo significativamente mayor, deseche la pipeta y utilice una nueva. En promedio, una pipeta se puede utilizar para hasta 20 eventos de electroporación si el usuario tiene cuidado10.
- Eliminar los zuecos potenciales, indicados visualmente o por una resistencia a la pipeta significativamente mayor (>15% mayor) después de la electroporación, mediante la aplicación de presión positiva.
- Después de la electroporación, transfiera el cultivo en rodajas a un inserto de cultivo fresco e incube a 35 °C en la incubadora durante un período de hasta 3 días.
7. Fijación, tinción e imágenes de cultivos organotípicos de rebanadas del hipocampo
- Fijar cultivos organotípicos electroporados en rodajas 2 – 3 días después de la transfección con paraformadehído al 4% y sacarosa al 4% en solución salina tamponada con fosfato de 0,01 M (1x PBS) durante 1,5 h a temperatura ambiente.
- Retirar el fijador e incubar rodajas en sacarosa al 30% en tampón de fosfato de 0,1 M (1x PB) durante 2 h.
- Coloque las rebanadas en un vaso de diapositivas y congele poniendo el vidrio deslizante encima del hielo seco triturado. Descongele las rebanadas a temperatura ambiente y transfiételas a una placa de 6 pocillos llena de 1x PBS.
- Manche las rebanadas con anticuerpos anti-GFP de ratón y anti-RFP de conejo en tampón GDB (gelatina al 0,1%, Tritón X-100 al 0,3%, NaCl de 450 mM y 32% 1x PB, pH 7,4) durante 2 h a temperatura ambiente.
- Lave las rodajas con 1x PBS tres veces a temperatura ambiente durante 10 min cada lavado.
- Incubar rebanadas con anticuerpo secundario conjugado anti-ratón Alexa 488 y anticuerpo secundario conjugado anti-conejo Alexa 594 en tampón GDB durante 1 h a temperatura ambiente. Incubar rodajas con DAPI (4 μg/mL) en 1x PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
- Lavar las rodajas con 1x PBS tres veces a temperatura ambiente durante 3 min cada lavado.
- Monte las rebanadas en las diapositivas de cristal usando el medio de montaje y realice la proyección de imagen de la fluorescencia.
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Representative Results
Nuestra electroporación unicelular es capaz de entregar genes con precisión en neuronas excitatorias e inhibitorias identificadas visualmente. Hemos electroporated tres tipos diferentes de células neuronales en tres puntos de tiempo diferentes. Parvalbumin (Pv) o glutamato vesicular tipo 3 (VGT3) que expresan las neuronas se visualizaron cruzando Pvcre (JAX #008069) o VGT3cre (JAX #018147) líneas con TdTomato (una variante de la proteína fluorescente roja) línea reportero (Jax #007905), respectivamente nombrado Pv / TdTomato y VGT3 / TdTomato líneas. Las culturas organotípicas de la rebanada fueron preparadas de los ratones de C57BL/6J, de Pv/TdTomato, y de VGT3/TdTomato.
Primero, el electroporation fue realizado en las neuronas piramidales CA1 (Py) en 7, 14, o 21 días in vitro (DIV). Egfp fue transfectado en 5-20 neuronas piramidales en el área hippocampal CA1 a través de estas edades de cultivo de rebanadas (Figura 2B-D). Las neuronas piramidales CA1 fueron identificadas usando el contraste de interferencia diferencial (DIC). Para demostrar la distribución anatómica y las diferencias morfológicas entre las neuronas piramidales y las interneuronas inhibitorias en el cultivo en rodajas, las neuronas piramidales CA1 se electroporaron con EGFP en un ratón DIV7 Pv/TdTomato y se realizó una contratensión nuclear para mostrar la ubicación distinta de las neuronas EGFP positivas en la capa de células piramidales CA1(Figura 2A).
Después, este protocolo también fue aplicado a las interneuronas TdTomato-positivas pv y VGT3. La electroporación de EGFP se realizó en 1-10 interneuronas etiquetadas con fluorescente. Las neuronas TdTomato-positivas Pv(Figura 3)y VGT3(Figura 4)fueron electroporadas con éxito en el área del hipocampo CA1. Curiosamente, la transfección del gen EGFP de interés en todos estos tipos neuronales inhibitorios no se vio afectada significativamente por div y no difirió con la eficiencia de transfección (~80%) observada en las neuronas piramidales CA1(Figura 5).
Figura 1: Dos imágenes representativas de pipetas de vidrio.
(A)Mostrar pipetas de menor resistencia (6,5 MΩ), utilizadas en este protocolo, y(B)pipetas de mayor resistencia (10,4 MΩ) típicas de los protocolos de electroporación. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Los cultivos organotípicos de rebanadas del hipocampo se electroporaron con EGFP (verde) en tres puntos de tiempo diferentes.
(A)Cultivo representativo organotípico de rebanadas de hipocampo en un ratón DIV7 Pv/TdTomato. Las neuronas piramidales CA1 electroporated con EGFP (puntas de flecha verdes, blancas) y no demostraron ningita con TdTomato (TdT) - interneuronas positivas del picovoltio (puntas de flecha rojas, amarillas). Dapi contratenso nuclear (azul) fue realizado. DG: giro dentado. (B -D) Las neuronas piramidales CA1 fueron electroporadas con EGFP en tres puntos de tiempo diferentes:(B)DIV7,(C)DIV14 y(D)DIV21. Las culturas organotípicas de la rebanada fueron fijadas con la sacarosa del 4%, el paraformaaldehído del 4% / 1x PBS e imagen sin seccionar adicional. Arriba a la izquierda, imágenes de bajo aumento del área del hipocampo CA1. Las puntas de flecha representan neuronas piramidales CA1 individuales dirigidas a la electroporación. Las neuronas transfectadas con puntas de flecha amarillas se acercan en los paneles inferiores. Las puntas de flecha blancas significan neuronas electroporadas adicionales fuera de la vista de alto aumento. Arriba a la derecha, imágenes de bajo aumento de imágenes fluorescentes superpuestas (Sup) y nomarski. Barras de escala: 500, 50, 100, 20 μm respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Los cultivos organotípicos de rebanadas de hipocampo Pv/TdTomato fueron electroporados con EGFP (verde) en tres puntos de tiempo diferentes.
(A)DIV7,(B)DIV14 y(C)DIV21. Traslapo con TdTomato Pv-etiquetado (TdT) - las células positivas (rojas) fueron observadas en la capa piramidal hippocampal CA1 de la célula y los oriens. En los recuadros de bajo aumento (fila superior), las puntas de flecha amarillas representan interneuronas Pv individuales dirigidas a la electroporación. Las puntas de flecha blancas significan interneuronas Pv TdTomato-positivas adicionales electroporadas fuera de la vista de alto aumento. Barras de escala: 50, 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4: Los cultivos organotípicos de rebanadas de hipocampo VGT3/TdTomato fueron electroporados con EGFP (verde) en tres puntos de tiempo diferentes.
(A)DIV7,(B)DIV14 y(C)DIV21. Traslapo con VGT3-labeled TdTomato (TdT) - las células positivas (rojo) fueron observadas en la capa piramidal hippocampal CA1 de la célula y los oriens. En los recuadros de bajo aumento (fila superior), las puntas de flecha amarillas representan interneuronas VGT3 individuales dirigidas a la electroporación. Las puntas de flecha blancas significan interneuronas VGT3 TdTomato-positivas adicionales electroporadas fuera de la vista de alta ampliación. Barras de escala: 50, 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5: Niveles comparables de eficiencia de transfección en neuronas piramidales CA1, Pv/TdTomato e interneuronas VGT3/TdTomato en tres edades diferentes de cultivo en rodajas in vitro.
Resumen de gráficos de barras de tres edades de referencia cultural de división diferentes: DIV7 (izquierda), DIV14 (centro) y DIV21 (derecha). Cada símbolo representa la eficiencia de transfección obtenida de un cultivo organotípico de rebanadas CA1 Py: DIV7 (12 cultivos de rebanadas de 2 ratones), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); Pv: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). ANOVA unidireccional; n.p. (no significativo). Los datos mostrados son ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Describimos aquí un método de electroporación que transfecta las neuronas excitatorias e inhibitorias con alta eficiencia y precisión. Nuestro protocolo de electroporación optimizado tiene tres avances innovadores para lograr una transfección génica altamente eficiente. Nuestra primera modificación fue aumentar el tamaño de la pipeta en comparación con los protocolos publicados anteriormente3,5,6. Este cambio nos permitió electroporar muchas neuronas sin obstrucción de pipetas. Además, es posible que las pipetas de menor resistencia permitan el uso de parámetros de pulso eléctrico más suaves en comparación con los métodos anteriores, al tiempo que se logra el resultado deseado3. A continuación, el ciclo de presión repetido antes de la electroporación redujo notablemente la muerte celular10. A menudo observamos que con la aplicación de un solo pulso de presión negativa antes de electroporating, la membrana plasmática pegada al interior de la punta de la pipeta, dañando la célula. Los ciclos de presión ayudaron a que la membrana plasmática se pegara mucho menos a la pipeta, lo que mejoró la supervivencia y la recuperación celular durante el procedimiento10. Finalmente, la adición de TTX en aCSF mejoró en gran medida el éxito de la electroporación en neuronas inhibitorias10. Consideramos que la electroporación puede causar el overexcitation mortal de la célula que se puede prevenir por TTX. Sobre todo, estas mejoras críticas ofrecen tasas de éxito notablemente altas en la electroporación a las neuronas excitatorias e inhibitorias (Figura 5). Aunque no encontramos anormalidades electrofisiológicas en nuestras neuronas después de la transfección con este método10 en las células objetivo, se ha reportado que los cambios de pH local durante la electroporación reducen la viabilidad celular y la optimización de los parámetros de electroporación puede ser relativamente difícil en comparación con otros métodos de transfección génica13,14. Por lo tanto, es importante considerar los efectos secundarios imprevistos de la electroporación y volver a optimizar los parámetros eléctricos según sea necesario para lograr una alta eficiencia de transfección para cualquier aplicación específica.
La tecnología de microinyección también se ha utilizado como un enfoque poderoso para entregar transgenes a las células2,15,16. Sin embargo, este enfoque generalmente produce un menor rendimiento de transfección y requiere un alto nivel de habilidad. En contraste, nuestro método se puede utilizar con relativa facilidad y a un costo mínimo para los laboratorios que rutinariamente realizan estudios de electrofisiología de células enteras.
Recientemente, demostramos que múltiples genes pueden ser transfectados tanto en excitatoria como en somatostatina que expresan neuronas inhibitorias sin efectos secundarios sobre las propiedades electrofisiológicas10. En este estudio, demostramos que este método de electroporación es altamente eficiente en neuronas piramidales CA1(Figura 2)y Pv(Figura 3)y VGT3(Figura 4)interneuronas inhibitorias. Además, esta técnica de electroporación nos permite transfectar genes de interés con una tasa de éxito de ~80% independientemente del tipo celular o número de días in vitro(Figura 5). Aunque la técnica sólo ha sido probada in vitro, se ha demostrado que los cultivos organotípicos de rebanadas de hipocampo en los mismos puntos de tiempo div que probamos siguen la morfología y la actividad sináptica in vivo de edad comparable, como se observa en las rebanadas de hipocampo agudamente preparadas17. Por otra parte, como sólo hemos probado este método en neuronas del hipocampo, es posible que podría haber desafíos imprevistos en la aplicación de esta técnica a las neuronas en otras regiones del cerebro. El método invita a la exploración de genes durante el desarrollo del cultivo organotípico en el que la transmisión sináptica y la densidad, entre otras propiedades, cambian con el tiempo.
Este protocolo es una mejora con respecto a los previamente establecidos en que es simultáneamente de bajo costo, menos desafiante técnicamente y más eficiente en la generación de transfección de genes de una sola neurona5,6,7,8,9. También parece ser una mejora sobre los métodos anteriores en términos de tasas más bajas de daño celular o muerte, ya que observamos que ~ 80% de las células fueron transfectadas con éxito y saludables después del procedimiento. Este método, por lo tanto, proporciona una nueva oportunidad para examinar el papel de los genes en múltiples tipos de células neuronales utilizando modelos de ratón fluorescentes. Los estudios futuros que utilizan este método pueden centrarse en las interacciones proteína-proteína entre las células para examinar funciones moleculares o fisiológicas específicas, incluidas las interacciones trans-sinápticas de proteínas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Becas de Salud (R01NS085215 a K.F., T32 GM107000 y F30MH122146 a A.C.). Los autores agradecen a la Sra. Naoe Watanabe su hábil asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
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