Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.

Die Gentransfektion ist ein wichtiger Ansatz für neurobiologische Studien. Unsere Elektroporationstechnik ermöglicht es uns, Gen-of-Interest-Interneurone in organotypischen Hippocampus-Schnittkulturen ohne nachweisbare Nebenwirkungen zu transfizieren. Dieses Protokoll hat im Vergleich zu anderen Einzelzellprotokollen eine viel höhere Transfektionseffizienz, ist aber immer noch relativ kostengünstig und einfach durchzuführen.

Diese Technik wird für Forscher nützlich sein, die daran interessiert sind, spezifische molekulare und physiologische Funktionen von Neuronen zu verstehen, einschließlich zellautonomer Mechanismen und transsynaptischer Proteininteraktionen. Um Schnittkulturen für die Elektroporation vorzubereiten, werden die interessierenden Kultureinsätze in einzelne drei Zentimeter große Petrischalen überführt, die mit 900 Mikrolitern Nährmedium beladen sind, und die Kulturen in einen Kohlendioxid-Inkubator auf dem Tisch gestellt. Anschließend werden frische Kultureinsätze mit einem Milliliter Scheibenkulturmedium pro Einsatz in einer 3,5 Zentimeter großen Petrischale mindestens 30 Minuten lang vorinkubiert und die Leitungen der Elektroporationsanlage fünf Minuten lang mit 10 % Bleiche sterilisiert.

Am Ende der Perfusion spülen Sie die Leitungen mindestens 30 Minuten lang mit ionisiertem autoklaviertem Wasser, bevor Sie mit einem Filter aus sterilisiertem ACSF perfundieren, das 0,001 millimolares Tetrodotoxin enthält. Stellen Sie den Elektroporatorimpuls auf eine Amplitude von minus fünf Volt, einen Rechteckimpuls, einen Zug von 500 Millisekunden, eine Frequenz von 50 Hertz und eine Impulsbreite von 500 Mikrosekunden ein. Füllen Sie eine Glaspipette mit fünf Mikrolitern plasmidhaltiger interner Lösung und schnippen und klopfen Sie mehrmals vorsichtig auf die Spitze, um eingeschlossene Blasen zu entfernen.

Vergewissern Sie sich mit einem Präpariermikroskop, dass die Spitze nicht beschädigt ist, und befestigen Sie die Pipettenspitze sicher an der Elektrode. Wenn die Spitze mit dem ACSF in Berührung kommt, notieren Sie die Pipettenwiderstandsanzeige des Elektroporators. Um eine Schnittkultur zu isolieren, schneiden Sie die Membran des Kultureinsatzes mit einer scharfen Klinge ab und verwenden Sie eine scharfe abgewinkelte Pinzette, um die Schnittkultur vorsichtig in die Elektroporationskammer zu überführen.

Fixieren Sie dann die Kulturposition mit einem Scheibenanker. Für die Elektroporation der interessierenden Zellen üben Sie mit dem Mund positiven Druck auf die Pipette aus und verwenden Sie die dreidimensionalen Drehregler, um die Pipettenspitze nahe an die Oberfläche der Schnittkultur zu manövrieren. Betrachten Sie die Kultur mit dem Mikroskop, nähern Sie sich der Zielzelle mit der Spitze und halten Sie den Überdruck aufrecht, bis sich ein Grübchen auf der Zelloberfläche bildet.

Bei der Visualisierung des Grübchens wird schnell ein leichter Unterdruck mit dem Mund ausgeübt, so dass sich zwischen der Pipettenspitze und der Plasmamembran eine lose Dichtung bildet. Die Membran dringt leicht in die Pipette ein. Es sollte eine etwa 2,5-fache Erhöhung des Anfangswiderstands der Pipette beobachtet werden, was sich in einer Tonerhöhung aus den Lautsprechern zeigt.

Üben Sie schnell wieder positiven Druck aus, damit sich das Grübchen neu bildet. Führen Sie dann sofort mindestens zwei weitere Druckzyklen durch, wie gerade gezeigt, ohne Pause. Halten Sie nach dem letzten Druckimpuls den Unterdruck für eine Sekunde aufrecht.

Wenn der Ton aus den Lautsprechern einen stabilen Scheitelpunkt in der Tonhöhe erreicht, verwenden Sie das Fußpedal, um den Elektroporator schnell zu pulsieren. Ziehen Sie die Pipette nach der Elektroporation vorsichtig etwa 100 Mikrometer von der Zelle zurück, ohne Druck auszuüben, und üben Sie erneut positiven Druck aus, um sicherzustellen, dass der Widerstand ähnlich der Ausgangsanzeige ist, bevor Sie sich der nächsten Zelle nähern. Wenn alle gewünschten Zellen elektroporiert wurden, überführen Sie die Schnittkultur in einen der vorbereiteten Frischkultureinsätze und legen Sie den Einsatz bis zu drei Tage lang bei 35 Grad Celsius.

In diesem repräsentativen Experiment wurde EGFP in fünf bis 20 pyramidale Neuronen im hippokampalen CA1-Bereich über ein Alter von sieben, 14 und 21 Tagen in vitro-Schnittkulturen transfiziert. Parvalbumin und vesikuläre Glutamat-Typ-3-Interneuronen können auch erfolgreich im hippokampalen CA1-Bereich elektroporiert werden. Interessanterweise wird die Transfektion nicht signifikant durch das Alter der In-vitro-Schnittkultur am Tag beeinflusst und unterscheidet sich nicht von der Transfektionseffizienz, die in CA1-Pyramidenneuronen beobachtet wurde.

Neuronen sind sehr zerbrechlich. Sie müssen äußerst vorsichtig und sanft sein, wenn Sie sich den Zellen nähern und den Druck wechseln und die Pipettenspitze zurückziehen, um ernsthafte Schäden zu verursachen. Nach der Elektroporation können die Zellen verschiedenen experimentellen Analysen unterzogen werden, einschließlich Elektrophysiologie und Bildgebung.