Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus
6. Oktober 2020
Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.
Die Gentransfektion ist ein wichtiger Ansatz für neurobiologische Studien. Unsere Elektroporationstechnik ermöglicht es uns, Gen-of-Interest-Interneurone in organotypischen Hippocampus-Schnittkulturen ohne nachweisbare Nebenwirkungen zu transfizieren. Dieses Protokoll hat im Vergleich zu anderen Einzelzellprotokollen eine viel höhere Transfektionseffizienz, ist aber immer noch relativ kostengünstig und einfach durchzuführen.
Diese Technik wird für Forscher nützlich sein, die daran interessiert sind, spezifische molekulare und physiologische Funktionen von Neuronen zu verstehen, einschließlich zellautonomer Mechanismen und transsynaptischer Proteininteraktionen. Um Schnittkulturen für die Elektroporation vorzubereiten, werden die interessierenden Kultureinsätze in einzelne drei Zentimeter große Petrischalen überführt, die mit 900 Mikrolitern Nährmedium beladen sind, und die Kulturen in einen Kohlendioxid-Inkubator auf dem Tisch gestellt. Anschließend werden frische Kultureinsätze mit einem Milliliter Scheibenkulturmedium pro Einsatz in einer 3,5 Zentimeter großen Petrischale mindestens 30 Minuten lang vorinkubiert und die Leitungen der Elektroporationsanlage fünf Minuten lang mit 10 % Bleiche sterilisiert.
Am Ende der Perfusion spülen Sie die Leitungen mindestens 30 Minuten lang mit ionisiertem autoklaviertem Wasser, bevor Sie mit einem Filter aus sterilisiertem ACSF perfundieren, das 0,001 millimolares Tetrodotoxin enthält. Stellen Sie den Elektroporatorimpuls auf eine Amplitude von minus fünf Volt, einen Rechteckimpuls, einen Zug von 500 Millisekunden, eine Frequenz von 50 Hertz und eine Impulsbreite von 500 Mikrosekunden ein. Füllen Sie eine Glaspipette mit fünf Mikrolitern plasmidhaltiger interner Lösung und schnippen und klopfen Sie mehrmals vorsichtig auf die Spitze, um eingeschlossene Blasen zu entfernen.
Vergewissern Sie sich mit einem Präpariermikroskop, dass die Spitze nicht beschädigt ist, und befestigen Sie die Pipettenspitze sicher an der Elektrode. Wenn die Spitze mit dem ACSF in Berührung kommt, notieren Sie die Pipettenwiderstandsanzeige des Elektroporators. Um eine Schnittkultur zu isolieren, schneiden Sie die Membran des Kultureinsatzes mit einer scharfen Klinge ab und verwenden Sie eine scharfe abgewinkelte Pinzette, um die Schnittkultur vorsichtig in die Elektroporationskammer zu überführen.
Fixieren Sie dann die Kulturposition mit einem Scheibenanker. Für die Elektroporation der interessierenden Zellen üben Sie mit dem Mund positiven Druck auf die Pipette aus und verwenden Sie die dreidimensionalen Drehregler, um die Pipettenspitze nahe an die Oberfläche der Schnittkultur zu manövrieren. Betrachten Sie die Kultur mit dem Mikroskop, nähern Sie sich der Zielzelle mit der Spitze und halten Sie den Überdruck aufrecht, bis sich ein Grübchen auf der Zelloberfläche bildet.
Bei der Visualisierung des Grübchens wird schnell ein leichter Unterdruck mit dem Mund ausgeübt, so dass sich zwischen der Pipettenspitze und der Plasmamembran eine lose Dichtung bildet. Die Membran dringt leicht in die Pipette ein. Es sollte eine etwa 2,5-fache Erhöhung des Anfangswiderstands der Pipette beobachtet werden, was sich in einer Tonerhöhung aus den Lautsprechern zeigt.
Üben Sie schnell wieder positiven Druck aus, damit sich das Grübchen neu bildet. Führen Sie dann sofort mindestens zwei weitere Druckzyklen durch, wie gerade gezeigt, ohne Pause. Halten Sie nach dem letzten Druckimpuls den Unterdruck für eine Sekunde aufrecht.
Wenn der Ton aus den Lautsprechern einen stabilen Scheitelpunkt in der Tonhöhe erreicht, verwenden Sie das Fußpedal, um den Elektroporator schnell zu pulsieren. Ziehen Sie die Pipette nach der Elektroporation vorsichtig etwa 100 Mikrometer von der Zelle zurück, ohne Druck auszuüben, und üben Sie erneut positiven Druck aus, um sicherzustellen, dass der Widerstand ähnlich der Ausgangsanzeige ist, bevor Sie sich der nächsten Zelle nähern. Wenn alle gewünschten Zellen elektroporiert wurden, überführen Sie die Schnittkultur in einen der vorbereiteten Frischkultureinsätze und legen Sie den Einsatz bis zu drei Tage lang bei 35 Grad Celsius.
In diesem repräsentativen Experiment wurde EGFP in fünf bis 20 pyramidale Neuronen im hippokampalen CA1-Bereich über ein Alter von sieben, 14 und 21 Tagen in vitro-Schnittkulturen transfiziert. Parvalbumin und vesikuläre Glutamat-Typ-3-Interneuronen können auch erfolgreich im hippokampalen CA1-Bereich elektroporiert werden. Interessanterweise wird die Transfektion nicht signifikant durch das Alter der In-vitro-Schnittkultur am Tag beeinflusst und unterscheidet sich nicht von der Transfektionseffizienz, die in CA1-Pyramidenneuronen beobachtet wurde.
Neuronen sind sehr zerbrechlich. Sie müssen äußerst vorsichtig und sanft sein, wenn Sie sich den Zellen nähern und den Druck wechseln und die Pipettenspitze zurückziehen, um ernsthafte Schäden zu verursachen. Nach der Elektroporation können die Zellen verschiedenen experimentellen Analysen unterzogen werden, einschließlich Elektrophysiologie und Bildgebung.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Einzelzell-Elektroporation vor, das die Genübertragung in sowohl exzitatorischen als auch inhibitorischen Neuronen in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen ermöglicht. Diese Technik erlaubt eine präzise Kontrolle der Genexpression und erleichtert die Untersuchung sowohl zellautonomer Mechanismen als auch interzellulärer Interaktionen über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Gen-Transfektion
- Elektrophysiologie
Hintergrund
- Die Gen-Transfektion ist entscheidend für die neurobiologische Forschung.
- Die Elektroporation bietet eine hohe Transfektionseffizienz mit minimalen Nebenwirkungen.
- Die Methode ist im Vergleich zu anderen Techniken relativ einfach und kostengünstig.
- Das Verständnis molekularer und physiologischer Funktionen in Neuronen ist für die Neurobiologie unerlässlich.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer effektiven Methode zur Transfektion von Genen in neuronale Populationen.
- Untersuchung spezifischer molekularer Funktionen und Mechanismen in erregenden und hemmenden Neuronen.
- Beurteilung der Transfektionseffizienz an Schnittkulturen unterschiedlichen Alters.
Verwendete Methoden
- Die Elektroporation wurde an organspezifischen hippokampalen Schnittkulturen durchgeführt.
- Pyramidenzellen und Interneurone waren die verwendeten zentralen biologischen Modelle.
- Die Transfektion wurde an Schnitten unterschiedlichen Alters (7, 14 und 21 Tage in vitro) bewertet.
- Zu den detaillierten Schritten gehören die Vorbereitung, Pipettiermethoden und die Überwachung von Widerstandsänderungen.
- Zellverletzungen während des Verfahrens wurden durch sorgfältige Handhabung minimiert.
Hauptergebnisse
- Eine hohe Effizienz der Gen-Transfektion wurde in gezielten Neuronen erreicht, ohne signifikante Unterschiede bezüglich des Alters der Schnittkulturen.
- Die Elektroporation beeinträchtigte die Vitalität nicht negativ und erhielt die zelluläre Integrität nach der Transfektion aufrecht.
- Die Methode ermöglichte detaillierte Untersuchungen physiologischer Reaktionen und potenzieller Interaktionsmechanismen zwischen Neuronen.
- Eine erfolgreiche Transfektion von Pars- und vesikulären Glutamat-Typ-3-Interneuronen wurde ebenfalls demonstriert.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie präsentiert ein robustes Protokoll für die Gen-Transfektion in neuronalen Kulturen und erweitert damit die Forschungsmöglichkeiten in der Neurobiologie.
- Die Methode schafft die Grundlage für weitere Untersuchungen neuronaler Mechanismen und interzellulärer Funktionen.
- Das Verständnis dieser Prozesse ist entscheidend, um Einblicke in die neuronale Plastizität und potenzielle therapeutische Anwendungen zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Einzelzell-Elektroporation in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen ermöglicht eine präzise Genübertragung in exzitatorische und inhibitorische Neurone und unterstützt so die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominimierung im neurowissenschaftlichen Bereich. Die Methode erreicht eine hohe Transfektionseffizienz (~80 %) über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg und erlaubt dadurch eine konsistente phänotypische Untersuchung sowie die Entwicklung von Assays zur Untersuchung von Signalwegen. Dieser Ansatz verringert die biologische Unsicherheit bei der frühen Hypothesenprüfung von Zielstrukturen, indem er reproduzierbare, quantitative Genexpressionsstudien in für die Krankheit relevante neuronale Systeme ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in hippocampalen exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die funktionelle Zielstrukturvalidierung, indem Genexpression mit physiologischen Messgrößen in intakten Mikroschaltkreisen verknüpft wird.
- Operativer Wert: Erzielt eine hohe Transfektionseffizienz ohne nachweisbare Nebenwirkungen und verringert so die experimentelle Variabilität.
- Operativer Wert: Funktioniert über verschiedene Alter der Schnittkulturen (7–21 Tage in vitro) hinweg und ermöglicht Zeitreihenstudien zur Zielstrukturbindung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte neuronale Systeme für nachgeschaltete elektrophysiologische und bildgebende Assays vor.
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative Daten mit Einzelzellauflösung zu Genfunktion und Proteinwechselwirkungen.
- Operativer Wert: Verwendet Standard-Elektrophysiologie-Ausrüstung und ermöglicht eine skalierbare Integration in bestehende Arbeitsabläufe.
- Operativer Wert: Erhält die Transfektionseffizienz über längere Kultivierungszeiträume aufrecht und unterstützt damit longitudinale Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet krankheitsrelevante hippokampale Verschaltungen, um Zielmechanismen in pathophysiologischen Kontexten zu untersuchen.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Beurteilung transsynaptischer Proteinwechselwirkungen und zellautonomer Mechanismen.
- Operativer Wert: Erleichtert die kontinuierliche Übertragung von Entdeckungen in die präklinische Validierung, indem die neuronale Gesundheit nach der Transfektion erhalten bleibt.
- Operativer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung durch zuverlässige und wiederholbare Genübertragung in primären neuronalen Kulturen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur Identifizierung von Leitverbindungen ein und ermöglicht eine mechanistische Risikominderung vor der Verbindungsscreening-Phase.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in hippocampalen neuronalen Populationen.
- Screening: Bietet assaysbereite Systeme mit reproduzierbarer Transfektion und quantitativen Ausgaben zur Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Ermöglicht die über Widerstand basierende Überwachung und elektrophysiologische Messungen, um Genexpression mit funktionellen Phänotypen zu korrelieren.
- Translationale Forschung: Verbindet Genfunktionsstudien mit präklinischer Kontinuität durch stabile Transfektion in organspezifischen Schnitten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Nutzt bestehende Elektrophysiologie-Infrastruktur und positioniert die Methode als wiederverwendbare Plattform zur Validierung neuronaler Zielstrukturen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung durch hochwirksame, niedrig-toxische Genübertragung in primären Neuronen.
- Operativer Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch konsistente Pulsparameter und Druckzyklus-Protokoll.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unschärfen bei der neuronalen Target-Bindung.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung durch zuverlässige Beurteilung der Genfunktion über verschiedene Neuronenklassen und Entwicklungsstadien hinweg.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Elektrophysiologie und Mikropipetten-Manipulation zur gezielten Ansteuerung einzelner Zellen.
- Benötigt Glas-Elektroden, einen Elektroporator und sterile ACSF-Lösung mit Tetrodotoxin zur Aufrechterhaltung der neuronalen Gesundheit.
- Erfordert die Standardisierung der Druckimpuls-Sequenzen und der Widerstandsüberwachung zwischen verschiedenen Anwendern.
- Zu berücksichtigende Anpassungen sind die Anpassung der Plasmidkonzentration und der Impulsbreite je nach Neuronentyp oder Gengröße.
- Praktische Einschränkung: Die Fragilität der Neuronen erfordert eine sorgfältige Technik, um eine Membranruptur während der Druckzyklen zu vermeiden.
