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Developmental Biology

वायलेट-उत्तेजित सेल-पारमी योग्य डीएनए बाइंडिंग डाई का उपयोग करके मुरीन शुक्राणुओं की कोशिकाओं का अलगाव

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61666
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3,4, 1,2, 3,4, 5,6, 1,2
1Division of Reproductive Sciences, Division of Developmental Biology, Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine, 3Division of Germ Cell Biology, National Institute for Basic Biology, National Institutes of Natural Sciences, 4Department of Basic Biology, School of Life Science, Graduate University for Advanced Studies (Sokendai), 5Department of Animal Science and Biotechnology, School of Veterinary Medicine, Azabu University, 6Faculty of Science and Technology, Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Science
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम वयस्क माउस टेस्ट से लाइव मेयोटिक और पोस्ट-मेयोटिक रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल और कुशल विधि पेश करते हैं। एक कम साइटोटॉक्सिकिटी, वायलेट-उत्तेजित डीएनए बाध्यकारी डाई और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई का उपयोग करके, कोई भी कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक समृद्ध शुक्राणुओं की कोशिका आबादी को अलग कर सकता है।

Abstract

मेयोसिस और शुक्राणुओं के अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए मेइओटिक शुक्राणुओं का अलगाव आवश्यक है। यद्यपि फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के संयोजन में होचस्ट 33342 धुंधला का उपयोग करके स्थापित सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल हैं, लेकिन इसके लिए पराबैंगनी लेजर से लैस सेल सॉरर्स की आवश्यकता होती है। यहां हम डाइनसाइकिल वायलेट (डीसीवी) दाग का उपयोग करके एक सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो एक कम साइटोटॉक्सिकिटी डीएनए बाइंडिंग डाई संरचनात्मक रूप से होचस्ट 33342 के समान है। डीसीवी दोनों पराबैंगनी और बैंगनी लेजर, जो उपकरण पसंद के लचीलेपन में सुधार, एक सेल सॉर्टर एक पराबैंगनी लेजर से सुसज्जित नहीं सहित से उत्साहित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एक मेइटिक प्रोफेन I में तीन लाइव-सेल सबपॉलेशन को अलग कर सकता है, जिसमें लेप्टोटीन/जाइगोटेन, पैचिटीन और डिप्लोटीन शुक्राणु, साथ ही पोस्ट-मेयोटिक राउंड स्पर्मेटिक्स शामिल हैं। हम माउस टेस्ट से एकल-सेल निलंबन तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं। कुल मिलाकर, प्रक्रिया को पूरा करने के लिए थोड़े समय की आवश्यकता होती है (आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के आधार पर 4-5 घंटे), जो कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान करता है।

Introduction

शुक्राणुएटोजेनेसिस एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें शुक्राणुओं की एक छोटी आबादी स्टेम कोशिकाओं के वयस्क जीवन में बड़ी संख्या में शुक्राणुओं का निरंतर उत्पादन बनाए रखती है1,2. शुक्राणुओं के दौरान, गतिशील क्रोमेटिन रीमॉडलिंग तब होती है जब शुक्राणुओं की कोशिकाएं हैप्लॉयडस्पर्मेटिक्स3,4,5का उत्पादन करने के लिए मेयोसिस से गुजरती हैं। आणविक जांच के लिए मेयोटिक शुक्राणुओं का अलगाव आवश्यक है, और मेइओटिक शुक्राणुओं को अलग करने के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोण स्थापित किए गए हैं, जिनमें तलछट-आधारित पृथक्करण6,7 और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,17शामिल हैं। हालांकि, इन तरीकों की तकनीकी सीमाएं हैं। जबकि तलछट आधारित पृथक्करण से बड़ी संख्या में कोशिकाएं5,6,7होती हैं, यह श्रम प्रधान है। स्थापित एफएएफएस-आधारित विधि डीएनए सामग्री और प्रकाश बिखरने वाले गुणों के आधार पर मेयोटिक शुक्राणुओं को अलग करने के लिए होचस्ट 33342 (हो342) का उपयोग करती है और इसके लिए पराबैंगनी (यूवी)लेजर8, 9, 10,11से लैस FACS सेल सॉर्टर्स की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक एफएस-आधारित विधियों के लिए ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की आवश्यकता होती है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन, शुक्राणुओं के सिंक्रोनाइजेशन12,या सेल निर्धारण और एंटीबॉडी लेबलिंग को व्यक्त करती हैं जो जीवित कोशिकाओं के अलगाव के साथ संगत नहीं है13। जबकि सेल-पारमी डीएनए बाइंडिंग डाई, डाइनसाइकिल ग्रीन स्टेन14, 15,16,17का उपयोग करके एक और वैकल्पिक विधि है, किशोर टेस्टिस से शुक्राणुओं की कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस विधि की सिफारिश की जाती है। इसलिए, लाइव मेयोटिक स्पर्मेटोसाइट्स के लिए एक सरल और मजबूत अलगाव विधि विकसित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है जिसे किसी भी उम्र के किसी भी माउस तनाव पर लागू किया जा सकता है और जिसे किसी भी FACS सेल सॉर्टर का उपयोग करके किया जा सकता है।

यहां हम डाईसाइकिल वायलेट (डीसीवी) दाग का उपयोग करके इस तरह के लंबे समय से मांग किए गए सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। डीसीवी एक कम साइटोटॉक्सिकिटी, सेल-पारगम्य डीएनए बाइंडिंग डाई संरचनात्मक रूप से Ho342 के समान है, लेकिन एक उत्तेजन स्पेक्ट्रम के साथ वायलेट रेंज18की ओर स्थानांतरित कर दिया। इसके अलावा डीसीवी के पास डीसीजी की तुलना में व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है । इस प्रकार, यह यूवी और वायलेट लेजर दोनों से उत्साहित हो सकता है, जो उपकरणों के लचीलेपन में सुधार करता है, जिससे यूवी लेजर से लैस एक FACS सेल सॉर्टर का उपयोग होता है। यहां प्रस्तुत डीसीवी प्रोटोकॉल DCV ब्लू और डीसीवी लाल के साथ दो आयामी जुदाई का उपयोग करता है, Ho342 प्रोटोकॉल के लाभ की नकल उतार । इस लाभ के साथ, हमारा डीसीवी प्रोटोकॉल हमें वयस्क टेस्टिस से अत्यधिक समृद्ध रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है। हम एक माउस (दो टेस्ट से) के वयस्क माउस टेस्ट से जीवित शुक्राणुओं की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विस्तृत गेटिंग प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम माउस टेस्ट से एकल-सेल निलंबन तैयार करने के लिए एक कुशल और त्वरित प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं जिसका उपयोग इस सेल अलगाव के लिए किया जा सकता है। प्रक्रिया को पूरा करने के लिए एक कम समय की आवश्यकता है (एकल सेल निलंबन की तैयारी - 1 घंटे, डाई धुंधला - 30 मिनट, और सेल छंटाई - 2-3 घंटे: कुल - 4-5 घंटे आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के आधार पर; चित्रा 1)। सेल अलगाव के बाद, आरएनए-सेक्यू, ATAC-seq, ChIP-seq, और सेल संस्कृति सहित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला पूरी की जा सकती है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल संख्या) के दिशा-निर्देशों का पालन करता है । सिनसिनाटी चिल्ड्रन हॉस्पिटल मेडिकल सेंटर में IACUC2018-0040) ।

1. वृषण सेल निलंबन की तैयारी के लिए उपकरण और अभिकर्षक सेटअप

  1. प्रत्येक एंजाइम स्टॉक को 1x हैंक्स के बैलेंस्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (एचबीबीएस) में तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस(टेबल1)पर स्टोर करें।
    नोट: प्रयोग से पहले किसी भी समय तैयार करें।
  2. प्रयोग से एक दिन पहले: कोट रात 4 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ ट्यूब (1.5 एमएल ट्यूब) एकत्र करना।
  3. प्रयोग के दिन: पानी स्नान 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्म डल्बेको का संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) और 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में उपयोगसेठीक पहले प्रत्येक नमूने के लिए 1x वियोजन बफर के 2 एमएल तैयार करें।
    नोट: 2 एमएल वियोजन बफर दो टेस्ट के लिए तैयार किया जाता है। वियोजन बफर नुस्खा के लिए, कृपया तालिका 1का उल्लेख करें।

2. पशु विच्छेदन और वृषण कोशिका निलंबन की तैयारी

  1. कम से 10 मिनट के लिए एक कार्बन डाइऑक्साइड कक्ष में छोड़ कर एक 8 सप्ताह पुराने पुरुष माउस बलिदान ।
  2. बर्फ-ठंडे फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 2 मिलीएल युक्त 60 मिमी पेट्री डिश पर वृषण और जगह दोनों को हटा दें।
  3. टेस्ट से ट्यूनिका एल्बुगिनिया निकालें। धीरे-धीरे संदंश के साथ अलग करके अर्धनिफेरस ट्यूबल को थोड़ा फैलाएं।
  4. सेमिनिफेरस ट्यूबल्स को 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, जिसमें बर्फ-ठंडे पीबीएस की एक नई बूंद और संदंश के साथ धीरे-धीरे सेमिफेरस ट्यूबल्स की एक नई बूंद के साथ। जितना हो सके इंटरस्टिशियल कोशिकाओं को हटाने के लिए इस वॉश को 3 बार दोहराएं।
  5. 15 एमएल ट्यूब में 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलील डिसोिएशन बफर युक्त 15 एमएल ट्यूब में उलझा हुआ सेमिनिफेरस ट्यूबल।
  6. धीरे-धीरे 1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके ट्यूबल को 20 बार पिपेट करें।
  7. 6 मिनट के लिए इनक्यूबेट। कोमल पिपटिंग को 20 बार दोहराएं।
  8. 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट। कोमल पिपटिंग को 10 बार दोहराएं जब तक कि कोई दृश्यमान हिस्सा न रह जाए।
  9. निलंबन में FACS बफर के 10 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्यागें।
  10. शुक्राणुओं को हटाने के लिए दो बार चरण 2.9 दोहराएं और जितना संभव हो उतना मलबा।

3. सेल धुंधला

  1. 3 एमएल FACS बफर(टेबल 1)के साथ सेल पेलेट को फिर से रीसल करें और 50 एमएल ट्यूब में 70 माइक्रोन नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से सेल सस्पेंशन को फ़िल्टर करें।
    नोट: अपेक्षित सेल यील्ड प्रति दो अंडकोष (8 सप्ताह पुराने बी 6 जंगली-प्रकार के माउस से) लगभग 100 मिलियन कोशिकाएं हैं।
  2. सेल संख्या की गणना करें और कोशिकाओं के 10% को एक नई ट्यूब में विभाजित करें क्योंकि अन दाग नकारात्मक नियंत्रण और बर्फ पर छोड़ दें।
  3. शेष सेल निलंबन में डीसीवी दाग (मूल एकाग्रता 5 mm है) के 6 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण। अंतिम एकाग्रता 10 माइक्रोन है, और क्षमता लगभग 100 मिलियन कोशिकाओं की है।
  4. अंधेरे में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। धीरे से हर 10 मिनट सेल निलंबन हिला।
  5. इनक्यूबेशन के बाद, एक धोने के कदम के बिना, सीधे DNase I के 5 μL जोड़ें (स्टॉक एकाग्रता 10 मिलीग्राम/एमएल है) सेल निलंबन के लिए और ३५ μm नायलॉन जाल टोपी के माध्यम से एक 5 एमएल FACS ट्यूब में कोशिकाओं को फिल्टर । छंटाई तक बर्फ पर नमूने रखें।

4. फ्लो साइटोमेट्री और प्रायोगिक द्वार

  1. एफएस सेल सॉर्टर तैयार करें। सुनिश्चित करें कि FACS सेल सॉर्टर एक्सिटेशन ऑप्टिक्स से लैस है: वायलेट (405-एनएम) लेजर; डिटेक्शन ऑप्टिक्स: डीसीवी-ब्लू डिटेक्शन के लिए 450/50 बैंडपास [4′6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (डीएपीआई) का एक ही फिल्टर सेट और डीसीवी-रेड डिटेक्शन के लिए 665/30 बैंडपास [एलोफिसिकोसिनिन (एपीसी) का एक ही फिल्टर सेट] । यहां हम एक उदाहरण के रूप में सोनी SH800S सेल सॉर्टर का उपयोग करते हैं।
  2. एक नया प्रयोग बनाएं और अनुकूलित किए जाने वाले मापदंडों को प्रदर्शित करने वाले निम्नलिखित कार्य भूखंडों को स्थापित करें: एक फॉरवर्ड स्कैटर - एरिया (एफएससी-ए) बनाम बैक स्कैटर - एरिया (बीएससी-ए) घनत्व भूखंड को रैखिक पैमाने पर बनाने के लिए"वर्कशीट टूल्स"मेनू बार पर"न्यू डेंसिटी"पर क्लिक करें। क्लिक करें'न्यू हिस्टोग्राम'लोगाेंथिक पैमाने पर डीसीवी-ब्लू हिस्टोग्राम प्लॉट बनाने के लिए।
  3. संक्षेप में अनर्गल नकारात्मक नियंत्रण (चरण 3.2 से) भंवर और नमूना लोड करें।
  4. क्लिक करें'शुरूकरो' और'रिकॉर्ड'अन दाग नमूने की प्रोसेसिंग शुरू करने के लिए। जबकि नमूना चल रहा है, एफएससी/बीएससी प्लॉट के पैमाने पर अन दागित कोशिकाओं को रखने के लिए फोटोमल्टीपीयर ट्यूब (पीएमटी) दोनों वोल्टेज को समायोजित करके एफएससी और बीएससी वोल्टेज को अनुकूलित करने के लिए"डिटेक्टर और थ्रेसहोल्ड सेटिंग्स"पर क्लिक करें।
  5. पीएमटी वोल्टेज को"FL1: DAPI"पर समायोजित करें, जबकि नमूना डीसीवी-ब्लू हिस्टोग्राम लॉगरिथम प्लॉट(चित्रा 2 ए)के पहले दशक में डीसीवी-नकारात्मक आबादी की स्थिति का पता लगाने के लिए चल रहा है। पीएमटी वोल्टेज एडजस्टमेंट पूरा करने के बाद अन दाग लगे सैंपल को उतारने के लिए'स्टॉप'पर क्लिक करें।
  6. संक्षेप में नमूना भंवर (चरण 3.5 से) और नमूना लोड करें।
  7. क्लिक करें"अगली ट्यूब"DCV दाग नमूने के लिए एक नई वर्कशीट बनाने के लिए; और क्लिक करें"शुरूकरें" और"रिकॉर्ड"DCV-दाग नमूना प्राप्त करने के लिए, रिकॉर्ड ≥ 1 x 106 घटनाओं। निम्नलिखित कार्य भूखंडों को जोड़ें: एक रैखिक पैमाने पर एफएससी-एच (ऊंचाई) बनाम एफएससी-डब्ल्यू (चौड़ाई) घनत्व भूखंड बनाने के लिए"वर्कशीट टूल्स"मेनू बार पर"न्यू डेंसिटी"पर क्लिक करें; क्लिक करें"नई घनत्व"एक रैखिक पैमाने पर डीसीवी-ब्लू बनाम DCV-लाल घनत्व भूखंड बनाने के लिए। 1 x 106 घटनाओं ≥ रिकॉर्ड करने के बाद,"स्टॉप"पर क्लिक करें और नमूना उतार दें।
  8. एफएससी-ए बनाम बीएससी-ए घनत्व भूखंड पर,"प्लॉट टूल्स"मेनू बार पर"बहुभुज"पर क्लिक करें कि अधिकांश कोशिकाओं को शामिल करने और छोटे मलबे(चित्रा 2B)को बाहर करने के लिए एक बड़ा गेट"कोशिकाएं"आकर्षित करने के लिए। एफएससी-एच बनाम एफएससी-डब्ल्यू घनत्व भूखंड पर गेट"सेल"लागू करें। गैर-एकल कोशिकाओं(चित्रा 2C)को बाहर करने के लिए"एकल कोशिकाओं"गेट को आकर्षित करने के लिए"आयत"पर क्लिक करें।
  9. डीसीवी-ब्लू बनाम डीसीवी-रेड डेंसिटी प्लॉट के लिए"सिंगल सेल"गेट लागू करें और चित्रा 2डीमें दिखाए गए विस्तारित प्रोफ़ाइल को कैप्चर करने के लिए पैमाने को समायोजित करें। क्लिक करें'प्लॉट टूल्स'मेन्यू बार पर'पॉलिटिशियन'अन दागदार कोशिकाओं और साइड पॉपुलैरिटी(चित्रा 2डी)को बाहर करने के लिए'डीसीवी'गेट खींचने के लिए क्लिक करें।
  10. डीसीवी-ब्लूहिस्टोग्राम प्लॉट को रैखिक पैमाने पर "डीसीवी" गेट लगाएं। तीन प्रमुख चोटियों अलग डीएनए सामग्री का उल्लेख: 1C, 2C, और 4C(चित्रा 2E)।
  11. क्लिक करें"नई घनत्व"एक रैखिक पैमाने पर डीसीवी-ब्लू बनाम DCV-लाल घनत्व साजिश बनाने के लिए और 1C और 4C आबादी (चित्रा 2F) का पता लगाने के लिए चित्रा 2E से वापस गेटिंग प्रदर्शन करने के लिए"DCV"गेट लागू होते हैं । क्लिक करें'एलिप्से'1C आबादी पर एक गेट खींचने के लिए, जो एक संघनित क्षेत्र (गेट 1 सी) के भीतर है। क्लिक करें'बहुभुज'4C आबादी पर एक गेट खींचने के लिए जो एक सतत वक्र (गेट 4C) है।
  12. क्लिक करें"नई घनत्व"एक रैखिक पैमाने पर डीसीवी-ब्लू बनाम DCV-लाल घनत्व साजिश बनाने के लिए और लागू "4C" गेट; अधिक सटीक चयन(चित्रा 2G)के लिए "4C_1" गेट खींचने के लिए ज़ूम इन करने और"बहुभुज"पर क्लिक करने के लिए स्केल को समायोजित करें।
  13. क्लिक करें"नई घनत्व"एक रैखिक पैमाने पर एक नया FSC-A बनाम बीएससी-ए घनत्व भूखंड बनाने के लिए और लागू "4C_1" गेट; लेप्टोटीन (एल) /जाइगोटेल (जेड), पैचिटीन (पी) और डिप्लोटीन (डी) शुक्राणुओं के अनुरूप आकार से अलग तीन समृद्ध आबादी होगी । क्लिक करें"बहुभुज"या"Ellipse"3 फाटक आकर्षित करने के लिए: "L/Z", "पी", और "डी" बढ़ते आकार के आधार पर(चित्रा 2H)।
  14. क्लिक करें"नई डॉट प्लॉट"एक dcV-blue बनाम DCV-लाल रंग डॉट प्लॉट बनाने के लिए एक रैखिक पैमाने पर गेट लागू करने और सुनिश्चित करने के लिए तीन आबादी "4C_1" गेट(चित्रा 2I)के भीतर एक सतत क्रम में हैं ।
  15. इसी तरह, 1C आबादी के लिए, एक रैखिक पैमाने पर एक नया एफएससी-ए बनाम बीएससी-ए घनत्व भूखंड बनाने के लिए"न्यू डेंसिटी"पर क्लिक करें और "1C" गेट लागू करें, कोशिकाओं के एकीकृत आकार को शुद्ध गोल शुक्राणुओं की आबादी के रूप में चुनें, और"एलिप्स"को"आरएस"गेट(चित्रा 2J)आकर्षित करने के लिए क्लिक करें।

5. सॉर्ट नर रोगाणु सेल सबपॉलेशन

  1. सेल कलेक्शन के लिए 500 माइक्रोन 50% एफबीएस वाली 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें और कलेक्शन ट्यूब को कलेक्टर में लोड करें और"लोड कलेक्शन"पर क्लिक करें।
  2. क्लिक करें'नेक्स्ट ट्यूब','स्टार्ट','रिकॉर्ड'और'सॉर्ट स्टार्ट'। एक दो तरह की प्रणाली है कि ब्याज की दो आबादी संग्रह डिवाइस में एक ही समय में हल करने की अनुमति देता है का उपयोग करने के लिए, pairwise संयोजन का पालन करें: लेप्टोटीन (एल) /zygotene (जेड) और pachytene (पी) शुक्राणु एल/जेड और पी वापस फाटकों के आधार पर; आरएस और डी बैक-गेट्स पर आधारित गोल शुक्राणु (आरएस) और डिप्लोटीन (डी) शुक्राणु।
  3. जबकि नमूना चल रहा है, सबसे कुशल छंटाई प्राप्त करने के लिए ~३००० घटनाओं के लिए प्रवाह दर समायोजित करें ।

6. छंटाई कोशिकाओं की शुद्धता विश्लेषण

  1. प्रत्येक आबादी ≥ 10,000 कोशिकाओं को एकत्र करें। सबस्टेज की पुष्टि करने के लिए सेल इम्यूनोस्टेपिंग करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और ट्यूब के नीचे तरल के लगभग 110 माइक्रोन रखते हुए, सुपरनैंट को सावधानी से त्यागें।
  3. माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करने और अवलोकन सेल आकृति विज्ञान और संख्या का मूल्यांकन करने के लिए सेल निलंबन की 10 माइक्रोन ड्रॉप लें।
  4. प्रत्येक नमूना कक्ष स्लाइड (सामग्रीकी तालिका देखें) पर सेल निलंबन के 100 माइक्रोन लागू करें, और कक्षों को साइटोस्पिन पर लोड करें।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 30 x ग्राम पर नमूनों स्पिन। हाइड्रोफोबिक पेन से सेल के चारों ओर एक सर्कल बनाएं। कमरे के तापमान पर कुछ मिनट के लिए लैब बेंच पर सूखी स्लाइड ।
  6. स्लाइड के सर्कल में पीबीएस के 50 μL ड्रॉप और बंद नल।
  7. स्लाइड के सर्कल में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (पीबीएस में 5% गधा सीरम के साथ 0.02% पॉलीसॉर्बेट 20) जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: मेयोटिक शुक्राणुओं के उपमंचन का न्याय करने के लिए, SYCP3 का पता लगाया गया था, जो मेयोटिक गुणसूत्र कुल्हाड़ियों का एक मार्कर है, और γH2AX, जो डीएनए क्षति प्रतिक्रिया का एक मार्कर है। (एंटीबॉडी काम एकाग्रता के लिए, कृपया सामग्री की मेज का उल्लेख)।
  8. स्लाइड्स से प्राइमरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन को टैप करें।
  9. स्लाइड के सर्कल में पीबीएस के 50 μL ड्रॉप और बंद नल। एक बार दोहराएं।
  10. स्लाइड के सर्कल में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (पीबीएस में 0.02% पॉलीसॉर्बेट 20 के साथ पतला माध्यमिक एंटीबॉडी) जोड़ें और अंधेरे में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  11. स्लाइड के सर्कल में पीबीएस के 50 μL ड्रॉप और बंद नल। एक बार दोहराएं।
  12. DAPI के 50 μL जोड़ें (स्टॉक एकाग्रता 0.1 μg/mL है) 5 मिनट के लिए दाग और बंद नल।
  13. आगे की स्लाइड्स पर देखें बढ़ते मीडिया की 1-2 बूंदें। बढ़ते मीडिया को कवर ग्लास से सावधानी से कवर करें और अतिरिक्त बढ़ते मीडिया और हवा के बुलबुले को हटाने के लिए कवर ग्लास को धीरे-धीरे दबाएं। स्लाइड्स में है माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन के लिए तैयार।

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Representative Results

इस छंटाई प्रोटोकॉल का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3में दिखाया गया है । दो टेस्ट (एक माउस) का कुल छंटाई समय आमतौर पर लगभग 3 घंटे होता है, जो सेल निलंबन की एकाग्रता और छंटाई गति पर निर्भर करता है। छंटाई के बाद, SYCP3 और γH2AX(चित्रा 3A)के इम्यूनोस्टेटिंग द्वारा शुक्राणुओं की शुद्धता की पुष्टि की जाती है। हल किए गए एल/जेड, पी, डी स्पर्मेटोसाइट अंशों की प्रतिनिधि शुद्धता क्रमशः 80.4%, 90.6%, और 87.6%,(चित्रा 3C)के आसपास हैं। हमने पहले19प्रकाशित मानदंडों के आधार पर उप-चरणों का निर्धारण किया है । संक्षेप में, लेप्टोटीन और जाइगोटेल चरण में, समरूप गुणसूत्रों के बीच संश्लेषण अधूरा है, जो SYCP3 धुंधला के पतले धागे से संकेत मिलता है। व्यापक γH2AX डोमेन प्रोग्राम डीएनए डबल स्ट्रैंड टूट के कारण परमाणु क्रोमेटिन भर में मनाया जाता है । पचयीन चरण में, समरूप गुणसूत्रों ने पूरी तरह से सिनेप्स किया है, और γH2AX विशेष रूप से सेक्स गुणसूत्रों पर जमा होता है। डाइप्लोटेन चरण में, समरूप गुणसूत्रों को उत्तरोत्तर डिसिनैप्सिस से गुजरना पड़ता है। आरएस की शुद्धता की पुष्टि डीसीवी(चित्रा 3बी)के साथ नाभिक स्टेनिंग द्वारा की जाती है । रुपये को डीएनए धुंधला के साथ ठीक से आंका जा सकता है: यूक्रोमेटिन से घिरा एक अद्वितीय DAPI-तीव्र क्रोमोसेंटर; या विशिष्ट मार्कर के साथ गठबंधन करें, जैसे कि Sp56 जो शुक्राणुओं और हिस्टोन संस्करण एच 1 टी के विकासशील एक्रोसोमल कणिका के भीतर व्यक्त किया जाता है जो मध्य-पाचीटेन चरण(चित्रा 3 B)के बाद नाभिक में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है।

छंटाई के बाद आरएस शुद्धता 90.1% के आसपास है(चित्रा 3C)। शुद्धता विश्लेषण का नमूना आकार प्रत्येक प्रयोग के लिए 1,000 कोशिकाओं से अधिक है; एल/पी और डी आबादी की शुद्धता 6 स्वतंत्र प्रयोगों से औसत है; पी और आरएस आबादी की शुद्धता 3 स्वतंत्र प्रयोगों से औसत है। इन अलग कोशिकाओं की व्यवहार्यता आमतौर पर 95%(चित्रा S1)से अधिक होती है। एक वयस्क माउस से प्रत्येक अंश की कुल उपज का अनुमान लगाया जाता है और अंजीर 3 सी में सूचीबद्ध किया जाता है, जो विभिन्न डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए पर्याप्त कोशिकाएं प्रदान करता है। हाल ही में, हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग सीआईपी-सेक्यू विश्लेषण20,21के लिए जंगली प्रकार के पैचिटीन शुक्राणुओं को अलग करने के लिए किया है।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) घटक स्टॉक एकाग्रता आयतन
(एचबीबीएस बेस)
वियोजन बफर डीएमईएम - 2 मिलीलीटर
(डीएमईएम बेस) एफबीएस - 40 माइक्रोन
हायलुरोनिडेस 100 मिलीग्राम/मिलीलीटर 30 माइक्रोन
DNase मैं 10 मिलीग्राम/मिलीलीटर 50 माइक्रोन
कोलेजनस टाइप I 100 मिलीग्राम/मिलीलीटर 40 माइक्रोन
रिकॉम्बिनेंट कोलेजनेज 14000 यूनिट/एमएल 100 माइक्रोन
FACS बफर पीबीएस - 980 मिलीलीटर
(पीबीएस बेस) एफबीएस - 20 मिलीलीटर

तालिका 1: रिएजेंट नुस्खा। उपयोग से ठीक पहले वियोजन बफर तैयार किया जाना चाहिए। विच्छेदन शुरू करने से पहले प्रीवार्म डीएमईएम। एंजाइम स्टॉक को प्रयोग से पहले किसी भी समय तैयार किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। FACS बफर को वैक्यूम-फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने की आवश्यकता होती है; उपयोग से पहले कमरे के तापमान के लिए पूर्ववार्म।

Figure 1
चित्रा 1: डीसीवी-आधारित छंटाई पर मुरीन शुक्राणुओं की कोशिकाओं के अलगाव का कार्यप्रवाह। यह छवि सामान्य प्रक्रिया को दर्शाती है, ऊतक वियोजन से लेकर FACS छंटाई तक, एक दिन के भीतर अलग शुक्राणुओं की कोशिकाओं की कटाई तक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डीसीवी फ्लोरेसेंस और प्रकाश बिखरने के आधार पर वयस्क मुरीन वृषण कोशिकाओं का FACS विश्लेषण। (क)डीसीवी-ब्लू हिस्टोग्राम प्लॉट (लाल पट्टी के बाईं ओर) के पहले दशक में अन दागित कोशिकाओं का अधिग्रहण किया गया। (ख) (ग)प्रकाश बिखरने से बाहर रखा गया मलबा और गैर-एकल सेल। (घ)डीसीवी फ्लोरेसेंस के आधार पर अन दागदार सेल और साइड पॉपुलेशन अपवर्जन। (ई)डीसीवी-ब्लू फ्लोरेसेंस पर आधारित डीएनए कंटेंट विशंप्धता । बाएं चोटी (हरी) और सही चोटी (गुलाबी) 1C और 4C आबादी के अनुरूप है । (एफ)डीसीवी-ब्लू/डीसीवी-रेड फ्लोरेसेंस पर आधारित 1C और 4C वृषण आबादी पर गेटिंग । (जी)4C वृषण आबादी पर सटीक गेटिंग । (एच)एफएससी/बीएससी प्लॉट पर डीसीवी प्लॉट से गेट 4सी की बैक-गेटिंग । एफएससी/बीएससी प्लॉट पर न्यूनतम ओवरलैप के क्षेत्रों के आधार पर, एल/जेड, पी और डी गेट्स अपने संबंधित शुक्राणुओं की आबादी को समृद्ध करने के लिए बनाए जाते हैं । (I)एल/जेड, पी और डी आबादी दिखाने वाले कलर डॉट प्लॉट एक एफएससी/बीएससी प्लॉट पर डीसीवी प्लॉट से गेट 4सी के भीतर गेट 4सी(जे)बैक-गेटिंग के भीतर लगातार क्रम में हैं । आरएस गेट को एक समान आकार के साथ गोल शुक्राणुओं की आबादी को समृद्ध करने के लिए बनाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप छंटाई के दौरान आबादी की अधिक शुद्धता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि परिणाम छवियों और छंटाई से प्राप्त शुक्राणु कोशिकाओं के आंकड़े। (क)सॉर्ट किए गए शुक्राणुओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस लक्षण वर्णन। ऊपरी पैनल: डीसीवी धुंधला छंटाई के ठीक बाद जीवित शुक्राणुओं के नाभिक पैटर्न दिखा; एल/जेड (लेप्टोटीन/जाइगोटेल), पी (पैचियेन), और डी (डिप्लोटेन) । लोअर पैनल: SYCP3 (ग्रीन) और γH2AX (लाल) के लिए इम्यूनोसटेनिंग द्वारा प्रत्येक आबादी के लिए मेइओटिक उपस्टेज की पुष्टि। (ख)प्रतिनिधि डीसीवी छवि में 10 रुपये का नाभिक पैटर्न दिखाया गया है । स्केल बार: 50 माइक्रोन (ऊपरी पैनल), और 10 माइक्रोन (कम बढ़ाया पैनल)। सही पैनल: Sp56 और H1T के साथ दाग गोल शुक्राणुओं की इम्यूनोफ्लोरेसेंस पुष्टि। (ग)एल/जेड, पी और डी की शुद्धता की पुष्टि इम्यूनोदाता द्वारा की गई थी, नमूना आकार कुल 6 स्वतंत्र प्रयोगों में प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग के लिए १,० कोशिकाओं से अधिक था । कुल 3 स्वतंत्र प्रयोगों के साथ नाभिक स्टेनिंग द्वारा आरएस शुद्धता की पुष्टि की गई थी। एक 8 सप्ताह पुराने WT B6 माउस से वृषण सेल निलंबन की कुल सेल संख्या छंटाई से पहले लगभग १००,०,० कोशिकाओं था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S1: अलग पाचीटेन शुक्राणुओं की व्यवहार्यता। एक प्रतिनिधि छवि अलग पाचीनटेने शुक्राणुओं की कोशिका व्यवहार्यता दिखाती है (लाल: पीआई; नीला: DCV) । छंटाई के दौरान पीआई को डीसीवी के साथ नहीं जोड़ा जा सका। हालांकि, माइक्रोस्कोप के तहत, डीसीवी-रेड सिग्नल काफी कम था; इसलिए, पीआई-पॉजिटिव मृत कोशिकाओं को आसानी से अन्य जीवित कोशिकाओं से अलग किया गया था। व्यवहार्यता आमतौर पर 95% से अधिक है। स्केल बार: 10 माइक्रोन। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S2: अधूरा वियोजन या मलबे गेटिंग परेशान करता है। एक जनसंख्या (लाल घेरे) में शुक्राणुओं का मलबा और बहुलक (तीर द्वारा इंगित) होता है। बड़ा एक जनसंख्या बी जनसंख्या (पीला सर्कल) के साथ पार और अंततः 4C आबादी दूषित होगा । स्केल बार: 200 माइक्रोन। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम एक वयस्क पुरुष माउस से शुक्राणुओं और शुक्राणुओं की उपआबादी को अलग करने के लिए एक व्यावहारिक और सरल प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इस प्रोटोकॉल की पुन: उत्पन्न क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर ध्यान देने की आवश्यकता है। एंजाइम पाचन से पहले, वॉश स्टेप का उद्देश्य इंटरस्टिशियल कोशिकाओं को हटाना है; पाचन के बाद, यह कदम शुक्राणुओं और मलबे को हटाने में मदद करता है। धुलाई/3 बार अपकेंद्री महत्वपूर्ण है । हमारे वियोजन बफर नुस्खा में, कई अलग-अलग एंजाइमों का संयोजन अत्यधिक सेल क्षति के बिना एकल-कोशिका निलंबन में वृषण के वियोजन की सुविधा प्रदान करता है। हवा के बुलबुले पैदा करने से बचने के लिए धीरे-धीरे पाइपिंग भी सेल अखंडता की रक्षा करने में मदद करता है। कृपया यह सुनिश्चित करने के लिए कि निलंबन एकल-कोशिका स्तर प्राप्त करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के नीचे सेल निलंबन की जांच करें। अत्यधिक पाचन से अधूरा वियोजन या मलबे संदूषण क्रमबद्ध कोशिकाओं की शुद्धता को प्रभावित करेगा; जैसा कि चित्रा S2में दिखाया गया है, ईमानदार आबादी में शुक्राणुओं का मलबा और टेट्रामर होता है। DCV धुंधला अंधेरे में इनक्यूबेशन और बाद में कोई धोने की आवश्यकता है ।

अनुकूलन के विकल्प के रूप में शुक्राणुओं की गैटिंग और बैक-गेटिंग पर संभावित कठिनाइयों का निवारण करने के लिए, हम शुक्राणुओं के एक विशिष्ट चरण का पता लगाने में मदद करने के लिए एक सिंक्रोनाइज्ड जंगली प्रकार के माउस का उपयोग करने की सलाह देतेहैं। यह भी ध्यान देने योग्य है कि शुक्राणुओं की गिरफ्तारी के साथ कुछ नॉकआउट माउस उपभेदों में असामान्य डीसीवी प्रोफाइल हो सकते हैं क्योंकि वे कुछ उप-आबादी को याद कर रहे हैं। इस मामले में उचित वाइल्डटाइप नियंत्रण की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल संभावित रूप से किसी भी उम्र के वयस्क चूहों पर लागू किया जा सकता है। हालांकि, रोगाणु कोशिकाओं के चर अनुपात के कारण प्रयोगात्मक माउस की उम्र एक भ्रामक कारक हो सकती है।

इन वर्षों में, रोगाणु कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक के रूप में, एसटीए-पुट वेग तलछट बीएसए ढाल द्वारा रोगाणु कोशिकाओं को अलग करता है और अक्षुण्ण रोगाणु कोशिकाओं की अच्छी उपज प्रदान करता है6,7। हालांकि, एसटीए-पुट को न केवल विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है जो कई प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकते हैं, बल्कि 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडे कमरे में आचरण करने के लिए समय लेने वाली और श्रम-प्रधान भी हैं। एसटीए-पुट के विपरीत, जो बड़े पैमाने पर अलगाव के लिए उपयुक्त है, यह FACS-आधारित विधि छोटे पैमाने पर प्रयोग के लिए उच्च शुद्धता और सटीक अंश प्रदान कर सकती है। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके बड़े पैमाने पर छंटाई संभव है लेकिन छंटाई के समय को काफी लम्बा कर देगा और सेल व्यवहार्यता से समझौता कर सकता है। इसलिए, एसटीए-पुट अभी भी एक व्यावहारिक विकल्प है जब बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता है5,25,26.

Ho342 डाई स्टेनिंग8,9,10, 11पर आधारित पिछले FACS विधि की तुलना में, हमारे प्रोटोकॉल DCV का उपयोग करता है, जिसमें एक व्यापक उत्तेजन स्पेक्ट्रम है और यूवी या 405 एनएम वायलेट लेजर18से लैस अधिकांश वर्तमान एफएएफएस सॉर्टर्स पर लागू किया जा सकता है। यद्यपि डीसीजी14, 15,16,17का उपयोग करके एक और प्रोटोकॉल है, हमारे प्रोटोकॉल और डीसीजी प्रोटोकॉल के बीच अंतर यह है कि हमारा डीसीवी प्रोटोकॉल डीसीवी ब्लू और डीसीवी लाल के साथ दो-आयामी अलगाव का उपयोग करता है, जो Ho342 प्रोटोकॉल के लाभ की नकल करता है। इस लाभ के साथ, हमारा डीसीवी प्रोटोकॉल हमें वयस्क टेस्टिस से अत्यधिक समृद्ध रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है। डीसीजी प्रोटोकॉल दो आयामी अलगाव को नियोजित नहीं करता है और किशोर चूहों से रोगाणु कोशिकाओं के अलगाव के लिए सिफारिश की जाती है। दो आयामी अलगाव में शुक्राणुओं के उप-चरणों को अलग करने के लिए बेहतर संकल्प हो सकता है। हालांकि, हमारी विधि अभी भी लेप्टोटीन और जाइगोटेन शुक्राणुओं को अलग-अलग करने में असमर्थ है, साथ ही शुक्राणुओं सहित "2C" कोशिका प्रकार, प्रीप्टोटीन शुक्राणुओं, और माध्यमिक शुक्राणुओं।

चूंकि डीसीवी दाग का व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम अन्य चैनलों को लीक करने का कारण बनता है, इसलिए झूठे सकारात्मक संकेतों के कारण अधिकांश सेल व्यवहार्यता रंग जैसे पीआई और 7एएडी को जोड़ा नहीं जा सकता है। सुदूर-लाल या निकट-अवरक्त चैनलों में उत्सर्जन के साथ अन्य सेल व्यवहार्यता रंग भविष्य में कोशिश करने लायक हो सकते हैं। लेकिन हमारे अनुभव में, सॉर्ट कोशिकाएं आमतौर पर FACS छंटाई(चित्रा S1)के 2 घंटे के बाद 95% व्यवहार्यता के ≥ दिखाती हैं, जो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त है।

हमारी प्रक्रिया से प्राप्त सॉर्ट कोशिकाओं का उपयोग विभिन्न डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विश्लेषण (आरएनए-सेक्यू, ATAC-seq, और ChIP-seq) शामिल हैं। यहां प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग अल्पकालिक संस्कृति27के लिए भी किया जा सकता है । अंत में, हम एक घंटे के एकल-कोशिका निलंबन तैयारी प्रक्रिया और डीसीवी डाई स्टेनिंग के आधार पर FACS के लिए विस्तृत गेटिंग रणनीति सहित एक सरल लेकिन कुशल प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो छोटे पैमाने पर शुक्राणुओं के सेल अलगाव के लिए उपयुक्त है और कई जांचकर्ताओं द्वारा जल्दी से अपनाया जा सकता है, यहां तक कि साइटोमेट्री शुरुआती भी प्रवाह।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी हितों की है ।

Acknowledgments

हम नामकावा, योशिदा और माजावा प्रयोगशालाओं के सदस्यों को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं; पांडुलिपि के संपादन के लिए केटी गेरहार्ट; एच1टी एंटीबॉडी साझा करने के लिए मैरी एन हंडेल, सिनसिनाटी चिल्ड्रन हॉस्पिटल मेडिकल सेंटर (सीसीएचएमसी) रिसर्च फ्लो साइटोमेट्री कोर को एनआईएच S10OD023410 द्वारा समर्थित FACS उपकरण साझा करने के लिए; वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-सहायता (KAKENHI; 17K07424) टीएन; लालोर फाउंडेशन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप एएस; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) से एसवाई; अज़ाबू विश्वविद्यालय अनुसंधान सेवा प्रभाग द्वारा अनुसंधान परियोजना अनुदान, शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MEXT) निजी विश्वविद्यालय अनुसंधान ब्रांडिंग परियोजना (2016-2019) के लिए समर्थित कार्यक्रम, अनुसंधान गतिविधि स्टार्ट-अप (19K21196), टेकडा साइंस फाउंडेशन (2019) और यूहारा मेमोरियल फाउंडेशन रिसर्च इंसेंटिव ग्रांट (2018) के लिए एस.M.; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान R01 GM122776 S.H.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Watson 131-7155C
100 mm Petri dish Corning, Falcon 351029
15 mL Centrifuge tube Watson 1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) Corning, Falcon 352235
50 mL Centrifuge tube Watson 1342-050S
60 mm Petri dish Corning, Falcon 351007
70 µm nylon mesh Corning, Falcon 352350
Cell sorter Sony SH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-free FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 036-23141
Collagenase, Type 1 Worthington LS004196
Cover glass Fisher 12-544-G
Cytospin 3 Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Fisher D1306 working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase I Sigma D5025-150KU
Donkey serum Sigma S30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885076
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000044
Histone H1t antibody gift from Mary Ann Handel 1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS) Gibco 14175095
Hyaluronidase from bovine testes Sigma H3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher P36930
rH2AX antibody Millipore 05-635 working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody QED Bioscience 55101 working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope Slides Fisher 12-550-15
SYCP3 antibody Abcam ab205846 working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20) Sigma P9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) Invitrogen V35003
Water bath

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References

  1. Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
  2. Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
  3. Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
  4. Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
  5. Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
  6. Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
  7. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
  8. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
  9. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
  10. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
  11. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
  12. Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
  13. Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
  14. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
  15. da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
  16. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  17. Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
  18. Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
  19. Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
  20. Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
  21. Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
  22. Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
  23. Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
  24. Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
  25. Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
  26. Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
  27. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 167 शुक्राणु मेयोसिस शुक्राणु शुक्राणु शुक्राणु फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) डाईसाइकिल वायलेट (डीसीवी)
वायलेट-उत्तेजित सेल-पारमी योग्य डीएनए बाइंडिंग डाई का उपयोग करके मुरीन शुक्राणुओं की कोशिकाओं का अलगाव
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