Summary
Ce protocole vise à transplanter un patch bioimprimé 3D sur l’épicardium de souris infarctus modélisant l’insuffisance cardiaque. Il comprend des détails concernant l’anesthésie, l’ouverture chirurgicale de coffre, la ligature permanente de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (LAD) et l’application d’un patch bioimprimé sur la zone infarctus du coeur.
Abstract
Tester les propriétés régénératrices des patchs cardiaques bioimprimés 3D in vivo à l’aide de modèles murins d’insuffisance cardiaque par l’intermédiaire de la ligature permanente de descente antérieure gauche (LAD) est une procédure difficile et a un taux de mortalité élevé en raison de sa nature. Nous avons développé une méthode pour transplanter constamment des plaques bioimprimées de cellules et d’hydrogels sur l’épicardium d’un cœur de souris infarctus pour tester leurs propriétés régénératrices d’une manière robuste et faisable. Tout d’abord, une souris profondément anesthésiée est soigneusement intubée et ventilée. Après la thoracotomie latérale gauche (ouverture chirurgicale de la poitrine), le LAD exposé est ligaté de façon permanente et le patch bioimprimé transplanté sur l’épicardium. La souris récupère rapidement de la procédure après la fermeture de la poitrine. Les avantages de cette approche robuste et rapide comprennent un taux de mortalité prévu à 28 jours allant jusqu’à 30 % (inférieur aux 44 % rapportés par d’autres études utilisant un modèle similaire de ligature permanente de LAD chez les souris). En outre, l’approche décrite dans ce protocole est polyvalente et pourrait être adaptée pour tester les patchs bioimprimés à l’aide de différents types de cellules ou d’hydrogels où un grand nombre d’animaux sont nécessaires pour alimenter de façon optimale les études. Dans l’ensemble, nous présentons cela comme une approche avantageuse qui peut changer les tests précliniques dans les études futures pour le domaine de la régénération cardiaque et de l’ingénierie tissulaire.
Introduction
Une transplantation cardiaque est le traitement de référence pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque en phase finale, mais il ya une pénurie d’organes donneurs. Il nécessite la suppression du système immunitaire pour prévenir le rejet de greffe et le taux de mortalité d’un an est de 15% dans le monde1. Par conséquent, il existe une incitation de longue date à régénérer le myocarde dans les modèles animaux précliniques en vue de traduire en essais humains2,3,4,5,6,7,8,9. Les progrès récents dans la bioimpression 3D des cellules souches ou des cellules cardiaques dérivées de cellules souches ont attiré l’attention comme une approche prometteuse pour régénérer le myocarde2,3,9,10,11,12.
Les premiers essais d’innocuité humaine appliquant des patchs pour régénérer le cœur ont été rapportés, avec des cellules mononucléaires autologues de moelle osseuse suspendues dans le collagène ou les cellules progénitrices cardiaques dérivées de cellules souches embryonnaires en fibrine, transplantées à l’épicarde7,8,13. Cependant, pour une méthode plus précise, évolutive, automatisable et reproductible, la bioimpression 3D des patchs hydrogel optimisés à appliquer à la surface épicardiale du cœur est une approche prometteuse pour régénérer le myocarde pour les patients qui auraient autrement besoin d’une transplantation cardiaque2,10,11,12.
Avant que la traduction aux essais humains puisse se produire, des études précliniques sur les animaux sont nécessaires. Des modèles in vivo précliniques poursuivant la régénération du myocarde ont été rapportés chez les porcs5, les moutons14, les rats6 et les souris4. Un modèle commun d’infarctus du myocarde (MI) chez les souris utilise la ligature permanente de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (LAD)15,16. Parmi les différentes souches de souris utilisées, la ligature permanente de LAD chez les souris C57BL6 a un taux de survie acceptable et présente généralement le remodelage cohérent et les changements cardiaques après MI16. Dans les modèles de rongeurs, plusieurs approches ont été décrites où le tissu cardiaque a été appliqué au cœur à la poursuite de la régénération efficace du myocarde endommagé4,6,17. Alors que les grands animaux représentent encore un modèle plus cliniquement pertinent pour tester les propriétés régénératrices cardiaques5,14, la polyvalence et la faisabilité du modèle de souris se prête à cette zone d’étude en mouvement rapide. Cela peut éviter certains des pièges typiques des études sur les grands animaux, y compris (mais sans s’y limiter) : 1) la mortalité animale élevée (à moins que les artères coronaires diagonales ne soient ligatées conduisant à des infarctus segmentaux imprévisibles14, ou l’extrémité distale du LAD est occlus suivie d’une reperfusion au lieu d’une ligature permanente5); 2) les questions éthiques liées aux dommages relativement accrus causés par les protocoles sur les gros animaux par rapport aux souris18; 3) l’augmentation des coûts et/ou des problèmes de faisabilité, par exemple l’indisponibilité relative des grands équipements pour animaux tels que les scanners IRM14. Il est également important de considérer que, compte tenu de la longue durée et de l’engagement typiques des études sur les grands animaux, ils ont le potentiel de devenir obsolètes avant d’être terminés, en particulier avec les développements rapides typiques de ce domaine. Par exemple, ce n’est que récemment que le rôle critique joué par les cellules inflammatoires et les médiateurs dans la régulation de la régénération cardiaque a émergé19,20. En outre, le rôle critique des études précliniques, tels que les modèles de petits animaux, a été mis en évidence par une Commission Lancet comme une étape essentielle pour acquérir des connaissances solides avant de passer à des essais humains21.
Pour faciliter les progrès dans la compréhension des mécanismes et l’optimisation des conditions pour les approches de régénération cardiaque à base de patchs in vivo, nous présentons une nouvelle approche décrivant une méthode de « scoop et drapé » pour appliquer un patch hydrogel d’alginate/gélatine 3D bioimprimé à la surface des coeurs infrcted chez les souris C57BL6. L’objectif de cette approche est de fournir un modèle in vivo polyvalent pour tester des patchs bioimprimés 3D qui sont susceptibles d’être réalisables dans de vastes contextes de recherche pour le domaine en évolution rapide de la régénération cardiaque2. Cette méthode pourrait être adaptée aux patchs d’essai générés par des méthodes non bioimprimantes, différentes hydrogels et cellules autologues ou allogéniques dérivées des cellules souches dans les patchs in vivo. Cependant, l’examen détaillé de la bioimpression, des hydrogels ou des types de cellules est au-delà de la portée de cette étude qui se concentre sur la méthode de transplantation chirurgicale.
Les avantages du protocole incluent que l’infarctus du myocarde et l’application d’un patch bioimprimé sont effectués dans une intervention chirurgicale qui peut être effectuée rapidement, avec facilement disponibles, des outils de laboratoire rentables et avec un taux de mortalité relativement faible. Il permet également généralement un nombre plus élevé d’animaux que les grands modèles animaux dans un espace plus petit, ce qui permet une comparaison robuste de plusieurs groupes expérimentaux, particulièrement utile pour la comparaison de groupe multiple in vivo. D’autre part, ce protocole présente les inconvénients que: 1) le modèle de souris est plus éloigné de la taille du cœur humain, l’anatomie et la physiologie que dans les grands modèles animaux et il ne se traduit pas directement chez l’homme; 2) les branches murines lad proximally, avec une variabilité significative entre les souris individuelles, ce qui conduit à la variabilité de la taille des infarctus (un problème partagé avec les grands modèles animaux); 3) le patch doit être appliqué sur toute la surface du cœur antérieur, ce qui est moins précis que l’application sur une zone infarctus spécifique; et 4) le patch est appliqué immédiatement au moment de l’IM (pour usage humain, il est susceptible d’être plus cliniquement utile pour développer un patch pour l’application à l’insuffisance chronique des mois cardiaques après le MIinitial 14).
Néanmoins, s’il est choisi de manière appropriée selon l’hypothèse testée, ce protocole peut fournir rapidement des données in vivo critiques, avec des n nombres élevés, d’une manière qui soit compatible avec les matériaux, le budget et l’expertise disponibles dans la plupart des laboratoires. Par rapport aux grands modèles animaux, il s’agit d’un modèle in vivo suffisamment polyvalent pour s’adapter aux nouvelles technologies de bioimpression 3D (par exemple, par la relative facilité d’effectuer des études pilotes pour tester la faisabilité et la sécurité avant de passer à de plus grands modèles animaux). Il serait bien adapté pour les chercheurs qui veulent générer des données in vivo efficacement et à moindre coût, peut-être en exécutant de multiples comparaisons de patchs bioimprimés 3D avec différents paramètres de bioimpression, des cellules ou des hydrogels dans les correctifs. Il serait particulièrement utile pour tester les interactions de différents mélanges de cellules souches et de cellules dérivées de cellules souches avec des hydrogels in vivo sans gaspillage excessif de lignées cellulaires coûteuses ou d’autres matériaux qui pourraient se produire si vous utilisez des patchs à grande échelle. L’utilisation d’un modèle de souris faciliterait également l’essai de plaques contenant des lignées de cellules et de cellules souches dérivées de souris compatibles avec les espèces ou des cellules d’origine humaine où des souris uniformes présentant une déficience immunitaire spécifique sont souhaitables. En outre, des tests sur des souches de souris génétiquement modifiées pourraient permettre aux chercheurs d’isoler les effets de gènes spécifiques sur les voies de signalisation et dans des types de cellules spécifiques pertinents aux maladies cardiovasculaires, ce qui ne serait pas possible actuellement dans un grand modèle animal.
Protocol
Toutes les procédures décrites dans cette expérience ont été approuvées par le Comité d’éthique animale du Northern Sydney Local Health District, NSW, Australie (numéro de projet RESP17/55).
1. Anesthésie et intubation
REMARQUE : Allumez et installez le stéréomicroscope, le bloc thermique (recouvert d’une feuille absorbante) et le système de ventilation.
- Nettoyer les gants, la zone chirurgicale, et les outils avec 70% d’éthanol.
- Peser la souris pour calculer le dosage de l’anesthésie injectée par la voie intrapéritonéale (kétamine 40 mg/kg, xylazine 5 mg/kg, atropine 0,15 mg/kg) et donner l’injection.
- Une fois que la souris atteint un plan profond de l’anesthésie, raser le côté ventral gauche du thorax avec un trimmer.
- Placez la souris dans une chambre contenant 2% d’isoflurane (assurant une ventilation d’extraction adéquate dans la pièce).
REMARQUE : La dose relativement faible d’injection de kétamine/xylazine ainsi que l’inhalation d’isoflurane de 2 % réduisent le risque de décès de souris tout en permettant une intubation optimale sans réveiller la souris. - Placez la souris supine et le retenir de ses dents incisives supérieures avec une suture de 3,0 scotchée sur le banc, comme le montre la vidéo. Confirmez la sédation en effectuant une pincée d’orteil. Placez un illuminateur de haute intensité au-dessus du cou de la souris afin que l’oropharynx puisse être visualisé.
REMARQUE : Alternativement, la souris peut être placée sur le support à partir du kit d’intubation (p. ex., Kent Mouse Intubation Kit) avec une bande élastique fixée sous les incisives supérieures pour tenir la bouche ouverte afin d’identifier la trachée. - Utilisez une spatule incurvée pour ouvrir la mâchoire et une autre paire de spatules/forceps émoussés pour soulever la langue doucement hors du chemin. Assurez-vous d’intuber lorsqu’il est positionné au niveau des yeux ou légèrement en dessous de celui-ci avec le corps de la souris.
- Visualisez l’ouverture et la fermeture des cordes vocales. Lorsqu’il est ouvert, insérez le cathéter en plastique de 20 G fourni avec le kit d’intubation.
- Transférer soigneusement la souris intubée sur une surface de fonctionnement équipée d’un coussin chauffant. Connectez la souris au ventilateur (p. ex., MouseVent) qui définit automatiquement le volume cible en fonction du poids de la souris.
- Livrer 1,5 à 2% d’isoflurane avec de l’oxygène (qui est automatiquement réglé par le ventilateur: assurez-vous qu’il ya une connexion d’un cylindre d’oxygène au ventilateur automatique à 1-2 L/min débit au ventilateur). Vérifiez l’intubation en vérifiant la hausse bilatérale de la poitrine. Vérifiez l’anesthésie en effectuant une pince d’orteil.
- Appliquer la pommade opthalmique (p. ex., pommade opthalmique de vétérinaire puralube) sur les deux yeux pour les empêcher de se dessécher.
2. Préparation du champ chirurgical
- Fixez le tube d’intubation avec du ruban adhésif à l’endroit de connexion entre le ventilateur et le tube respiratoire/cathéter.
- Coupez un morceau de ruban plus long et fixez son pied avant gauche à la surface de fonctionnement dans une position légèrement surélevée. Aussi bande vers le bas les autres extrémités.
- Nettoyez la poitrine avec une solution stérile d’isopropanol et d’iode povidone à 70 %, en nettoyant dans un mouvement circulaire qui se déplace d’un centre à l’autre.
- Vérifiez l’anesthésie une fois de plus avec une pincée d’orteil.
- Administrer 0,08 mg/kg de Temvet (buprénorphine) en 0,1 mL de 0,9% saline par injection sous-cutanée.
3. Thoracotomie latérale gauche
- Utilisez des forceps à pointe fine pour soulever doucement la peau à un point d’environ 5 mm à gauche du cartilage xiphoïde proéminent. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour créer une incision suromediale dans la peau à partir de ce point vers le haut et vers la ligne médiane, au niveau du manubrium.
- Utilisez des forceps incurvés pour séparer doucement les couches cutanées et musculaires. Ouvrir la couche musculaire, après l’incision de la peau.
- Identifier et faire une incision dans le troisième espace intercostal, suivant l’angle naturel de la cage thoracique.
- Utiliser un rétractateur pour étaler délicatement les 3e et 4e côtes.
- Retirez doucement le péricarde mince avec des forceps.
- Si le LAD n’est pas visualisé, poussez doucement l’auricule gauche (voir figure supplémentaire 1)vers le haut et localisez les artères coronaires en dessous.
4. Ligation permanente de l’artère coronaire antérieure gauche (LAD)
- Couper une suture de soie de 3 mm de long de 3-0 et mettre cette pièce de suture de soie de renforcement 3-0 sur le dessus du LAD dans la même direction que le LAD (comme indiqué dans la vidéo au point de temps 02:12 – 02:20).
- Identifiez le LAD et passez une suture de soie 7-0 sous le LAD. Si le LAD n’est pas clairement visualisé, insérez l’aiguille inférieure de 1 mm et médiale au point le plus inférieur atteint par la pointe de l’auricule gauche pendant le mouvement dynamique du cœur.
NOTE: Cette structure est une couleur rouge plus claire pour les chambres ventriculaires du cœur, mais plus sombre que le poumon adjacent et est mieux visualisé dans la vidéo au point de temps 01:54 – 01:55 où il est visible juste inférieur au bras supérieur du rétracteur, supérieur au poumon gauche (voir figure supplémentaire 1 pour l’image fixe vidéo annotée). - Terminez deux lancers avec la suture de soie 7-0 et fermez-la en passant étroitement sur la suture de soie de soutien 3-0 pour fixer le LAD. Si la ligature est réussie, la zone ventriculaire antérieure distale de la ligature blanchira.
- Complétez le nœud avec un troisième jet dans la direction opposée pour le fixer, en veillant à ce qu’aucune force de traction ascendante ne soit transmise à la suture. Des lancers supplémentaires ne sont pas nécessaires pour réduire le risque de dommages au myocarde ou à la LAD par suture.
5. Transplantation du patch bioimprimé sur l’épicardium
- Déplacez soigneusement le patch bioimprimé d’une plaque de six puits à la zone infarctus en utilisant la surface intérieure stérile d’un paquet de scalpel chirurgical ouvert.
- Positionnez soigneusement le patch bioimprimé sur la surface épicardiale antérieure, où il doit couvrir toute la surface et draper sur les bords inférieurs et latéraux, couvrant le ventricule gauche et la zone infarctus (zone blanchie).
- Fermez doucement et retirez le rétractateur sans diriger les bords pointus vers le cœur.
- Utilisez 6-0 sutures prolene dans un modèle simple interrompu pour fermer la cage thoracique et les couches musculaires.
- Avec la fonction Soupir Respiration tout en fermant la poitrine avec les sutures prolene 6-0, gonfler les poumons pour enlever l’excès d’air dans la cavité pleurale, qui serait autrement être pris au piège dans la cavité thoracique et entraîner un pneumothorax.
- Assurez-vous que la poitrine est bien scellée.
- Réduire l’isoflurane à 1,0%. Fermez la peau avec des sutures prolene 6-0 dans un simple motif interrompu. Éteignez le vaporisateur isoflurane.
6. Récupération de souris
- Appliquer topique 2 mg/mL bupivacaine dans 0,9% saline à l’incision. Administrer également: i) Antisedan (atipamezole) 1 mg/kg; ii) Lasix (furosémide) 8 mg/kg; iii) 600 μL de solution saline de 0,9 % par injection sous-cutanée.
REMARQUE : L’antisédan est d’inverser l’anesthésique plus rapidement ; le furosémide est de décharger l’excès de liquide dû au compromis de sortie cardiaque et au fluide supplémentaire administré avec des injections de drogue. - Surveillez la souris et attendez que la respiration indépendante soit observée pour enlever la souris du tube d’intubation.
- Lorsque la souris démontre un taux de respiration et une profondeur bilatéraux adéquats et réagit à une pince d’orteil, placez la souris dans une cage de récupération propre placée sur un coussin chauffant.
- Fournir à la souris des aliments humides (humidifiés pour la masticabilité), une bouteille d’eau et un gel nutritif/hydratant. Surveillez un effort respiratoire exagéré, des saignements excessifs ou d’autres complications potentiellement mortelles.
- Pendant les trois jours suivants, administrer 0,08 mg/kg de Temvet (buprénorphine) en 0,1 mL de 0,9% de solution saline par injection sous-cutanée ou intrapéritonéale, deux fois par jour, puis une fois par jour jusqu’au cinquième jour suivant la procédure.
- Loger les souris en paires séparées par des séparateurs de cage pour prévenir l’isolement tout en empêchant les comportements de combat. Surveiller les souris au moins tous les jours jusqu’à la fin des expériences (28 jours) avec une attention particulière à leur bien-être et une fréquence accrue de surveillance s’il y a des préoccupations.
Representative Results
Lors de la transplantation, la viscosité du patch à température ambiante (sans qu’un crosslinker supplémentaire ne soit appliqué) lui a permis de « se draper » sur les contours du cœur (figure 1)et de se déplacer dynamiquement avec le cycle cardiaque. Après la chirurgie, nous avons quitté les patchs pendant 28 jours in vivo que les études ont constaté que c’était une période de temps appropriée permettant des effets de correction sur la fonction cardiaque hôte3,4 (bien qu’il ait été rapporté que les effets fonctionnels complets ne peuvent pas être vus jusqu’à trois mois après la transplantation)22. La photographie d’un patch montré in situ sur un cœur de souris dans la figure 1 a été prise immédiatement après l’application, montrant la capacité du patch à draper sur le cœur lors de la transplantation. Ce résultat représentatif montre que l’hydrogel permet au patch de mouler aux contours du cœur et où une tension excessive s’est produite, l’hydrogel a pu se fendre comme le montre la zone triangulaire nue (sans hydrogel) de la figure 1 (indiquée par une étoile noire sur l’image). Les données de survie (courbes de survie Kaplan-Meier) sont présentées à la figure 2 par rapport aux souris soumises à une procédure fictive (passage d’une aiguille et de suture sous le LAD sans ligature suivie de la fermeture de la poitrine de la souris).
Figure 1 : Un patch cardiaque bioimprimé appliqué sur l’épicardium d’un cœur de souris C57BL6. Un patch bioimprimé de 10 mm x 10 mm x 0,4 mm (immédiatement après la transplantation) contenant de l’hydrogel (alginate 4% (w/v)/gélatine 8% (w/v) dans les milieux) est montré drapé sur la zone infarctusée et adhérant à la surface épicardiale (pointes de flèche blanches et lignes pointillées = bordure du patch). La viscosité du patch lui permet de mouler aux contours du cœur et où une tension excessive s’est produite à l’aspect supérieur du patch s’est fendu pour faire une zone triangulaire nue non couverte par l’hydrogel (étoile noire). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyse de survie Kaplan-Meier pendant 28 jours après l’IM. Neuf souris du groupe procédural sont mortes (n=38) pour donner un taux de mortalité global de 24%. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Image fixe vidéo (temps vidéo 01:54 – 01:55) montrant l’auricule gauche (appendice atrial gauche). La flèche pointe vers la pointe inféromédiale de l’auricule gauche qui est visible comme une structure triangulaire au bord gauche supérieur du cœur. Dans le cas où le LAD n’est pas clairement visualisé, la pointe de l’auricule gauche peut être utilisée comme point de repère pour l’entrée d’aiguille pour passer une suture sous le LAD. Le point d’entrée est inférieur de 1 mm et médial au point inférieur le plus bas que la pointe de l’auricule gauche atteint pendant les mouvements dynamiques du cœur (flèche noire montre la pointe inferomediale de l’auricule gauche). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.
Discussion
La méthode permet à l’opérateur de transplanter efficacement un patch bioimprimé en l’appliquant à la surface épicardiale d’un cœur de souris infarctus suivant la ligature permanente de LAD. Dans cette méthode axée sur la faisabilité, nous sommes en mesure d’effectuer cette procédure sur huit souris par jour ouvrable (y compris la préparation de la salle avant et après). Une bioimpression produisant huit patchs de 1 cm2 dans des puits de plaques de six puits prend de 2 à 3 heures (y compris le temps de préparation avant et après). Nous avons utilisé l’intérieur stérile d’un paquet de scalpel chirurgical comme scoop pour notre patch, qui est facilement accessible et ajoute généralement un coût minimal, en utilisant les propriétés adhésives naturelles de l’alginate / patch hydrogel gélatine pour draper le patch à travers la surface antérieure infarctus du cœur. D’après notre expérience, le protocole de ligature LAD chez les souris est dépendant de l’opérateur et un taux de mortalité plus faible à 28 jours peut être atteint avec des opérateurs expérimentés spécialisés dans un seul modèle. Van den Borne et coll.16 ont rapporté que les souris C57BL6 présentent une mortalité de 44% après une ligature permanente de LAD à 28 jours sans l’application d’un patch, qui est plus élevé que la limite supérieure de 30% que nous avons observée avec la méthode.
L’étape d’intubation est critique et en soi peut être une source de mortalité pour les souris à moins d’être effectuée par un opérateur qualifié. Il est rendu difficile en raison de la petite taille de la trachée, c’est pourquoi les loupes sont portées par l’opérateur pour cette étape. Nous utilisons de la kétamine/xylazine injectée ainsi que de l’isofluorane inhalé pour l’induction de l’anesthésique afin que la souris soit profondément anesthésiée à des doses relativement faibles de chaque médicament. Par conséquent, il n’y a aucun risque pour la souris de se réveiller au cours de cette étape d’intubation, mais la mortalité élevée associée à des doses élevées d’un seul médicament est évitée. L’atropine a également été donnée pour contrecarrer des effets secondaires tels que la bradycardie et l’hypersalivation. L’utilisation d’un projecteur appliqué sur la gorge illumine la trachée à l’intérieur de sorte qu’elle est plus visible et les cordes vocales doivent être visualisées s’ouvrant et se refermant avec la fréquence respiratoire de la souris (habituellement ~120 respirations par minute). Il est essentiel de positionner la souris parfaitement (c’est pourquoi une surface dure est préférée plutôt qu’un tapis chauffant sous la souris pour cette étape) avec les deux dents incisives tenues par un fil en boucle et la langue rétractée extrêmement doucement avec des forceps émoussés / paire de spatules pour ouvrir la bouche et visualiser la trachée. Une fois l’intubation terminée, l’opérateur doit faire attention de ne pas déloger le tube dans le transfert de la zone d’intubation au lit de fonctionnement (qui a un tapis de chaleur en dessous pour prévenir l’hypothermie). Lors du raccordement du tube respiratoire à l’appareil de ventilation, il est essentiel de stabiliser le tube d’une main et de connecter le circuit du ventilateur avec l’autre, de sorte qu’il y ait un mouvement minimal du tube respiratoire comme le pousser plus profondément dans la trachée lors de la connexion du segment de ventilation du tube.
Dans cette étude, nous avons utilisé l’alginate 4% (w/v)/gélatine 8% (w/v) dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Les hydrogels alginate/gélatine sont connus pour leurs propriétés biocompatibilité, low cost et biomécaniques, ce qui les rend utiles pour les stratégies d’ingénierie tissulaire 3D23. Ces hydrogels peuvent être croisés par une légère gélation en ajoutant des ions de calcium, ce qui permet de modifier la viscosité. Après la bioimpression, nous avons appliqué du chlorure de calcium (CaCl2) 2 % (w/v) dans la solution saline tamponnée par phosphate (PBS) sur des patchs, puis nous les avons cultivés en DMEM dans six plaques de puits pendant 7 à 14 jours avant de les transplanter. C’était la fenêtre optimale après que des corrections contenant des cellules cardiaques aient commencé à battre dans la culture mais avant que les corrections aient commencé à se désintégrer. Alors que CaCl2 pouvait être ajouté régulièrement tout au long de la phase de post-bioimpression pour réduire la désintégration du patch, nous avons constaté que la viscosité intrinsèque de l’hydrogel était suffisante pour les patchs de maintenir leur structure jusqu’à la transplantation avec une seule dose initiale de CaCl2.
La méthode a permis une transplantation réussie sans sutures (ce qui peut endommager le cœur) ou de la colle (qui peut bloquer l’interface entre le patch et le cœur). Les études futures peuvent confirmer l’hypothèse que la transplantation sans suture et sans colle n’a pas d’impact négatif sur l’engrafment chez les souris car il est essentiel que le patch ne glisse pas du cœur ou interférer avec les poumons. D’autres études évaluant l’engreffement des plaques dans les modèles permanents de ligature LAD avec la réparation à base depatchs 3 ont mesuré la zone engraftée (mm2) restant avec le temps24, l’épaisseur greffée de patch (μm) reminage avec le temps25, quantification des cellules transplantées par réaction en chaîne de polymérase (PCR)26 ou flux d’émission de photons de bioluminescence des cellules de donneur vivants étiquetées (une mesure des photons émis par seconde qui peuvent quantifier les cellules greffées étiquetées qui survivent chez les animaux vivants au fil du temps)27. Les études futures peuvent utiliser ces méthodes pour évaluer plus avant si la transplantation sans suture et sans colle affecte l’engraftment de patch (aussi bien que les effets structurels et fonctionnels sur le myocarde d’hôte). Néanmoins, macroscopiquement après 28 jours in vivo dans nos souris immunocompétentes, le mediastinum antérieur a présenté le matériel fibrinous variable et les adhérences. Le mécanisme de régénération cardiaque à base de patch peut être de la stimulation des réponses inflammatoires de macrophage d’hôte19 ou des facteurs immunologiques sécrétés20 plutôt que le réapprovisionnement numérique de cellules. Si l’inflammation joue un rôle positif, la présence de matériel hydrogel étranger peut être bénéfique. Alternativement, pour réduire la présence de matériel étranger, il peut être bénéfique si la composante hydrogel se désintègre au fil du temps. En fait, certaines approches utilisent des biomatériaux qui soutiennent les cellules d’abord, puis se désintègrent, ne laissant que des tissus28,29. Les études futures visant à analyser complètement l’engraftment des patchs et à mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la régénération cardiaque basée sur les patchs peuvent mener à des conceptions expérimentales optimisées avant la traduction aux essais humains2.
Dans l’ensemble, ce protocole est susceptible d’être largement réalisable et également adapté à la mise à l’essai de plusieurs groupes de patchs bioimprimés 3D, par exemple avec différents contenus cellulaires. Les orientations futures de cette méthode comprennent la bioimpression de plaques contenant des hydrogels avancés qui n’ont pas été testés auparavant in vivo ou l’essai des effets de différentes cellules autologues ou allogéniques dérivées des cellules souches, pour l’optimisation avant de passer à de grands modèles animaux.
Disclosures
Aucun.
DÉCLARATION DE FINANCEMENT :
Christopher D. Roche a reçu le soutien d’une bourse Sir John Loewenthal 2019 (Université de Sydney), du Le Gros Legacy Fund New Zealand (PhD012019) et d’une bourse de doctorat Heart Research Australia (2019-2002). Carmine Gentile a reçu le soutien d’une subvention kick-start de l’Université de Sydney, de la subvention du programme d’encouragement au doctorat de l’Université de Sydney, du financement des semences de l’UTS, de la bourse de l’archidiocèse catholique de Sydney pour la recherche sur les cellules souches pour adultes et d’une subvention de recherche sur la chirurgie cardiothoracique de l’école de médecine de Sydney.
Acknowledgments
Merci à Natalie Johnston pour l’enregistrement des séquences non chirurgicales et tout le montage vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
| 6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
| 7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
| Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
| Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
| Atropine sulphate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
| Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
| Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
| Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
| Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
| Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
| Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
| Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals - 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
| Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
| Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
| PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
| Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
| Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
| Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
| Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
| VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
| Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |
References
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