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Bioengineering

मायोकार्डियल इंफार्क्शन के मुरीन मॉडल में 3डी बायोप्रिंटेड पैच का प्रत्यारोपण

Published: September 26, 2020 doi: 10.3791/61675
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3
1The University of Sydney, 2University of Technology Sydney (UTS), 3The Royal North Shore Hospital, 4University Hospital of Wales

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य दिल की विफलता को मॉडलिंग करने वाले इनफार्टेड चूहों के एपिकार्डियम पर 3 डी बायोप्रिंटेड पैच ट्रांसप्लांट करना है। इसमें संज्ञाहरण, सर्जिकल छाती खोलने, बाएं पूर्वकाल के स्थायी बंधन (बालक) कोरोनरी धमनी और दिल के इन्फेक्शन्ड क्षेत्र पर बायोप्रिंटेड पैच के अनुप्रयोग के बारे में विवरण शामिल हैं।

Abstract

स्थायी बाएं पूर्वकाल उतरते (बालक) बंधन के माध्यम से दिल की विफलता के मुरीन मॉडल का उपयोग करके वीवो में 3 डी बायोप्रिंटेड कार्डियक पैच के पुनर्योजी गुणों का परीक्षण एक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है और इसकी प्रकृति के कारण उच्च मृत्यु दर है। हमने अपने पुनर्योजी गुणों को मजबूत और व्यवहार्य तरीके से परीक्षण करने के लिए एक इनफार्टेड माउस हार्ट के एपिकार्डियम पर कोशिकाओं और हाइड्रोगेल के बायोप्रिंटेड पैच को लगातार प्रत्यारोपण करने के लिए एक विधि विकसित की है। सबसे पहले, एक गहरी एनेस्थेटाइज्ड माउस ध्यान से नीरस और हवादार है। बाएं पार्श्व थोराकोटॉमी (छाती के सर्जिकल उद्घाटन) के बाद, उजागर बालक स्थायी रूप से लिगा हुआ है और बायोप्रिंटेड पैच एपिकार्डियम पर प्रत्यारोपित किया जाता है। छाती बंद होने के बाद माउस जल्दी से प्रक्रिया से ठीक हो जाता है। इस मजबूत और त्वरित दृष्टिकोण के फायदों में 30% तक की अनुमानित 28 दिन की मृत्यु दर (चूहों में स्थायी बालक बंधन के समान मॉडल का उपयोग करके अन्य अध्ययनों द्वारा रिपोर्ट किए गए 44% से कम) शामिल है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण बहुमुखी है और विभिन्न सेल प्रकार या हाइड्रोगेल का उपयोग करके बायोप्रिंटेड पैच का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जहां बेहतर बिजली अध्ययन के लिए जानवरों की उच्च संख्या की आवश्यकता होती है। कुल मिलाकर, हम इसे एक लाभप्रद दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तुत करते हैं जो हृदय उत्थान और ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र के लिए भविष्य के अध्ययनों में प्रीक्लिनिकल परीक्षण को बदल सकता है।

Introduction

एक हृदय प्रत्यारोपण अंत चरण दिल की विफलता के साथ रोगियों के लिए सोने के मानक उपचार है, लेकिन वहां दाता अंगों की कमी है । यह भ्रष्टाचार अस्वीकृति को रोकने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली दमन की आवश्यकता है और एक साल की मृत्यु दर 15% दुनिया भर में1है । इसलिए , मानव परीक्षणों 2 ,3, 4,,5,6, 6 ,7,7,,8,,9में अनुवाद करने के उद्देश्य से प्रीक्लिनिकल पशु मॉडलों में मायोकार्डियम को पुनर्जीवित करनेकेलिए एक पुराना प्रोत्साहन है।9 स्टेम सेल या स्टेम सेल-व्युत्पन्न हृदय कोशिकाओं के 3 डी बायोप्रिंटिंग में हाल ही में हुई प्रगति ने मायोकार्डियम 2 , 3 ,,9,,,10, 1111,3,12को पुनर्जीवित करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण के रूप में ध्यान आकर्षित कियाहै।

दिल को पुनर्जीवित करने के लिए पैच लगाने वाले पहले मानव सुरक्षा परीक्षणों की सूचना दी गई है, जिसमें कोलेजन या भ्रूणीय स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियक प्रोजेनिटर कोशिकाओं में ऑटोलॉगस बोन मैरो मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को निलंबित कर दिया गया है, जो एपिकार्डियम7,,8,,13में प्रत्यारोपित किया गया है। हालांकि, अधिक सटीक, स्केलेबल, स्वचालित और प्रजनन योग्य विधि के लिए, हृदय की एपिकार्डियल सतह पर लागू होने वाले अनुकूलित हाइड्रोजेल पैच की 3 डी बायोप्रिंटिंग उन रोगियों के लिए मायोकार्डियम को पुनर्जीवित करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है जिन्हें अन्यथा हृदय प्रत्यारोपण2,10,,,11,,12की आवश्यकता होगी।

मानव परीक्षणों के लिए अनुवाद से पहले, पूर्व नैदानिक पशु अध्ययन की आवश्यकता होती है। मायोकार्डियम के पुनर्जनन को आगे बढ़ाने वाले वीवो मॉडलों में प्रीक्लिनिकल सूअर5, भेड़14, चूहों6 और चूहों4में सूचित किया गया है । चूहों में मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) का एक सामान्य मॉडल बाएं पूर्वकाल के स्थायी बंधन का उपयोग करता है (बालक) कोरोनरीधमनी 15,,16। इस्तेमाल चूहों के विभिन्न उपभेदों में, C57BL6 चूहों में स्थायी बालक बंधन में एक स्वीकार्य जीवित रहने की दर है और आम तौर पर एमआई16के बाद लगातार रिमॉडलिंग और हृदय परिवर्तन प्रस्तुत करता है। कृंतक मॉडलों में, कई दृष्टिकोणों का वर्णन किया गया है जहां क्षतिग्रस्त,मायोकार्डियम4,6,17के प्रभावी उत्थान की खोज में हृदय ऊतक को दिल पर लागू किया गया है।, जबकि बड़े जानवर अभी भी कार्डियक पुनर्योजी गुणों5,,14का परीक्षण करने के लिए अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, माउस मॉडल की बहुमुखी प्रतिभा और व्यवहार्यता अध्ययन के इस तेजी से बढ़ते क्षेत्र के लिए खुद को उधार देती है। यह बड़े पशु अध्ययनों के विशिष्ट कुछ नुकसानों से बच सकता है, जिनमें (लेकिन सीमित नहीं): 1) उच्च पशु मृत्यु दर (जब तक कि विकर्ण कोरोनरी धमनियों को अप्रत्याशित खंडीय इनफारेक्ट्स14के लिए अग्रणी नहीं किया जाता है, या बालक के डिस्टल एंड को स्थायी लिगेशन 5 के बजाय रिप्रेफ्यूजन के बाद कियाजाताहै); 2) चूहों की तुलना में बड़े पशु प्रोटोकॉल के कारण अपेक्षाकृत बढ़े नुकसान के साथ नैतिक मुद्दे18; 3) बढ़ी हुई लागत और/या व्यवहार्यता के मुद्दों, उदाहरण के लिए बड़े पशु उपकरणों जैसे एमआरआई स्कैनर14की सापेक्ष अनुपलब्धता । यह भी विचार करना महत्वपूर्ण है कि व्यापक अवधि और बड़े पशु अध्ययन के विशिष्ट प्रतिबद्धता को देखते हुए, वे पुराने बनने से पहले वे समाप्त हो रहे हैं, विशेष रूप से तेजी से इस क्षेत्र के विशिष्ट विकास के साथ होने की क्षमता है । उदाहरण के लिए, हाल ही में हृदय उत्थान को विनियमित करने में भड़काऊ कोशिकाओं और मध्यस्थों द्वारा निभाई गई महत्वपूर्ण भूमिका19,,20उभरकर सामने आई है । इसके अलावा, छोटे पशु मॉडल जैसे प्रीक्लिनिकल अध्ययनों की महत्वपूर्ण भूमिका को एक लैंसेट आयोग द्वारा मानवपरीक्षणों मेंजाने से पहले मजबूत ज्ञान हासिल करने के लिए एक आवश्यक कदम के रूप में रेखांकित किया गया है ।

वीवो में पैच-आधारित हृदय उत्थान दृष्टिकोणों के लिए तंत्र और अनुकूलन स्थितियों को समझने में प्रगति को सुगम बनाने के लिए, हम C57BL6 चूहों में इनफार्क्टेड दिलों की सतह पर 3 डी बायोप्रिंटेड एल्गिनेट/जिलेटिन हाइड्रोगेल पैच लागू करने के लिए एक 'स्कूप और ड्रेप' विधि का वर्णन करते हुए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। इस दृष्टिकोण का उद्देश्य 3 डी बायोप्रिंटेड पैच का परीक्षण करने के लिए वीवो मॉडल में एक बहुमुखी प्रदान करना है जो हृदय उत्थान2के तेजी से विकसित क्षेत्र के लिए व्यापक अनुसंधान संदर्भों में व्यवहार्य होने की संभावना है। इस विधि को वीवो में पैच के भीतर गैर-बायोप्रिंटिंग विधियों, विभिन्न हाइड्रोग्लोग और ऑटोलॉगस या एलोजेनिक स्टेम सेल-व्युत्पन्न कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न पैच का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, बायोप्रिंटिंग, हाइड्रोगेल या सेल प्रकारों का विस्तृत विचार इस अध्ययन के दायरे से बाहर है जो शल्य प्रत्यारोपण विधि पर केंद्रित है।

प्रोटोकॉल के फायदों में शामिल है कि मायोकार्डियल इंफेक्शन और बायोप्रिंटेड पैच का आवेदन एक सर्जिकल प्रक्रिया में किया जाता है जिसे आसानी से उपलब्ध, लागत प्रभावी प्रयोगशाला उपकरणों और अपेक्षाकृत कम मृत्यु दर के साथ जल्दी से किया जा सकता है। यह आमतौर पर एक छोटे स्थान में बड़े पशु मॉडलों की तुलना में जानवरों की अधिक संख्या के लिए भी अनुमति देता है, जो कई प्रयोगात्मक समूहों की मजबूत तुलना की अनुमति देता है, विशेष रूप से वीवो में कई समूह तुलना के लिए उपयोगी है। दूसरी ओर, इस प्रोटोकॉल के नुकसान हैं: 1) माउस मॉडल बड़े पशु मॉडल की तुलना में मानव हृदय के आकार, शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान से अधिक दूर है और यह सीधे मनुष्यों में अनुवाद नहीं करता है; 2) मुरीन बालक शाखाओं को समीपस्थ रूप से, व्यक्तिगत चूहों के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता के साथ, जो इनफार्क आकार परिवर्तनशीलता (बड़े पशु मॉडलों के साथ साझा की गई समस्या) की ओर जाता है; 3) पैच पूरे पूर्वकाल दिल की सतह है, जो एक विशिष्ट infarct क्षेत्र पर लागू करने से कम सटीक है पर लागू किया जाना चाहिए; और 4) पैच एमआई के समय तुरंत लागू किया जाता है (मानव उपयोग के लिए प्रारंभिक एमआई14के बाद लंबे समय से इनफार्टेड असफल हृदय महीनों में आवेदन के लिए एक पैच विकसित करने के लिए अधिक चिकित्सकीय रूप से उपयोगी होने की संभावना है)।

फिर भी, यदि उचित रूप से परिकल्पना का परीक्षण किया जा रहा है के अनुसार चुना जाता है, तो यह प्रोटोकॉल वीवो डेटा में उच्च एन नंबरों के साथ, एक तरह से महत्वपूर्ण प्रदान कर सकता है जो अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपलब्ध सामग्रियों, बजट और विशेषज्ञता के अनुरूप है। बड़े पशु मॉडलों की तुलना में, यह वीवो मॉडल में एक है जो उभरते 3 डी बायोप्रिंटिंग प्रौद्योगिकियों के अनुकूल होने के लिए पर्याप्त बहुमुखी है (उदाहरण के लिए बड़े पशु मॉडलों में जाने से पहले व्यवहार्यता और सुरक्षा का परीक्षण करने के लिए पायलट अध्ययन करने में सापेक्ष आसानी से)। यह उन शोधकर्ताओं के लिए अच्छी तरह से अनुकूल होगा जो वीवो डेटा में कुशलतापूर्वक और सस्ते में उत्पन्न करना चाहते हैं, शायद पैच में विभिन्न बायोप्रिंटिंग मापदंडों, कोशिकाओं या हाइड्रोगेल के साथ 3 डी बायोप्रिंटेड पैच की कई तुलना चला रहे हैं। यह स्टेम सेल और स्टेम सेल के विभिन्न मिश्रणों की बातचीत का परीक्षण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होगा, जो बड़े पैमाने पर पैच का उपयोग करने पर महंगी सेल वंश या अन्य सामग्रियों की अधिक बर्बादी के बिना वीवो में हाइड्रोगेल के साथ स्टेम सेल-व्युत्पन्न कोशिकाओं के साथ होता है। माउस मॉडल का उपयोग करने से प्रजातियों-संगत माउस-व्युत्पन्न कोशिका और स्टेम सेल वंश या मानव-व्युत्पन्न कोशिकाओं वाले पैच के परीक्षण की भी सुविधा होगी जहां एक विशिष्ट प्रतिरक्षा कमी वाले समान चूहे वांछनीय हैं। इसके अतिरिक्त, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों में परीक्षण शोधकर्ताओं को संकेत रास्ते पर विशिष्ट जीन के प्रभाव को अलग करने के लिए और विशिष्ट कोशिका हृदय रोग है, जो वर्तमान में एक बड़े पशु मॉडल में संभव नहीं होगा के लिए प्रासंगिक प्रकार में अनुमति दे सकता है ।

Protocol

इस प्रयोग में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को उत्तरी सिडनी स्थानीय स्वास्थ्य जिला, एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया (परियोजना संख्या RESP17/55) में पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. संज्ञाहरण और इंडिबेशन

नोट: चालू करें और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, हीट पैड (एक अवशोषक शीट के साथ कवर) और वेंटिलेटर प्रणाली की स्थापना की ।

  1. साफ दस्ताने, सर्जिकल क्षेत्र, और 70% इथेनॉल के साथ उपकरण।
  2. इंट्रापेरिटोनियल रूट (केटामाइन 40 मिलीग्राम/किलोग्राम, जाइलाज़ीन 5 मिलीग्राम/किलोग्राम, एट्रोपाइन 0.15 मिलीग्राम/किलो) द्वारा इंजेक्ट किए गए संज्ञाहरण की खुराक की गणना करने के लिए माउस का वजन करें और इंजेक्शन दें।
  3. एक बार माउस संज्ञाहरण के एक गहरे विमान तक पहुंचता है, एक ट्रिमर के साथ छाती के वेंट्रल बाईं ओर दाढ़ी।
  4. माउस को 2% आइसोफ्लुन (कमरे में पर्याप्त निष्कर्षण वेंटिलेशन सुनिश्चित करने) वाले कक्ष में रखें।
    नोट: केटामाइन/जाइलाज़ीन इंजेक्शन की अपेक्षाकृत कम खुराक 2% आइसोफ्लाणे साँस लेना माउस की कमी के साथ माउस की मृत्यु के जोखिम को कम करता है, जबकि माउस को जागने के बिना इष्टतम गर्भाशय की अनुमति देता है।
  5. माउस को रीपाइन रखें और इसे अपने ऊपरी छेदक दांतों से नियंत्रित करें, जैसा कि वीडियो में दिखाया गया है, पीठ पर टेप किए गए 3.0 सीवन के साथ। एक अंगुली चुटकी प्रदर्शन करके sedation की पुष्टि करें। माउस गर्दन के ऊपर एक उच्च तीव्रता वाले प्रकाशक की स्थिति रखें ताकि ओरोफेरिन्स की कल्पना की जा सके।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, माउस को श्वासनली की पहचान करने के लिए मुंह को खुला रखने के लिए शीर्ष छेदक के नीचे सुरक्षित लोचदार बैंड के साथ इंस्टुबेशन किट (उदाहरण के लिए, केंट माउस इंस्टुबेशन किट) से स्टैंड पर रखा जा सकता है।
  6. जबड़े को खोलने के लिए एक घुमावदार स्पैटुला का उपयोग करें और जीभ को धीरे-धीरे रास्ते से बाहर उठाने के लिए स्पैटुला/कुंद संदंश की एक और जोड़ी। माउस के शरीर के साथ आंख के स्तर पर या थोड़ा नीचे तैनात करते समय इंटूबनाना सुनिश्चित करें।
  7. मुखर रस्सियों के उद्घाटन और समापन की कल्पना करें। जब खुला, 20 जी प्लास्टिक कैथेटर इंस्टुबेशन किट के साथ आपूर्ति डालें ।
  8. ध्यान से एक हीटिंग पैड से लैस एक ऑपरेटिंग सतह के लिए intubated माउस हस्तांतरण। माउस को वेंटिलेटर (जैसे, माउसवेंट) से कनेक्ट करें जो माउस के वजन के आधार पर स्वचालित रूप से लक्ष्य मात्रा सेट करता है।
  9. ऑक्सीजन के साथ 1.5-2% आइसोफ्लोरैन वितरित करें (जो वेंटिलेटर द्वारा स्वचालित रूप से विनियमित होता है: सुनिश्चित करें कि वेंटिलेटर के लिए 1-2 एल/मिन प्रवाह दर पर स्वचालित वेंटिलेटर के लिए ऑक्सीजन सिलेंडर से कनेक्शन है)। द्विपक्षीय छाती वृद्धि के लिए जांच करके इंडिबेशन सत्यापित करें। एक पंजे चुटकी प्रदर्शन करके संज्ञाहरण सत्यापित करें।
  10. दोनों आंखों को सूखने से रोकने के लिए ऑप्थेलमिक मरहम (जैसे, पुरुलूबे पशु चिकित्सक ऑप्टालम मरहम) को लागू करें।

2. सर्जिकल क्षेत्र की तैयारी

  1. वेंटिलेटर और श्वास नली/कैथेटर के बीच जोड़ने वाली साइट पर टेप के साथ इंस्टुबेशन ट्यूब को सुरक्षित करें।
  2. टेप का एक लंबा टुकड़ा काटें और थोड़ा ऊंचा स्थिति में ऑपरेटिंग सतह पर अपने बाएं सामने पैर सुरक्षित। इसके अलावा अन्य हाथ पैरों नीचे टेप।
  3. बाँझ 70% आइसोप्रोपैनॉल और पोविडोन आयोडीन समाधान के साथ छाती को साफ करें, केंद्र से परिधि तक जाने वाले परिपत्र गति में सफाई करें।
  4. एक बार और एक अंगुली चुटकी के साथ संज्ञाहरण सत्यापित करें ।
  5. चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से 0.9% खारा के 0.1 मिलीएल में 0.08 मिलीग्राम/किलो टेमवेट (बुप्रेनोरफिन) प्रशासन।

3. लेफ्ट पार्श्व थोराकोटॉमी

  1. प्रमुख xiphoid उपास्थि के बाईं ओर लगभग 5 मिमी बिंदु पर त्वचा को धीरे-धीरे उठाने के लिए ठीक टिप संदंश का उपयोग करें। सर्जिकल कैंची का उपयोग इस बिंदु से ऊपर की ओर और मिडलाइन की ओर, मनुब्रियम के स्तर तक त्वचा में एक अधिवंशीय चीरा बनाने के लिए।
  2. त्वचा और मांसपेशियों की परतों को धीरे-धीरे अलग करने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें। त्वचा चीरा के बाद, मांसपेशियों की परत खोलें।
  3. रिबकेज के प्राकृतिक कोण का पालन करते हुए तीसरे इंटरकोस्टल स्पेस में एक चीरा पहचानें और बनाएं।
  4. धीरे-धीरे 3 और 4 पसलियों के अलावा फैलाने के लिए एक रिट्रैक्टर का उपयोग करें।
  5. धीरे-धीरे पतले पेरिकार्डियम को संदंश के साथ हटा दें।
  6. यदि बालक की कल्पना नहीं की जाती है, तो धीरे-धीरे बाएं अर्क को धक्का दें (पूरक चित्रा 1देखें) ऊपर की ओर और नीचे कोरोनरी धमनियों का पता लगाएं।

4. वाम पूर्वकाल उतरते (बालक) स्थाई कोरोनरी धमनी बंधन

  1. एक ~ 3 मिमी लंबे 3-0 रेशम सीवन काटें और बालक के शीर्ष पर इस मजबूत 3-0 रेशम सीवन टुकड़ा डाल के रूप में एक ही दिशा में (के रूप में समय बिंदु 02:12-02:20 पर वीडियो में दिखाया गया है) ।
  2. बालक की पहचान करें और बालक के तहत एक 7-0 रेशम सीवन पारित करें। यदि बालक स्पष्ट रूप से कल्पना नहीं है, सुई 1 मिमी अवर डालें और हृदय के गतिशील आंदोलन के दौरान बाईं ओर की नोक से पहुंचने वाले सबसे कम बिंदु पर मध्यशास्त्र करें।
    नोट: यह संरचना दिल के वेंट्रिकुलर कक्षों के लिए एक हल्का रंग लाल है लेकिन आसन्न फेफड़ों की तुलना में गहरा है और वीडियो में समय बिंदु 01:54 - 01:55 पर सबसे अच्छा दृश्य है जहां यह रिट्रैक्टर के बेहतर हाथ से कम दिखाई देता है, बाएं फेफड़ों से बेहतर (अभी भी इमेज के लिए पूरक चित्रा 1 देखें)।
  3. 7-0 रेशम सीवन के साथ दो फेंकता पूरा करें और बालक को सुरक्षित करने के लिए सहायक 3-0 रेशम सीवन के शीर्ष पर इसे कसकर पास करें। यदि लिगेशन सफल होता है, तो लिगेचर से पूर्वकाल वेंट्रिकुलर क्षेत्र डिस्टल ब्लैंच करेगा।
  4. इसे सुरक्षित करने के लिए विपरीत दिशा में तीसरे थ्रो के साथ गाँठ को पूरा करें, यह सुनिश्चित करना कि सीवन में कोई ऊपर कर्षण बल प्रेषित न हो। अतिरिक्त फेंकता के माध्यम से सीवन काटने से मायोकार्डियम या बालक को नुकसान के जोखिम को कम करने की आवश्यकता नहीं है ।

5. एपिकार्डियम पर बायोप्रिंटेड पैच का प्रत्यारोपण

  1. एक खुले सर्जिकल स्केलपेल पैकेट की बाँझ अंदर की सतह का उपयोग करके बायोप्रिंटेड पैच को छह अच्छी तरह से प्लेट से इनफार्ट क्षेत्र में ले जाएं।
  2. पूर्वकाल एपिकार्डियल सतह पर बायोप्रिंटेड पैच को सावधानीपूर्वक रखें, जहां इसे पूरी सतह को कवर करना चाहिए और अवर और पार्श्व किनारों पर कपड़ा डालना चाहिए, जिसमें बाएं वेंट्रिकल और इनफार्ट क्षेत्र (ब्लैंच्ड क्षेत्र) को कवर करना चाहिए।
  3. धीरे-धीरे बंद करें और दिल की ओर तेज किनारों को निर्देशित किए बिना रिट्रैक्टर को हटा दें।
  4. रिबकेज और मांसपेशियों की परतों को बंद करने के लिए एक साधारण बाधित पैटर्न में 6-0 प्रोलीन टांके का उपयोग करें।
  5. 6-0 प्रोलीन टांके के साथ छाती को बंद करते समय सांस सांस समारोह के साथ, फेफड़ों को फुलाएं ताकि प्ल्युरल गुहा में अतिरिक्त हवा को हटाया जा सके, जो अन्यथा छाती गुहा में फंस जाएगा और परिणामस्वरूप न्यूमोथोरैक्स हो जाएगा।
  6. सुनिश्चित करें कि छाती कसकर सील है।
  7. आइसोफ्लुरेन को घटाकर 1.0% करें। एक साधारण बाधित पैटर्न में 6-0 प्रोलीन टांके के साथ त्वचा को बंद करें। आइसोफ्लुएंज वाष्पीकरण को बंद कर दें।

6. माउस वसूली

  1. सामयिक रूप से चीरा लगाने के लिए 0.9% खारा में 2 मिलीग्राम/एमएल bupivacaine लागू होते हैं। प्रशासन भी: i) Antisedan (atipamezole) 1 मिलीग्राम/kg; ii) लासिक्स (फ्यूरोस्माइड) 8 मिलीग्राम/किलो; iii) चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से 0.9% खारा समाधान के 600 माइक्रोन।
    नोट: एंटीसेडन एनेस्थेटिक को अधिक तेजी से रिवर्स करना है; फ्यूरोस्माइड कार्डियक आउटपुट समझौते और दवा इंजेक्शन के साथ प्रशासित अतिरिक्त तरल पदार्थ के कारण अतिरिक्त तरल पदार्थ को ऑफलोड करना है।
  2. माउस की निगरानी करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि इंडसबेशन ट्यूब से माउस को हटाने के लिए स्वतंत्र श्वास मनाया न जाए।
  3. जब माउस एक पर्याप्त द्विपक्षीय श्वास दर और गहराई को दर्शाता है और एक पैर की अंगुली चुटकी का जवाब देता है, एक साफ वसूली पिंजरे में माउस एक गर्मी पैड पर रखा जगह है ।
  4. नम भोजन (चबाने के लिए गीला), एक पानी की बोतल और पोषक तत्व/हाइड्रेटिंग जेल के साथ माउस प्रदान करें । एक अतिरंजित श्वास प्रयास, अत्यधिक रक्तस्राव, या अन्य संभावित जीवन-धमकी जटिलताओं के लिए निगरानी करें।
  5. अगले तीन दिनों के लिए, 0.08 मिलीग्राम/किलो टेमवेट (बुप्रेनोरफिन) को चमड़े के नीचे या इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से 0.9% खारा के 0.1 मिलील में प्रशासित करें, फिर प्रक्रिया के बाद पांचवें दिन तक एक बार दैनिक।
  6. लड़ व्यवहार को रोकने whilst अलगाव को रोकने के लिए पिंजरे डिवाइडर से अलग जोड़े में घर चूहों । चूहों की निगरानी कम से कम प्रयोगों के अंत तक (28 दिन) उनकी भलाई और निगरानी की बढ़ी हुई आवृत्ति पर करीब से ध्यान देने के साथ यदि कोई चिंताएं हैं।

Representative Results

प्रत्यारोपण में, कमरे के तापमान पर पैच की चिपचिपाहट (अतिरिक्त क्रॉसलिंकर लागू किए बिना) ने इसे दिल की आकृति(चित्रा 1)पर 'कपड़ा' करने और हृदय चक्र के साथ गतिशील रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति दी। सर्जरी के बाद, हमने वीवो में 28 दिनों के लिए पैच छोड़ दिए क्योंकि अध्ययनों से यह एक उपयुक्त समय अवधि पाई गई है जो मेजबान कार्डियक फंक्शन3,,4 पर पैच प्रभाव के लिए अनुमति देता है (हालांकि यह बताया गया है कि प्रत्यारोपण के तीन महीने बाद तक पूर्ण कार्यात्मक प्रभाव नहीं देखा जा सकता है)22। चित्रा 1 में एक माउस दिल पर सीटू में दिखाया पैच की तस्वीर आवेदन के तुरंत बाद लिया गया था, प्रत्यारोपण में दिल पर कपड़ा करने के लिए पैच की क्षमता दिखा । इस प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है कि हाइड्रोगेल पैच को दिल की आकृति को ढालने की अनुमति देता है और जहां अत्यधिक तनाव हुआ हाइड्रोगेल चित्र 1 में नंगे (हाइड्रोगेल-मुक्त) त्रिकोणीय क्षेत्र द्वारा दिखाए गए रूप में विभाजित करने में सक्षम था (छवि में एक काले तारे द्वारा इंगित)। जीवित रहने के डेटा (Kaplan-Meier अस्तित्व घटता) एक नकली प्रक्रिया के दौर से गुजर चूहों की तुलना में चित्रा 2 में दिखाया गया है (एक सुई और पैर की रक्षा के तहत एक सुई और सीवन के पारित होने के बिना बंधन के बाद माउस छाती के बंद होने के बाद) ।

Figure 1
चित्रा 1: एक बायोप्रिंटेड कार्डियक पैच C57BL6 माउस दिल के एपिकार्डियम पर लागू होता है। एक 10 मिमी x 10 मिमी x 0.4 मिमी बायोप्रिंटेड पैच (प्रत्यारोपण के तुरंत बाद) जिसमें हाइड्रोजेल (एल्गिनेट 4% (w/v)/जिलेटिन 8% (w/v) मीडिया में दिखाया गया है और एपिकार्डियल सतह (सफेद एरोहेड और बिंदीदार लाइनें = पैच की सीमा) का पालन किया जाता है। पैच चिपचिपाहट यह दिल की आकृति को ढालना करने के लिए अनुमति देता है और जहां अत्यधिक तनाव बेहतर पहलू पर हुई पैच एक त्रिकोणीय नंगे हाइड्रोजेल (ब्लैक स्टार) द्वारा कवर नहीं क्षेत्र बनाने के लिए विभाजित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 28 दिनों के बाद एमआई के माध्यम से Kaplan-Meier अस्तित्व विश्लेषण । प्रक्रियात्मक समूह में नौ चूहों (n = 38) 24% की एक समग्र मृत्यु दर देने के लिए मर गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: वीडियो स्टिल इमेज (वीडियो टाइम पॉइंट 01:54 - 01:55) बाएं अर्क (बाएं अलिंद उपांग) दिखाता है। तीर बाएं अर्क के अनुमानित सिरे की ओर इशारा करता है जो दिल के बेहतर बाएं किनारे पर त्रिकोणीय संरचना के रूप में दिखाई देता है। यदि बालक स्पष्ट रूप से कल्पना नहीं करता है, तो बाएं ऑरिकल की नोक को लाड के तहत एक सीवन पास करने के लिए सुई प्रवेश के लिए एक मील का पत्थर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रवेश बिंदु 1 मिमी अवर और मध्यांतर है जो बाएं अर्क की नोक दिल के गतिशील आंदोलनों के दौरान पहुंचती है (काला तीर बाएं अर्क के अनुमानित टिप दिखाता है)। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह विधि ऑपरेटर को स्थायी बालक लिगेशन के बाद एक इनफार्टेड माउस हार्ट की एपिकार्डियल सतह पर लागू करके एक बायोप्रिंटेड पैच को कुशलतापूर्वक प्रत्यारोपण करने की सुविधा प्रदान करती है। इस व्यवहार्यता केंद्रित विधि में, हम प्रति कार्य दिवस आठ चूहों पर इस प्रक्रिया को करने में सक्षम हैं (पहले और बाद में कमरे की तैयारी सहित)। छह-अच्छी प्लेटों के कुओं में आठ 1 सेमी2 पैच का उत्पादन करने वाला बायोप्रिंटिंग रन 2-3 घंटे लेता है (पहले और बाद में तैयारी का समय शामिल है)। हम अपने पैच के लिए स्कूप के रूप में एक शल्य खोपड़ी पैकेट के अंदर बाँझ इस्तेमाल किया है, जो आसानी से सुलभ है और आम तौर पर ंयूनतम लागत कहते हैं, एल्गिनेट के प्राकृतिक चिपकने वाला गुणों का उपयोग/ हमारे अनुभव में, चूहों में बालक बंधन के लिए प्रोटोकॉल ऑपरेटर निर्भर है और 28 दिनों में कम मृत्यु दर एक मॉडल में विशेषज्ञता प्राप्त अनुभवी ऑपरेटरों के साथ प्राप्त की जा सकती है। वैन डेन बोर्न एट अल16 ने बताया कि C57BL6 चूहों एक पैच के आवेदन के बिना 28 दिनों में स्थाई बालक बंधन के बाद एक ४४% मृत्यु दर मौजूद है, जो 30% की ऊपरी सीमा से अधिक है कि हम विधि के साथ मनाया ।

इंडबेशन चरण महत्वपूर्ण है और चूहों के लिए मृत्यु का एक स्रोत हो सकता है जब तक कि एक कुशल ऑपरेटर द्वारा प्रदर्शन न किया जाए। यह श्वासनली के छोटे आकार के कारण मुश्किल बना दिया है, यही वजह है कि इस कदम के लिए ऑपरेटर द्वारा आवर्धक चश्मा पहना जाता है। हम एनेस्थेटिक को शामिल करने के लिए इंजेक्शन केटामाइन/जाइलाज़ीन के साथ-साथ साँस आइसोफ्लोरेन का उपयोग करते हैं ताकि माउस प्रत्येक दवा की अपेक्षाकृत कम खुराक पर गहराई से संवेदनाहारी हो। इसलिए, इस इंडिबेशन चरण के दौरान माउस को जागने के लिए कोई जोखिम नहीं है लेकिन उच्च एकल दवा खुराक से जुड़ी उच्च मृत्यु दर से बचा जाता है। एट्रोपाइन को ब्रैडीकार्डिया और हाइपरसैलिवेशन जैसे साइड इफेक्ट्स का प्रतिकार करने के लिए भी दिया गया था। गले पर लागू स्पॉटलाइट का उपयोग बाहरी रूप से श्वास नली को आंतरिक रूप से रोशनी करता है, इसलिए यह अधिक दिखाई देता है और मुखर रस्सियों को माउस की श्वसन दर (आमतौर पर ~ 120 सांस प्रति मिनट) के साथ खोलने और बंद करने की कल्पना की जानी चाहिए। यह माउस को पूरी तरह से स्थिति में रखने के लिए महत्वपूर्ण है (यही कारण है कि इस चरण के लिए माउस के नीचे एक वार्मिंग चटाई के बजाय एक कठोर सतह को पसंद किया जाता है) एक लूप धागे द्वारा आयोजित दो चीरा दांतों के साथ और जीभ मुंह खोलने और श्वासनली की कल्पना करने के लिए कुंद बलपीएस/स्पैटुला की जोड़ी के साथ बेहद धीरे से मुकर गई। एक बार इंडबेशन पूरा हो जाने के बाद, ऑपरेटर को सावधान रहना चाहिए कि इंडूबेशन क्षेत्र से ऑपरेटिंग बेड में स्थानांतरण में ट्यूब को उखाड़ न दिया जाए (जिसमें हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए इसके नीचे एक गर्मी चटाई है)। श्वास नली को वेंटिलेटर उपकरण से जोड़ते समय, ट्यूब को एक हाथ से स्थिर करना और वेंटिलेटर सर्किट को दूसरे के साथ जोड़ना महत्वपूर्ण है, ताकि ट्यूबिंग के वेंटिलेटर सेगमेंट को जोड़ते समय श्वास नली की न्यूनतम गति हो जैसे कि इसे श्वास नली में अधिक गहराई से धकेलना।

इस अध्ययन में, हमने दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में एल्गिनेट 4% (w/v) /जिलेटिन 8% (w/v) का उपयोग किया । एल्गिनेट/जिलेटिन हाइड्रोगेल उनकी जैव अनुकूलता, कम लागत और बायोमैकेनिकल गुणों के लिए जाने जाते हैं जो उन्हें 3 डी ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों23के लिए उपयोगी बनाते हैं । इन हाइड्रोगेल को कैल्शियम आयनों को जोड़कर हल्के जेलेशन द्वारा क्रॉसलिंक किया जा सकता है, जो चिपचिपाहट को बदलने की अनुमति देता है। बायोप्रिंटिंग के बाद, हमने पैच पर फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में कैल्शियम क्लोराइड (सीएसीएल2)2% (w/v) लागू किया और फिर उन्हें प्रत्यारोपण करने से पहले 7-14 दिनों के लिए छह अच्छी प्लेटों में डीएमईएम में सुसंस्कृत किया। यह हृदय कोशिकाओं युक्त पैच के बाद इष्टतम खिड़की थी संस्कृति में हरा करने के लिए शुरू कर दिया, लेकिन इससे पहले कि पैच बिखर शुरू कर दिया । जबकि सीएसीएल2 को पैच विघटन को कम करने के लिए बायोप्रिंटिंग चरण में नियमित रूप से जोड़ा जा सकता है, हमने पाया कि हाइड्रोगेल की आंतरिक चिपचिपाहट पैच के लिए पर्याप्त थी ताकि सीएसीएल2की केवल एक प्रारंभिक खुराक के साथ प्रत्यारोपण तक उनकी संरचना को बनाए रखा जा सके।

टांके के बिना सफल प्रत्यारोपण के लिए अनुमति दी विधि (जो दिल को नुकसान पहुंचा सकता है) या गोंद (जो पैच और दिल के बीच इंटरफेस को अवरुद्ध कर सकता है)। भविष्य के अध्ययन इस परिकल्पना की पुष्टि कर सकते हैं कि टांकेरहित और ग्लूलेस प्रत्यारोपण चूहों में एनग्रेफ्टमेंट को नकारात्मक रूप से प्रभावित नहीं करता है क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि पैच दिल से फिसल नहींता है या फेफड़ों में हस्तक्षेप नहीं करता है। पैच-आधारित मरम्मत3 के साथ स्थायी बालक लिगेशन मॉडल में पैच के engraftment का आकलन करने वाले अन्य अध्ययनों ने 24 समय के साथ शेष एंग्रीफ्ट क्षेत्र(मिमी2)मापा है, ग्राफ्टेड पैचमोटाई (माइक्रोन) समय 25के साथ पुनः प्राप्त है, मात्राकरण पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर)26 या बायोल्यूमिनेसेंस फोटॉन उत्सर्जन प्रवाह द्वारा प्रत्यारोपित कोशिकाओं लेबल लाइव डोनर कोशिकाओं (प्रति सेकंड उत्सर्जित फोटॉनों का एक उपाय जो समय के साथ जीवित जानवरों में जीवित लेबल कलम कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं)27. . . भविष्य के अध्ययन इन तरीकों का उपयोग आगे मूल्यांकन करने के लिए कर सकते हैं कि क्या टांकेरहित और ग्लूलेस प्रत्यारोपण पैच एनग्रेक्शन (साथ ही मेजबान मायोकार्डियम पर संरचनात्मक और कार्यात्मक प्रभाव) को प्रभावित करता है। फिर भी, हमारे इम्यूनोसंप्यूटेंट चूहों में वीवो में 28 दिनों के बाद मैक्रोकॉपिकल रूप से, पूर्वकाल मध्यस्थ मध्यस्थ ने चर फाइब्रिनस सामग्री और आसंजन प्रस्तुत किया। पैच-आधारित हृदय उत्थान का तंत्र मेजबान मैक्रोफेज भड़काऊ प्रतिक्रियाओं19 या स्रावित इम्यूनोलॉजिकल कारकों20 के बजाय संख्यात्मक कोशिका पुनःपूर्ति की उत्तेजना से हो सकता है। यदि सूजन सकारात्मक भूमिका निभाती है, तो विदेशी हाइड्रोजेल सामग्री की उपस्थिति फायदेमंद हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, विदेशी सामग्री की उपस्थिति को कम करने के लिए यह फायदेमंद हो सकता है यदि हाइड्रोगेल घटक समय के साथ विघटित हो जाता है। वास्तव में, कुछ दृष्टिकोण बायोमैटेरियल्स का उपयोग करते हैं जो शुरू में कोशिकाओं का समर्थन करते हैं और फिर विघटित हो जाते हैं, केवल ऊतक28, 29,को छोड़देतेहैं। भविष्य के अध्ययन पूरी तरह से पैच engraftment का विश्लेषण करने और बेहतर पैच आधारित हृदय उत्थान के पीछे तंत्र को समझने के लिए मानवपरीक्षणों केलिए अनुवाद से पहले अनुकूलित प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं 2 ।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल व्यापक रूप से व्यवहार्य होने की संभावना है और विभिन्न सेलुलर सामग्री के साथ उदाहरण के लिए 3 डी बायोप्रिंटेड पैच के कई समूहों का परीक्षण करने के लिए भी अनुकूल है। इस विधि के लिए भविष्य के निर्देशों में बड़े पशु मॉडलों पर आगे बढ़ने से पहले अनुकूलन के लिए, वीवो में पहले परीक्षण नहीं किए गए उन्नत हाइड्रोगेल वाले पैच की बायोप्रिंटिंग या विभिन्न ऑटोलॉगस या एलोजेनिक स्टेम सेल-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रभावों का परीक्षण करना शामिल है।

Disclosures

कोई नहीं.

फंडिंग स्टेटमेंट:

क्रिस्टोफर डी रोशे को सर जॉन लोवेनहाल स्कॉलरशिप 2019 (सिडनी विश्वविद्यालय), ले ग्रोस लिगेसी फंड न्यूजीलैंड (पीएचडी012019) और हार्ट रिसर्च ऑस्ट्रेलिया पीएचडी स्कॉलरशिप (2019-02) द्वारा समर्थित किया गया था। कारमाइन गेंटाइल को सिडनी किक-स्टार्ट ग्रांट, यूनिवर्सिटी ऑफ सिडनी चांसलर डॉक्टोरल इंसेंटिव प्रोग्राम ग्रांट, यूटीएस सीड फंडिंग, कैथोलिक आर्कसूबा ऑफ सिडनी ग्रांट फॉर एडल्ट स्टेम सेल रिसर्च और सिडनी मेडिकल स्कूल फाउडेशन कार्डियोथोरेसिक सर्जरी रिसर्च ग्रांट का समर्थन मिला ।

Acknowledgments

गैर सर्जिकल फुटेज और सभी वीडियो संपादन की रिकॉर्डिंग के लिए नेटली जॉनसन के लिए धन्यवाद के साथ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-0 non-absorbable black braided treated silk Ethicon 232G
6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament Ethicon 8805H
7-0, 18” (45 cm) silk black braided Ethicon 768G
Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification Olympus SZ 3060 STU1
Anitisedan (atipamezole) Zoetis N/A
Atropine sulphate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack Symbion Pharmacy Services ATRO S I2
Bupivacaine, 20 mL, 5 vials Baxter Heathcare BUPI I C01
Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle Troy Laboratories TEMV I 10
Curved-tip forceps Kent Scientific INS650915-4 Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel.
Dissecting scissors for cutting muscle/skin Kent Scientific INS600393-G Dissecting scissors, straight, 10 cm long
Endotracheal intubation kit Kent Scientific ETI-MSE Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula
Fine scissors Kent Scientific INS600124 McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel.
Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack Sigma Company LASI A 1
Heat pad for animal recovery post-op Passwell PAD Passwell Cosy Heat Pad for Animals - 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover
Ketamine 100 mg, 50 mL CEVA Animal Heath KETA I 1
Needle holder Kent Scientific INS600137 Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock
PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator Kent Scientific PS-MVG
Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) Dechra 17033-211-38
Self-retaining toothed mouse retractor Kent Scientific INS600240 ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long
Straight forceps Kent Scientific INS650908-4 Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel.
Surgical magnifying glasses Kent Scientific SL-001
VetFlo vaporizer Kent Scientific VetFlo-1205S-M
Xylazine 100 mg, 50 mL Randlab XYLA I R01

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 163 3 डी बायोप्रिंटेड कार्डियक पैच स्थायी बालक लिगेशन वीवो माउस मॉडल में हृदय विफलता मायोकार्डियल इंफार्क्शन कार्डियक पुनर्जनन प्रत्यारोपण
मायोकार्डियल इंफार्क्शन के मुरीन मॉडल में 3डी बायोप्रिंटेड पैच का प्रत्यारोपण
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Roche, C. D., Gentile, C. Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction. J. Vis. Exp. (163), e61675, doi:10.3791/61675 (2020).

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