Method Article

Hochdurchsatz- und Tiefenproteom-Profilierung durch 16-Plex-Tandem-Massenmarkierung in Verbindung mit zweidimensionaler Chromatographie und Massenspektrometrie

DOI:

10.3791/61684

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August 18th, 2020

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1Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorgestellt wird ein optimiertes Hochdurchsatzprotokoll, das mit 16-Plex-Tandem-Massentag-Reagenzien entwickelt wurde und eine quantitative Proteomprofilierung biologischer Proben ermöglicht. Die umfangreiche basische pH-Fraktionierung und die hochauflösende LC-MS/MS mildern die Kompression des Verhältnisses und sorgen für eine tiefe Proteomabdeckung.

Abstract

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Die isobare Tandem-Mass-Tag-Markierung (TMT) wird in der Proteomik aufgrund ihrer hohen Multiplexing-Kapazität und ihrer tiefen Proteomabdeckung häufig eingesetzt. Vor kurzem wurde eine erweiterte 16-Plex-TMT-Methode eingeführt, die den Durchsatz von Proteomstudien weiter erhöht. In diesem Manuskript stellen wir ein optimiertes Protokoll für die 16-Plex-TMT-basierte Tiefenproteom-Profilierung vor, einschließlich Proteinprobenvorbereitung, enzymatischem Verdau, TMT-Markierungsreaktion, zweidimensionaler Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (LC/LC)-Fraktionierung, Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) und computergestützter Datenverarbeitung. Die entscheidenden Schritte der Qualitätskontrolle und Verbesserungen im Prozess, die für die 16-Plex-TMT-Analyse spezifisch sind, werden hervorgehoben. Dieses Multiplexverfahren bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die Profilierung einer Vielzahl komplexer Proben wie Zellen, Gewebe und klinischer Proben. Mehr als 10.000 Proteine und posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung und Ubiquitinierung in hochkomplexen biologischen Proben aus bis zu 16 verschiedenen Proben können in einem einzigen Experiment quantifiziert werden, was ein wirksames Werkzeug für die Grundlagen- und klinische Forschung darstellt.

Introduction

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Schnelle Entwicklungen in der Massenspektrometrie haben es ermöglicht, eine hohe Empfindlichkeit und eine tiefe Proteomabdeckung in Proteomik-Anwendungen zu erreichen 1,2. Trotz dieser Entwicklungen bleibt das Stichprobenmultiplexing der Engpass für Forschende, die sich mit der Analyse einer großen Stichprobenkohorte befassen.

Multiplex-isobare Markierungstechniken werden in großem Umfang für die proteomweite relative Quantifizierung großer Probenchargen eingesetzt 3,4,5,6.

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Protocol

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Menschliches Gewebe für die Studie wurde mit Genehmigungen des Gehirn- und Körperspendeprogramms des Banner Sun Health Research Institute gewonnen.

1. Proteinextraktion aus Gewebe und Qualitätskontrolle

HINWEIS: Um die Auswirkungen der Probenentnahme auf das Proteom zu reduzieren, ist es entscheidend, die Proben möglichst in kürzester Zeit bei niedrigen Temperaturen zu entnehmen31. Dies ist besonders wichtig bei der Analyse posttranslationaler Modifikationen, da sie typischerweise labil sind, z. B. haben einige Phosphorylierungsereignisse nur wenige Sekunden....

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Results

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Das Protokoll für das neu entwickelte TMT16, einschließlich Markierungsreaktion, Entsalzung und LC-MS-Bedingungen, wurde systematisch optimiert41. Darüber hinaus haben wir die 11-Plex- und 16-Plex-Methoden direkt verglichen, indem wir sie zur Analyse derselben menschlichen AD-Proben verwendet haben41. Nach Optimierung der Schlüsselparameter für TMT16 liefern sowohl die TMT11- als auch die TMT16-Methode eine ähnliche Proteomabdeckung, -identifizierung und -quantifizierung &g.......

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Discussion

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Ein optimiertes Protokoll für TMT16-basiertes tiefes Proteom-Profiling wurde in früheren Publikationen erfolgreich implementiert 12,13,41. Mit dem aktuellen Protokoll können mehr als 10.000 einzigartige Proteine aus bis zu 16 verschiedenen Proben in einem einzigen Experiment routinemäßig und mit hoher Präzision quantifiziert werden.

Um qualitativ hochwertige Ergebniss.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, RF1AG064909 und U54NS110435) und ALSAC (American Lebanese Syrian Associated Charities) unterstützt. Die MS-Analyse wurde im Zentrum für Proteomik und Metabolomik des St. Jude Children's Research Hospital durchgeführt, das teilweise durch den NIH Cancer Center Support Grant (P30CA021765) unterstützt wird. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% Kriterium TGX Precast Midi Protein GelBiorad5671035
10X TGS (Tris/Glycin/SDS) PufferBioRad161-0772
4– 20% Kriterium TGX Precast Midi Protein GelBiorad5671095
50% HydroxylaminThermo Scientific90115
6 x SDS ProbenladepufferBoston Bioproducts IncBP-111R
Ammoniumformiat (NH4COOH)Sigma70221-25G-F
Ammoniumhydroxid, 28%Sigma338818-100ml
Kugel BlenderNext AdvanceBB24-AU
Butterfly Portfolio HeizungPhoenix S& TPST-BPH-20
C18 ZiptipsHarvard Gerät74-4607Wird zum Entsalzen von
Dithiothreitol (DTT)verwendetSigmaD5545
DMSOSigma41648
AmeisensäureSigma94318
FraktionssammlerGilsonFC203B
Gel Code Blue FleckenreagenzThermo24592
GlasperlenNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
HPLC Grade AcetonitrilBurdick & JacksonAH015-4
HPLC Grade WasserBurdick & JacksonAH365-4
Iodacetamid (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
MassenspektrometerThermo ScientificQ Exactive HF
MassPrep BSA Aufschluss StandardWasser186002329
MethanolBurdick & JacksonAH230-4
Nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
ReproSil-Pur C18 Harz, 1,9 umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Self-Pack SäulenNeues ObjektivPF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mgWasserWAT054960Zur Entsalzung
NatriumdesoxycholatSigma30970
SpeedvacThermo ScientificSPD11V
TMTpro 16plex EtikettenreagenziensetThermo ScientificA44520
Trifluoressigsäure (TFA)Angewandte Biosysteme400003
TrypsinPromegaV511C
Ultra-Mikro-Spin-Säule, C18Harvard-Gerät74-7206Wird zum Entsalzen
Harnstoffverwendet SigmaU5378
Xbridge Säule C18 SäuleWasser186003943Wird für basische pH-LC verwendet
von von

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levy, M. J., Washburn, M. P., Florens, L. Probing the sensitivity of the orbitrap lumos mass spectrometer using a standard reference protein in a complex background. Journal of Proteome Research. 17 (10), 3586-3592 (2018).
  2. Bekker-Jensen, D. B., et al.

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16 plex TMT LabelingTandem Mass TagTwo dimensional ChromatographyMass SpectrometryProteome ProfilingProtein Sample PreparationEnzymatic DigestionLC LC FractionationTandem Mass SpectrometryComputational Data Processing
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