ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
虽然与DNA加合物的复制叉碰撞可以诱导双链断裂，但对爬酶体和阻断病变之间的相互作用知之甚少。我们采用邻近连接测定来可视化这些遭遇并表征对重复体组成的影响。
Abstract
对由核酸酶、辐射和其他 DNA 破坏者诱导的双链断裂 （DSB） 的细胞反应存在相当多的见解。这在一定程度上反映了识别断裂位点的方法的可用性，以及这些序列中招募到DSB的因素的特征。然而，DSB在加工由不直接引起断裂且不在特定序列位点反应的化合物形成的DNA加合物的过程中也作为中间体出现。因此，对于大多数这些药物，允许分析与反应因子和修复蛋白的结合相互作用的技术是未知的。例如，DNA链间交联（ICL）可以在复制叉遭遇后引起断裂。虽然由被广泛用作癌症化疗药物的药物形成，但没有监测它们与复制蛋白相互作用的方法。
在这里，我们描述了我们用这些具有挑战性的加合物跟踪细胞对叉子碰撞的反应的策略。我们将类固醇抗原与补骨脂素联系起来，补骨脂素在活细胞核中形成光活化依赖性ICL。通过针对抗原标签的免疫荧光观察ICL。该标签也可以是邻近连接测定（PLA）的合作伙伴，该测定报告两种抗原的密切关联。PLA被用来区分与标记的ICL密切相关的蛋白质和不与标记ICL密切相关的蛋白质。可以定义在遇到ICL后保留的复制体蛋白质，并识别其他丢失的蛋白质。这种方法适用于任何可以通过免疫学检测的结构或DNA加合物。
Introduction
细胞对双链断裂的反应有据可查，因为一系列越来越强大的方法将断裂引导到特定的基因组位点1，2，3。位置的确定性能够明确表征在位点积累并参与DNA损伤反应（DDR）的蛋白质和其他因子，从而驱动修复断裂的非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）途径。当然，许多中断是由不攻击特定序列的辐射和化学物质等因素引入的4.但是，对于这些，有一些程序可以将末端转换为适合标记和本地化的结构5，6。生物过程也引入了断裂，例如免疫球蛋白重排，最近的技术允许它们的定位，以及7。然后可以确定响应因素与这些站点之间的关系。
断裂也作为由化合物形成的加合物的间接结果出现，这些化合物不是固有的破坏者，而是破坏DNA交易，如转录和复制。它们可能是细胞对这些障碍物的反应的一个特征，可能是在修复过程中，或者因为它们引发了易受核酸酶攻击的结构。通常，加合物、断裂以及与响应因子的关联之间的物理关系是推断性的。例如，ICL由顺铂和丝裂霉素C8等化疗药物形成，并作为非碱性位点9的反应产物。众所周知，ICL是复制叉10的有效阻断，从而阻止可以被核酸酶11切割的叉。链之间的共价连接通常通过作为中间体12，13具有专性断裂的途径来缓解，因此需要同源重组以重建复制叉14。在大多数实验中，研究者遵循感兴趣的因素对复制叉与ICL碰撞下游形成的断裂的反应。然而，由于尚无定位激发性病变的技术，因此只能假设重复体及其组成部分与ICL的接近程度。
我们已经开发了一种策略，能够分析蛋白质与非序列特异性共价加合物的关联，此处由ICL说明。在我们的系统中，这些是由补骨脂素引入的，补骨脂素是一种光活性天然产物，数千年来一直用作治疗皮肤病的方法15。我们的方法基于补骨脂素的两个重要特征。首先是它们的交联形成频率高，可以超过90%的加合物，而顺铂或丝裂霉素C8，16等流行化合物形成的不到10%。第二个是化合物在不损失交联能力的情况下进行偶联。我们已经将三甲基补骨脂素与地高辛（Dig）共价连接，地高辛是一种长期建立的免疫标签。这可以通过对 Dig 标签进行免疫染色来检测基因组 DNA 中的补骨脂素加合物，并通过常规免疫荧光17 进行可视化。
在我们以前的工作中，该试剂被应用于使用基于DNA纤维的测定法16分析与ICL的复制叉遭遇。在这项工作中，我们发现复制可以通过完整的ICL继续。这取决于ATR激酶，它被复制应激激活。考虑到 CMG 复制解旋酶的结构，复制重新启动是意外的。它由MCM异质六聚体（M）组成，其在模板链周围形成一个偏移间隙环，用于前导链合成，该链被GINS复合物（G，由PSF1，2，3和SLD5组成）和CDC45（C）18的蛋白质锁定。复制可以在回复体碰撞侧远端的ICL一侧重新开始的提议主张改变回复体的结构。为了解决在遇到ICL时哪些组件在回复中的问题，我们开发了此处描述的方法。我们利用 Dig 标签作为邻近连接测定 （PLA）19 的合作伙伴来询问 ICL 与20 爬发体蛋白质的密切关联。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 细胞制备
- 第一天
- 用细胞粘合剂溶液预处理 35 mm 玻璃底培养皿。
- 在治疗前一天将细胞铺在预处理的培养皿中。细胞应在实验当天积极分裂和50-70%汇合。
注意：HeLa细胞用于本实验，使用Dulbecco修饰的鹰培养基DMEM，补充有10%胎牛血清，1x青霉素/链霉素。对贴壁细胞系没有限制。然而，在PLA分析之前，必须将非贴壁细胞离心到载玻片上并固定。
- 第二天
- 通过在 1：1 EtOH：H2O 中重悬先前合成的 Dig-TMP 的冷冻等分试样来制备地高辛三甲基补骨脂素 （Dig-TMP） 的储备溶液。Dig-TMP的消光系数为25，000。每次使用前通过测量 250 nm 处的 OD 来验证浓度并计算原液浓度：Abs x 100 x 106/25，000 = 浓度（单位为 μM）。通常，储备溶液约为 3 mM。该溶液可在–20°C下储存约一个月。
注意：Dig-TMP必须按照此处描述的过程提前化学合成。将4'-氯甲基-4，5'，8-三甲基补骨脂素与4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺在甲苯中氮气下回流12小时。除去溶剂，用硅胶色谱法回收4'-[N-（13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷）]氨甲基-4，5'，8-三甲基补骨脂素产物。将产物与地高辛NHS酯在二甲基甲酰胺和三乙胺中的偶联在50°C下18小时。除去溶剂，通过制备薄层硅胶色谱法纯化残留物。洗脱产物带氯仿：甲醇：28%氢氧化铵（8∶1∶0.1）混合物。蒸发溶剂并将沉淀溶解在50%EtOH：H2O中。 - 将50%EtOH：H2O中的Dig-TMP储备液加入细胞培养基中，终浓度为5μM。 从板中吸出培养基，加入预热的含有Dig-TMP的培养基，并将板置于培养箱（37°C，5%CO2）中30分钟以使Dig-TMP平衡。
- 当细胞孵育时，将UV盒（见 材料表）预热至37°C。
- 将板放在预热的UV盒中，并将细胞暴露在3J /cm 2 的UVA光下5分钟以进行本实验。在照射期间，将板放置在保持在37°C的热块的顶部。使用以下公式计算时间：
- 使用移液管吸出培养基，加入新鲜的预热培养基，并将板放回培养箱中，温度为37°C，5%CO21 小时。
- 取出培养基，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻清洗餐具一次。
- 除去PBS，并在室温（RT）下在PBS中加入0.1%甲醛（FA）5分钟。这可以防止在提取细胞质元件和降低PLA背景所需的CSK-R（含有RNase的细胞骨架提取缓冲液，如1.2.9中所述）预处理期间细胞脱离。
- 吸出FA并用PBS洗碗一次。
- 加入CSK-R缓冲液并在室温下孵育5分钟以除去细胞质[CSK-R缓冲液：10mM PIPES，pH 7.0，100mM NaCl，300mM蔗糖，3mM MgCl2，0.5%Triton X-100，300μg/ mL RNase A]。吸出缓冲液，加入新鲜的CSK-R，并在室温下孵育5分钟。
注意：CSK缓冲液的库存可以储存在4°C，并在使用前添加Triton X和RNaseA。 - 用PBS清洗三次。
- 用4%甲醛在PBS中固定细胞在室温下10分钟。
- 用PBS清洗细胞。执行此步骤三次。
- 加入冷的100%甲醇，在-20°C孵育20分钟。
- 用PBS清洗细胞三次。此时，细胞可以在4°C的潮湿室中储存在PBS中长达一周。
- 将细胞在80μL的5mM TritonX-100中在4°C下孵育10分钟。
- 在补充有1μL 100 mg / mL RNase A的PBS中用100μL 5mM EDTA在37°C孵育细胞30分钟。
- 用PBS清洗细胞三次。
- 将细胞储存在封闭缓冲液（5%BSA和PBS中的10%山羊血清）中，在4°C的潮湿室中过夜。
- 通过在 1：1 EtOH：H2O 中重悬先前合成的 Dig-TMP 的冷冻等分试样来制备地高辛三甲基补骨脂素 （Dig-TMP） 的储备溶液。Dig-TMP的消光系数为25，000。每次使用前通过测量 250 nm 处的 OD 来验证浓度并计算原液浓度：Abs x 100 x 106/25，000 = 浓度（单位为 μM）。通常，储备溶液约为 3 mM。该溶液可在–20°C下储存约一个月。
2. 邻近连接试验
注意：在第3天进行邻近连接测定。
- 抗体染色
- 每板制备 40 μL 一抗溶液：加入适量的一抗以获得所需的稀释度（小鼠抗地高辛和兔抗体针对重复体组分，如 MCM5、CDC45、PSF1 或 pMCM2， 材料表中指定的稀释度）到封闭缓冲液中（以达到 24 μL 的最终体积）。通过敲击混合，让它在室温下静置20分钟。 为多个样品准备预混液，并在应用于孔之前通过敲击混合。
- 向孔中心加入40μL一抗溶液，并在37°C下在潮湿的室中孵育1小时。 在染色过程中，让PLA探针和封闭缓冲液升温至室温。
- 在室温下用 PBS-T [PBS-T：0.05% 吐温-20 在 1X PBS 中] 洗涤细胞。 执行此步骤三次。
- 洗涤时，每培养皿准备 40 μL PLA 探针溶液（PLA 探针由识别兔或小鼠 IgG 的二抗组成，共价连接到正寡核苷酸或减寡核苷酸）：8 μL PLA 探针抗小鼠 + 8 μL PLA 探针抗兔减抗体 + 24 μL 封闭缓冲液。混合并在室温下静置20分钟。 为多个样品准备预混液并在施用孔之前充分混合。将溶液放在板中孔的中间。
- 除去最后一次洗涤，向孔中心加入40μLPLA探针溶液，并在37°C下在潮湿的室中孵育1小时。
- 在缓冲液A中洗涤三次，每次10分钟，在室温的倾斜平台上。在洗涤过程中，将连接混合物带到室温。
- 连接和扩增
- 每板制备 40 μL 连接混合物：8 μL （5x） 连接原液 + 31 μL 蒸馏水 + 1 μL 连接酶。为多个板准备预混液，并在施用到孔之前充分混合。
- 向每个板中加入40μL连接溶液，并在37°C的潮湿室中孵育30分钟。
- 用缓冲液A洗涤细胞3次，每次2分钟，在室温的倾斜平台上。
- 每培养皿制备 40 μL 扩增溶液：8 μL （5x） 扩增原液 + 31.5 μL 蒸馏水 + 0.5 μL DNA 聚合酶。为多个样品准备预混液，并在施用孔之前充分混合。
- 向每个板中加入40μL扩增溶液，并在37°C的潮湿室中孵育100分钟。
- 吸出扩增溶液并用缓冲液B洗涤.在室温的倾斜平台上进行6次洗涤，每次10分钟。
- 在室温下用0.01x缓冲液B洗涤一次1分钟。
- 吸出缓冲液B并将板与二抗Alexa Fluor 488抗小鼠IgG和Alexa Fluor 568抗兔IgG在封闭溶液中以适当的稀释度在封闭溶液中孵育，在潮湿的室内，在37°C下30分钟或在4°C下过夜。
- 用PBS-T洗涤细胞三次，每次在室温的倾斜平台上洗涤10分钟。
- 吸出 PBS-T 并使用 DAPI 安装在安装介质中。安装的板可以立即成像或在成像前在4°C的黑暗中储存不超过4天。
3. 成像和定量
- 在落射荧光或共聚焦显微镜中进行成像（如果需要3D成像，请在15个堆叠中覆盖至少3μm）。一式三份执行实验，并对足够数量的场进行成像，以便每个样本或条件至少进行 100 次观察。使用相同的曝光设置对所有场和样本（包括对照）进行成像。
- 使用适当的图像分析软件进行量化（有关能够在单个或多个平面图像中执行此分析的开源和商业软件，请参阅 材料表 ）。
- 基于 DAPI 染色的分段细胞核。对核聚乳酸点进行检测。将PLA点分配给其相应的原子核。将每个原子核结果的PLA点导出为csv文件（参见补充 文件1 和 补充文件2）。
- 统计分析（建议的开源和商业软件见 材料表 ）。
- 使用夏皮罗-威尔克检验验证样本是否服从正态分布。
- 使用 Student-t 检验（如果满足正态分布假设）或 Wilcoxon-秩和检验（如果违反样本的正态分布假设）确定两个样本之间是否存在显著差异。
- 数据可视化：生成点图与箱线图相结合，以可视化不同样本的数据分布、中位数 （Q2）、第 25个 （Q1） 和第 75个 百分位数（有关建议的开源和商业软件，请参阅 材料表 ）。
4.3D pMCM2的显示：ICL相互作用
- 使用Plan Fluor 60x/1.25数值孔径油物镜在转盘共聚焦显微镜上成像PLA板。采集 16 个覆盖 1.6 mm 的堆栈，并使用适当的图像分析软件生成 3D 重建（参见 材料表）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
具有重复体蛋白的Dig-TMP的PLA
Dig-TMP的结构如图 1所示。合成的细节，其中三甲基补骨脂素通过乙二醇接头与地高辛结合，之前已经讨论过17，21。将细胞与化合物孵育，然后暴露于365nm光（UVA）下，使化合物光活化并驱动交联反应。略多于 90% 的加合物是 ICL16。Dig标签可以通过免疫荧光可视化，从而揭示整个细胞核中ICL的存在（图2）。MCM2等爬生体蛋白的免疫荧光也表明在整个细胞核中的分布，这种分布不受ICL引入的影响。这些结果表明，反应蛋白的焦点外观，如对DSB的DNA损伤反应（DDR）所示，不是回复体的特征：ICL相互作用。
为了可视化图2所示实验中回复体与ICL的相互作用，我们应用了PLA，它报告了两种抗原的接近性（图3a）。我们测量了引入ICL后1小时MCM5和Dig标签的关联频率（图3b）。PLA信号表明回复体接近ICL。
复制应激，包括ICLs呈现的应激，激活ATR激酶22。在ATR的许多底物中，有MCM蛋白，包括丝氨酸10823处的MCM2。与ICL的回复体相遇预计将导致MCM2的磷酸化，以及许多其他底物。根据这一预期，pMCM2Ser108和Dig标签之间的PLA为正（图3c）。在其他实验中，我们发现平台频率在1小时20时达到。我们将这些结果解释为表明，位于整个基因组中且与ICL不同距离的补泌体最终会遇到阻断，触发ATR激活和MCM2磷酸化。
上图中的PLA结果表示为多个光学平面的压缩总和。然而，单个细胞核的结果也可以以三维重建的形式呈现，如 视频1中的pMCM2：Dig-TMP PLA。该分析表明，在整个细胞核中可以观察到与ICL的复制体相遇。
我们对复制分叉的研究表明，ICL遭遇揭示了意外的复制重启现象16。考虑到功能性回复体的锁定环结构，询问复制装置的组成是否在与ICL碰撞时发生变化是相当有趣的。由于只有不到10%的复制叉与ICL接触，因此简单地分析所有复制体的蛋白质组成不会产生效果。但是，Dig 和各个组件之间的 PLA 使我们能够解决这个问题。与pMCM2的阳性结果相反，我们发现GINS复合物的蛋白质未能通过ICL发出PLA信号。另一方面，CDC45的测定呈阳性，表明保留了另一种锁定蛋白（图4a，b）。当细胞与ATR抑制剂孵育时，重新启动被完全抑制，GINS：Dig PLA强烈阳性（图4c）。我们对这些结果的解释是，在没有ATR活性的情况下，GINS蛋白被保留，CMG解旋酶保持锁定配置，并且在ICL20之后没有复制重新开始。
图1：与地高辛抗原标签相连的三甲基补骨脂素的结构。请点击此处查看此图的大图。
图 2：爬发体蛋白 MCM5 和 DIG TMP 的免疫荧光未显示离散病灶。 用Dig-TMP和UVA处理细胞，并在MCM5和Dig免疫染色1小时后。白条代表 5 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：Dig-TMP 和 MCM5 之间的 PLA。 （a）应用于MCM5复制体蛋白与ICL上的Dig标签之间相互作用的邻近连接测定示意图。该方案已简化。在实践中，一抗与寡核苷酸共价偶联的二抗结合。（b） MCM5和Dig-TMP之间的PLA。注意指示相互作用位点的离散信号。点图和箱形图显示信号分布（点图）以及中位数（箱形图红色条）、第 25个 和第 75个 百分位数（框端）以及不包括异常值的最高值和最低值（极值线）。威尔科克森秩和检验证实两种条件之间存在显著差异（p<0.001）。白条代表5μm。 （c） pMCM2和Dig-TMP之间的PLA。这些信号代表爬发体与ICL的相遇，从而触发MCM2的ATR依赖性磷酸化。PLA报告不同细胞中遭遇频率的变化。白条代表 5 毫米。 请点击此处查看此图的大图。
图4：Dig-TMP和重复体锁定蛋白之间的PLA。 （a） CDC45：挖掘TMP。白条代表5微米。 （b） PSF1：Dig-TMP。用ATR抑制剂治疗可大大提高最小信号频率，该抑制剂阻断横移途径和包括PSF1在内的GINS复合物的释放。白条代表 5 μm。 请点击这里查看此图的大图。
视频1：pMCM2的三维重建：挖掘PLA信号展示了整个细胞核的分布。 PCNA被染成绿色，PLA被染成红色，DAPI被染成蓝色。 请点击此处下载此视频。
补充文件1：用于PLA定量的细胞分析器管道。请点击这里下载此文件。
补充文件2：用于PLA定量的IMARIS电池组件批次参数。请点击这里下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
尽管PLA是一种非常强大的技术，但为了获得清晰和可重复的结果，必须解决一些技术问题。抗体必须具有高亲和力和特异性。此外，尽可能减少非特异性背景信号也很重要。我们发现膜和细胞碎片有助于背景，我们已经尽可能地去除了它们。固定前用含有缓冲液的洗涤剂洗涤，固定后用甲醇洗涤有助于减少非特异性结合。需要注意的是，固定前的去垢剂处理会导致细胞脱离。我们发现，在CSK处理之前，用细胞粘合剂处理板并用0.1%FA作为前缀可以缓解这个问题。
在监测S相特异性事件时，识别非S期细胞也很有帮助。这可以通过用PCNA或NPAT24，25等细胞周期标志物进行PLA染色来完成。这些标记物不仅证实了S相现象，而且还为非特异性相互作用提供了内部生物控制。在测量S期特有的事件的测定中，G1期细胞中的阳性信号表明需要额外的努力来减少非特异性相互作用。
单细胞成像策略具有其他监测分子相互作用的方法所不具备的优势。均质化技术，例如在免疫沉淀实验中使用的技术，消除了与单个细胞中事件的任何联系。因此，失去了对细胞周期状态的影响或细胞群变异性的洞察力。但是，由于PLA报告单个细胞中的事件频率，因此可以恢复这些见解。
PLA的一个常见局限性是缺乏针对目标靶标的免疫检测试剂。在解决有关细胞对直接破坏者以外的代理引入的DNA扰动的反应的问题时，这是一个问题。我们已经通过使用免疫标记的DNA反应试剂克服了这一限制。虽然我们的研究重点是链间交联，但有许多基因毒性化合物，包括化疗药物，都适合这种方法。此外，蛋白质和DNA结构之间的相互作用，如G四链体，也可以用这种策略进行检查。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国家老龄化研究所NIH校内研究计划（Z01-AG000746-08）的部分支持。J.H.得到了中国国家自然科学基金（21708007和31871365）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
References
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
- Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
- Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
- Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
- Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
- Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
- Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
- Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
- Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
- Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
- Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
- Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
- Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
- Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
- Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
- Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
- Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
- Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
- Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
- Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
- Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).
Tags
生物学，第 173 期，重复体，阻断病变，PLA，邻近连接测定，DNA 链间交联，抗原标记交联Erratum
Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.
The Authors section was updated from:
Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally
to:
Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally
